Name: Conception et mise en œuvre dun Illuminating automatisé, la culture, et du système déchantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Apprenez à assembler un système de culture continue pour étudier les réponses optogénétiques des microbes en temps réel sur plusieurs jours. Cette méthode automatisée permet d'analyser l'expression dynamique des gènes.

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Nous tenons à remercier Molly Lazar et Verónica Delgado aide pour tester le protocole, Kieran Sweeney pour des discussions utiles et l&#39;édition, et Taylor Scott, My An-adirekkun, et Stephanie Geller pour la lecture critique du manuscrit. Megan Nicole McClean, Ph.D. est titulaire d&#39;une bourse de carrière à l&#39;interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Nous avons conçu cet appareil avec une flexibilité à l&#39;esprit. Tout le code utilisé est gratuit et open-source. Le processus d&#39;analyse d&#39;image par défaut pour les cellules de segment est simple et fonctionne rapidement. Analyse personnalisée pourrait être mis en œuvre par l&#39;enregistrement d&#39;entrée de l&#39;utilisateur lors de l&#39;analyse d&#39;une image représentative de l&#39;interface utilisateur graphique FIDJI, convertir l&#39;entrée d&#39;un script beanshell, puis définir le plugin pour appele...

Systèmes optogénétiques utilisent la lumière pour contrôler une liste croissante des processus cellulaires , y compris l&#39; expression des gènes, 1, 2, 3, 4, 5 localisation des protéines, l&#39; activité 6 de protéines, 6, 7, liaison 8 protéines, 8, 9, 10 et la dégradation des protéines. 11 Un procédé de culture de cellules dans un environnement contrôlé avec une stimulation optique programmée et pour mesurer leur réponse sur des périodes biologiquement pertinentes est nécessaire pour exploiter le potentiel de ces outils pour la recherche en biologie cellulaire et la biotechnologie. Notre procédé met à profit chemostasis pour maintenir un taux de croissance de la constante de cellule dans un endroit bien mélangé, aenominale, et le récipient de culture en verre à température contrôlée 12, 13 qui est exposé à un éclairage programmé. Nous, l&#39;image cellules individuelles dans l&#39;effluent de la culture avec un microscope inversé pour mesurer la réponse de la culture à un éclairage programmé. La mise en culture, l&#39;échantillonnage, l&#39;imagerie et l&#39;analyse d&#39;image sont entièrement automatisées de sorte que l&#39;intensité de la fluorescence et de la morphologie cellulaire de la culture cellulaire des effluents peuvent être mesurés sur plusieurs jours sans intervention de l&#39;utilisateur. Ce protocole peut être mis en oeuvre dans la plupart des laboratoires familiers avec la culture et la microscopie de cellules en croissance, et l&#39;appareil utilisé est peu coûteux et constitué de composants facilement disponibles. Un récipient de culture transparente est placée au- dessus d&#39; une matrice de diodes électroluminescentes (DEL) capables d&#39;émettre une uW / cm 2 à 10 mW / cm2 de lumière. Les microbes sont cultivées dans un récipient de culture en continu; une pompe péristaltique est utilisée pour ajouter des médias à lataux de dilution, un autre sert à retirer la culture à un taux inférieur au microscope, et la différence sort par une sortie de trop-plein. Un coussin chauffant pour maintenir la température. De l&#39;air est continuellement pompée dans le récipient de culture pour maintenir une pression positive, ainsi que pour mélanger et oxygéner la culture. À l&#39;exception de la pompe à air, l&#39;alimentation de ces dispositifs est régulée par un microcontrôleur qui reçoit également une entrée d&#39;un thermomètre et d&#39;un ordinateur connecté. La culture cellulaire effluent est pompé vers un dispositif microfluidique sur la platine d&#39;un microscope inversé. Non-fluorescent et images fluorescentes sont automatiquement acquises. Les cellules dans les images sont caractérisées par un algorithme qui permet de localiser chaque cellule en tant que région d&#39;intérêt (ROI) et mesure les propriétés de chaque ROI. Pour démontrer une application de ce protocole, nous avons mesuré la réponse à différentes intensités lumineuses des cellules Saccharomyces cerevisiae modifiées avec une responsa lumière bleueve optogenetic système qui contrôle la transcription de la protéine fluorescente. S. cerevisiae, communément connu sous le nom de levure de boulanger, a été choisi parce que plusieurs systèmes optogénétiques pour contrôler l&#39; expression génique dans ce système il existe déjà 14, 15, 16. En outre, cet organisme modèle est couramment utilisé pour les études de la biologie des systèmes 17 et en tant que châssis pour des applications biotechnologiques 18, 19, 20. Les résultats représentatifs montrent que ce protocole peut être utilisé pour contrôler la transcription d&#39;une culture pendant plusieurs jours en faisant varier les intensités lumineuses d&#39;entrée et en mesurant la production d&#39;un rapporteur fluorescent.

<table><tbody><tr><td>Manuel de labo complet</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Un manuel de labo complet, régulièrement mis à jour, est disponible dans le " Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Cela comprend également une description du moule microfluidique utilisé pour générer les résultats représentatifs.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>Le logiciel gratuit et open source permettant de visualiser et d’éditer les conceptions de circuits imprimés de type .fzz est disponible chez « http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - assemblé)</td>Microcontrôleur <td>Adafruit</td><td>50</td><td>. 1 requis.</td></tr><tr><td>Arduino Stackable Header Kit</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10007</td><td>Embases à broches femelles pour la connexion du PCB au microcontrôleur. 1 requis.</td></tr><tr><td>Fer à souder réglable 30W 110V - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>Pour effectuer des connexions électriques au circuit imprimé. 1 requis.</td></tr><tr><td>Support de fer à souder</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>Pour effectuer des raccordements électriques au circuit imprimé. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Mini bobine de soudure - 60/40 soudure à noyau de colophane au plomb 0,031" de diamètre - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>Pour effectuer les connexions électriques au circuit imprimé. 1 requis.</td></tr><tr><td>0,1 &mu ; Condensateur F</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>Stabilise la tension dans le circuit imprimé. 1 requis.</td></tr><tr><td>10 &mu ; F condensateur</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>Stabilise la tension dans le circuit imprimé. 1 requis.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG Pilote d’affichage LED matriciel/numérique - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>Pilote LED. 1 requis.</td></tr><tr><td>IC 8 broches Socket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 requis. Ceux-ci seront empilés les uns sur les autres pour soutenir le récipient de culture au-dessus de la matrice LED.</td></tr><tr><td>Prise IC 24 broches</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>en option. Utilisez-le pour fixer de manière réversible le pilote MAXIM 7219CNG au circuit imprimé.</td></tr><tr><td>Multimètre numérique</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Pour le dépannage électronique. 1 requis.</td></tr><tr><td>Embases Break Away - 40 broches mâles (longues, PTH, 0,1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Embases à broches mâles pour matrice LED connectée à la carte de circuit imprimé. Les extrémités peuvent être coupées avec des pinces coupantes. 1 jeu requis.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Coupe-fil diagonal affleurant</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Pour couper les en-têtes à broches longues et couper les câbles d’alimentation. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Fils de liaison femelle/femelle de qualité supérieure - 40 x 12" (300mm)</td><td>Adafruit</td><td>793</td><td>Ruban de fil pour connecter la plaque d’essai à la matrice LED. Peut être connecté de bout en bout avec des embases mâles pour être plus long. 1 obligatoire.</td></tr><tr><td>Planche d’essai demi-taille</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>La matrice LED se connectera à celle-ci et le récipient de culture reposera au-dessus.</td></tr><tr><td>Miniature 8x8 Bleu LED Matrice</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Source de lumière. La longueur d’onde dominante est de 470 nm (bleu). 1 obligatoire. D’autres matrices de LED miniatures du même fournisseur sont disponibles avec des longueurs d’onde dominantes : 624 nm (rouge), 588 nm (jaune), 525 nm (vert), 572 nm (jaune-vert) et blanc.</td></tr><tr><td>Embase empilable-3 broches</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 requise.</td></tr><tr><td>Kit de résistance - 1/4W (500 au total)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Pour l’électronique. 1 requis.</td></tr><tr><td>&nbsp ; IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>Interrupteur de régulation de tension pour le contrôle du courant continu. 4 requis.</td></tr><tr><td>Fil de raccordement - Assortiment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Fil pour l’électronique. 1 requis.</td></tr><tr><td>Alimentation à découpage 5V 2A (2000mA) - Homologué UL</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Alimentation pour le coussin chauffant et Arduino. 2 requis.</td></tr><tr><td>Adaptateur d’alimentation à découpage régulé 12 VDC 1000mA - homologué UL</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Pour pompes péristaltiques. 2 requis.</td></tr><tr><td>Coussin chauffant électrique - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Pour chauffer le bioréacteur. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique à faible débit et à débit variable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Pour le pompage de fluides. 1 requis</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique à débit variable à débit moyen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Pour le pompage de la culture. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Adaptateur d’alimentation à découpage régulé 9 VDC 1000mA - Homologué UL</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>Pour l’alimentation du microcontrôleur. Ordonnance 1.</td></tr><tr><td>High Temp Étanche DS18B20 Capteur de température numérique + extras</td><td>Adafruit</td><td>642</td><td>Thermomètre pour le bioréacteur. 1 requis.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager NA</td><td></td><td>Le logiciel de contrôle de microscope gratuit et open source est disponible à l’adresse « https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>Le logiciel d’analyse d’images gratuit et open source est disponible à l’adresse « http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Environnement de développement intégré Arduino</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>L’IDE gratuit et open-source est disponible à l’adresse « https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Code personnalisé</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Le code de microcontrôleur personnalisé et le plugin « Bioreactor Controller » sont disponibles dans le » Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Câble USB A à B - 6 pieds SparkFun</td><td>Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Utilisé pour télécharger des données sur le microcontrôleur. 1 requis.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>L’avantage de charger les valeurs de matrice de LED à partir d’un fichier CSV est qu’un programme peut être appelé par le plug-in pour mettre à jour ces valeurs en fonction des résultats de l’analyse d’image, et ces valeurs peuvent être rechargées sur le microcontrôleur, ce qui permet le contrôle par rétroaction. Il est disponible auprès du " Limes de chimiostat optogénétique" Référentiel GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Gels Tota-frost (papier de diffusion)</td><td>B& H</td><td>B& H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>Pour matrice LED. 1 Requis.</td></tr><tr><td>Feuille de kit Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Mousse noire pour l’enceinte de la cuve de culture. 4 requis.</td></tr><tr><td>Capteur de puissance à photodiode standard, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp ;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Pour mesurer l’intensité lumineuse. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Ruban d’étiquetage</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Pour l’étiquetage et la sécurisation des composants en vrac. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Console compacte de mesure de puissance et d’énergie, numérique LCD 4"</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Pour la mesure de l’intensité lumineuse. 1 requis.</td></tr><tr><td>Bouteille en verre d’hybridation GL45 de 100 ml</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Cuve du bioréacteur. 1 requise.</td></tr><tr><td>Assemblage à six ports</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Personnalisé&nbsp ;</td><td>Pour la cuve du bioréacteur. Spécifications du tube : .125 « OD x .055 » ID. Port A : 1,0 « de long au-dessus de la limace du capuchon et au bas du tube. Orifices B, C, E, F : 1,0 po de long au-dessus de la limace du capuchon, 33 mm de long en dessous. Orifice D : 1,0" de long au-dessus de la limace du capuchon, 65 mm ; long en dessous. 1 obligatoire. Comprend un bouchon à vis en polypropylène de 45 mm de diamètre et un joint en silicone blanc pour assurer une étanchéité parfaite entre le bouchon et le récipient.</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 pouces, paquet de 3</td><td>B0009F3P3U</td><td></td><td>ruban écossais transparent. Ceci est disponible auprès de nombreux autres fournisseurs. Il est utilisé pour couvrir les marquages sur la cuve d’élevage et pour fixer le verre de protection avec le canal PDMS au cadre de support en aluminium.</td></tr><tr><td>1/16 « ID x 3/16 » OD x 1/16 » Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>États-Unis Plastic Corp.</td><td>57288</td><td>Tube. ~25' requis.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit bouchon en caoutchouc blanc, taille 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Bouchon de flacon de média et bouchon de flacon d’effluent. 2 requis.</td></tr><tr><td>Fiole de laboratoire 2L</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Fiole de milieu et fiole d’effluent. 2 nécessaires.</td></tr><tr><td>Robinet de jour</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Pour pincer les tubes, fermer. 3 requis.</td></tr><tr><td>Ensemble de tubulure de remplacement 1/16" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3372</td><td>Les pompes péristaltiques sont livrées avec un ensemble de tubes, mais ils s’usent après des semaines d’utilisation.</td></tr><tr><td>Ensemble de tubulure de remplacement 1/50" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3371</td><td>Les pompes péristaltiques sont livrées avec un ensemble de tubes, mais ils s’usent après des semaines d’utilisation.</td></tr><tr><td>Luer mâle avec anneau de verrouillage x 1/16" cannelé de tuyau, Nylon, 25/pqt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Connecteurs. ~10 luers sont nécessaires.</td></tr><tr><td>Luer mâle avec anneau de verrouillage x cannelé de tuyau 1/8", Nylon, 25/pqt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Connecteurs. 5 requis, un pour chaque trou de bouchon en caoutchouc à remplir avec le tube.</td></tr><tr><td>Luer femelle x 1/16" adaptateur de tuyau cannelé, Nylon, 25/pqt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Connecteurs. ~10 luers requis.</td></tr><tr><td>Luer femelle x 3/16" adaptateur de tuyau cannelé</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Connecteurs. ~10 luers requis.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessoire, Capuchon Luer femelle, Nylon, 25/pqt</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Accessoire, Mâle Luer Lock, Nylon, 25/pqt</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Tube en PTFE microbore, 0,022 po ID x 0,042 po OD, 100 pi/rouleau</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Tube. 1 rouleau requis.</td></tr><tr><td>Tube en silicone durci au platine Masterflex, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Tube. ~25' requis.</td></tr><tr><td>3/16 « ID x 1/4 » OD x 1/32 » Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>États-Unis Plastic Corp.</td><td>57293</td><td>Tube. ~1' requis.</td></tr><tr><td>Filtre à vide</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107 Filtre à</td><td>vide Nalgene pour média filtrant stérile.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Pompe à air à débit réglable à double diaphram pour l’aération et le mélange de fluides. 1 requis.&nbsp ;</td></tr><tr><td>0,2 &mu ; Filtre à seringue Corning</td><td>International</td><td>431229</td><td>Cela garantit que l’air de la pompe d’aquarium ne contamine pas l’appareil. 1 Nécessaire.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Pour dispositif microfluidique. 1 requis.</td></tr><tr><td>Rasoir de sécurité américain GEM Scientific Lames de rasoir à un seul tranchant</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Pour couper des tubes et des PDMS. 1 lame requise.</td></tr><tr><td>Perforateur Harris Uni-Core 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Pour l’entrée/sortie de poinçonnage dans un dispositif microfluidique. 1 requis.</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Pour dispositif microfluidique. 1 nécessaire.</td></tr><tr><td>Cadre rectangulaire en aluminium avec une fenêtre carrée</td><td>Personnalisé</td><td>Sur mesure</td><td>Pour soutenir le canal microfluidique. Dimensions extérieures : 3 pouces x 1,25 pouces. Dimensions intérieures (partie découpée) : 7/8 pouces x 7/8 pouces Épaisseur : ~1/32 pouces</td></tr></tbody></table>

conception et mise en œuvre d&#39;un illuminating automatisé, la culture, et du système d&#39;échantillonnage pour microbial optogénétiques applications

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

systèmes optogénétiques utilisent des protéines génétiquement codés qui changent de conformation en réponse à des longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière pour modifier les processus cellulaires. Il existe un besoin pour la culture et la mesure de systèmes comprenant un éclairage programmé et la stimulation des systèmes optogénétiques. Nous présentons un protocole pour la construction et l&#39;utilisation d&#39;un appareil de culture en continu pour éclairer des cellules microbiennes avec des doses programmées de lumière, et automatiquement d&#39;acquérir et analyser des images de cellules dans l&#39;effluent. Le fonctionnement de cet appareil permet chémostat le taux de croissance et l&#39;environnement cellulaire à être étroitement contrôlés. L&#39;effluent de la culture cellulaire continue est régulièrement prélevé et les cellules sont imagées par microscopie à canaux multiples. La mise en culture, l&#39;échantillonnage, l&#39;imagerie et l&#39;analyse d&#39;image sont entièrement automatisées de sorte que les réponses dynamiques de l&#39;intensité de fluorescence et de la morphologie cellulaire des cellules prélevées à partir de l&#39;effluent de la culture sont mesurés sur plusieurs jourssans intervention de l&#39;utilisateur. Nous démontrons l&#39;utilité de cet appareil de culture en induisant de façon dynamique la production de protéines dans une souche de Saccharomyces cerevisiae conçu avec un système de optogenetic qui active la transcription.

Cet appareil a été utilisé pour stimuler une culture de S. cerevisiae exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) en réponse à la lumière bleue par l' intermédiaire d' un système de transcription optogenetic inductible basé sur la protéine paire 30 CRY2 / de CIB1. Les cellules ont été cultivées en chemostat dans des milieux de phosphate limité à un taux de dilution de 0,2 ± moyenne de 0,008. Limitation de phosphate est couramment utilisé dans S.</e...

Nous avons conçu un appareil de culture en continu destiné à être utilisé avec des systèmes optogénétiques pour éclairer les cultures de micro-organismes et cellules d&#39;image régulièrement dans l&#39;effluent avec un microscope inversé. La culture, l&#39;échantillonnage, l&#39;imagerie et l&#39;analyse d&#39;images sont entièrement automatisées afin que les réponses dynamiques à l&#39;éclairage peuvent être mesurés sur plusieurs jours.

Conception et mise en œuvre d&#39;un Illuminating automatisé, la culture, et du système d&#39;échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

L’objectif global de cette procédure est d’assembler un récipient de culture continu, dans lequel la réponse à l’éclairage des microbes optogénétiques peut être mesurée avec un microscope automatiquement en temps réel et sur plusieurs jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et en ingénierie métabolique, telles que la façon dont l’expression dynamique des gènes peut susciter des réponses différentes de l’expression statique des gènes. Le principal avantage de cette méthode est que la culture continue permet de collecter des mesures pendant plusieurs jours.Pour commencer, soudez la ligne de terre, la ligne de données et la ligne de tension positive du thermomètre numérique à la carte de circuit imprimé. Coupez une goupille d’un en-tête femelle à trois broches et coupez les deux goupilles restantes. Soudez-le dans la paire de trous étiquetés R2 et connectez les deux broches soudées en insérant une résistance de 4,7 kilo ohms dans l’en-tête de la broche.Connectez ensuite les composants restants à la carte de circuit imprimé. Superposez la carte de circuit imprimé sur le microcontrôleur. Installez le boîtier étanche à la lumière et installe

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Conception et mise en œuvre dun Illuminating automatisé, la culture, et du système déchantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications (Vidéo) | JoVE Journal

Conception et mise en œuvre d'un Illuminating automatisé, la culture, et du système d'échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

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