Conception et mise en œuvre d'un Illuminating automatisé, la culture, et du système d'échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

L’objectif global de cette procédure est d’assembler un récipient de culture continu, dans lequel la réponse à l’éclairage des microbes optogénétiques peut être mesurée avec un microscope automatiquement en temps réel et sur plusieurs jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et en ingénierie métabolique, telles que la façon dont l’expression dynamique des gènes peut susciter des réponses différentes de l’expression statique des gènes. Le principal avantage de cette méthode est que la culture continue permet de collecter des mesures pendant plusieurs jours.

Pour commencer, soudez la ligne de terre, la ligne de données et la ligne de tension positive du thermomètre numérique à la carte de circuit imprimé. Coupez une goupille d’un en-tête femelle à trois broches et coupez les deux goupilles restantes. Soudez-le dans la paire de trous étiquetés R2 et connectez les deux broches soudées en insérant une résistance de 4,7 kilo ohms dans l’en-tête de la broche.

Connectez ensuite les composants restants à la carte de circuit imprimé. Superposez la carte de circuit imprimé sur le microcontrôleur. Installez le boîtier étanche à la lumière et installez tous les logiciels comme décrit dans le protocole texte ci-joint.

Tout d’abord, placez l’extrémité longue de l’orifice en aluminium à travers le joint d’étanchéité dans le récipient de culture et vissez le bouchon. Couvrez une courte sortie de port en aluminium avec un tube en silicone de diamètre moyen. Bouchez l’extrémité de la distillation en insérant un bouchon Luer Lock femelle, puis en connectant un bouchon Luer Lock mâle.

Cette prise est supplémentaire et ne sera pas utilisée. Connectez deux courts segments de tube en silicone de diamètre moyen avec des verrous Luer mâles et femelles. Connectez ensuite une extrémité à une courte sortie de port en aluminium et bouchez l’extrémité de la distillation.

Le récipient sera inoculé à travers ce tube. Ensuite, connectez deux tubes moyens aux extrémités du tube péristaltique de diamètre moyen et des connecteurs. Connectez une extrémité à un port court en aluminium et branchez l’autre.

Plus tard, celui-ci sera connecté à la fiole du support. Connectez un tube en silicone de diamètre moyen au port en aluminium le plus long. Le tube doit être suffisamment long pour atteindre la fiole du support.

Connectez un autre segment court de quelques centimètres de long jusqu’à l’extrémité, puis insérez-le dans le bouchon en caoutchouc de la fiole de support. Clamp le tube. Lorsqu’elle est ensuite déserrée, cette connexion permet à la culture d’être mélangée, aérée et maintenue à une pression positive par les bulles entrantes.

Insérer un tube de diamètre moyen suffisamment long pour atteindre le fond du ballon dans le bouchon à travers lequel le milieu sera transféré. Connectez un autre tube de diamètre moyen à celui-ci, puis un tube de diamètre large à l’extrémité. Bouchez l’extrémité de la distillation.

Remplissez le troisième trou du bouchon avec un court segment de tube de diamètre moyen, relié à deux autres segments de tube de diamètre moyen, et bouché à l’extrémité de la distillation. Celui-ci sera connecté à une pompe à vide, puis à une pompe d’aquarium. Insérez un Luer Lock mâle dans un segment de tube en silicone de diamètre étroit, puis insérez fermement un tube en PTFE.

Fixez ensuite un Luer Lock femelle à un tube de diamètre moyen. Enfilez le verrou femelle le long du tube en PTFE pour connecter les verrous et l’autre à un court port en aluminium. Assurez-vous que le tube en PTFE à l’intérieur de la cuve de culture pend sous le deuxième tube d’aluminium le plus long et au-dessus du fond.

Coupez au besoin. À partir de là, le support sera échantillonné vers le canal d’imagerie, et le tube étroit minimise le volume intermédiaire. Ensuite, connectez le tube de silicone étroit exposé au tube péristaltique étroit et aux connecteurs.

À cela se connectent trois segments de tubes de diamètre étroit et deux segments de tubes en PTFE, en les alternant. Raccordez-le à la fiole d’effluent, à l’aide d’un tube de diamètre moyen. Connectez ensuite une extrémité d’un tube en silicone de diamètre moyen au deuxième tube le plus long de l’orifice en aluminium à l’autre extrémité de la fiole d’effluent.

Ce tube d’aluminium règle le volume de la culture, et l’excès de culture déborde dans le récipient de l’effluent. Enveloppez les couvercles du ballon avec du papier d’aluminium, puis autoclavez l’ensemble pendant 30 minutes à 121 degrés Celsius et 15 PSI. Fixez le filtre à vide à une bouteille de 100 millilitres.

Retirez le couvercle du mamelon, puis retirez le bouchon blanc de la mamelon du filtre de l’aspirateur à l’aide d’une pince à épiler stérile. Connectez le large tube en silicone à la tétine, l’autre tube libre de la fiole à une pompe à vide, et assurez-vous que le troisième tube reliant la fiole à la cuve de culture est bien fermé. Remplissez le filtre avec le média, allumez la pompe à vide, puis filtrez le reste du média.

Clampez le tube en silicone moyen connecté à l’aspirateur et éteignez la pompe à vide. Retirez les luers du segment intermédiaire du tube en silicone moyen connecté à la pompe à vide et insérez l’extrémité bleue d’un filtre à air stérile pour seringue dans ce tube. Fixez ensuite le large tube en silicone et déconnectez le luer mâle de celui-ci.

Débranchez la fiche du luer femelle du tube d’entrée du milieu de la cuve d’élevage. Connectez ces luers pour permettre au milieu d’être pompé dans le récipient d’élevage. Ensuite, retirez le filtre de la bouteille de 100 millilitres et fixez le bouchon de la bouteille.

Utilisez ce milieu pour préparer une culture de démarrage. Placer l’ensemble d’élevage continu près d’un microscope avec le ballon du milieu plus haut que la cuve d’élevage et le ballon d’effluent plus bas que la cuve d’élevage pour éviter le reflux. Fixez solidement les bouchons en caoutchouc sur le support et les flacons d’effluent.

Ensuite, débranchez les extrémités du tube PTFE de l’étroit tube en silicone qui les relie et branchez ces extrémités dans l’entrée et la sortie d’un dispositif microfluidique préparé. Poussez ensuite le média dans le récipient d’élevage, en connectant l’extrémité blanche du filtre à air de la seringue à la pompe de l’aquarium. Lorsque le fluide atteint le niveau de l’orifice d’effluent, enroulez le tube d’entrée du fluide et les connecteurs autour de la pompe péristaltique lente, ainsi que le tube et les connecteurs étroits de sortie de l’échantillon autour de la pompe péristaltique rapide.

Aérer le milieu en desserrant le tube d’air entre le ballon et la cuve d’élevage. Ensuite, collez le coussin chauffant et le thermomètre sur le récipient de culture afin que sa température puisse être contrôlée. Enroulez le tube du milieu autour de la cuve de culture, de sorte que le milieu entrant soit à la même température que la cuve.

Insérez ensuite le récipient de culture dans le boîtier en mousse noire sur la matrice LED et assurez-vous que les tubes ne sont pas pincés. Utilisez le plug-in du contrôleur de bioréacteur pour mettre la pompe à fluide lent en marche pendant un dixième de toutes les 30 secondes. Le débit sera très faible, mais supérieur au taux d’évaporation.

Fixez le tube d’air entrant entre le ballon de milieu et la cuve de culture. À l’aide d’une pipette, inoculez le récipient de culture avec un millilitre provenant d’une culture de démarrage. Serrez ensuite l’extrémité distillatrice de ce tube et défixez le tube d’air.

Laissez la culture se développer du jour au lendemain. Couvrez le boîtier de manière à ce qu’aucune lumière n’y pénètre. Le lendemain, utilisez le plug-in du contrôleur de bioréacteur pour régler les pompes péristaltiques pour qu’elles tournent pendant une plus grande partie du temps, correspondant au fluide et aux débits d’échantillonnage souhaités.

Laissez la densité de culture s’équilibrer pendant la nuit. Le lendemain, remplissez la liste des positions de la scène et le gestionnaire de micro avec un ensemble de positions non chevauchantes où les cellules pompées dans le canal microfluidique seront dans le plan focal. Ouvrez ensuite le plugin de contrôleur de bioréacteur.

Sélectionnez la matrice de voyants souhaitée, les canaux d’imagerie et d’autres paramètres expérimentaux à partir des invites, puis commencez à collecter des données. Cet appareil a été utilisé pour stimuler une culture de saccharomyces cerevisiae, exprimant une protéine fluorescente jaune en réponse à la lumière bleue via un système de transcription optogénétique inductible. Des images de contraste de base et fluorescentes du canal microfluidique ont été acquises.

Les contours des cellules ont été identifiés à partir des images en contraste de phase, cartographiés sur les images fluorescentes, et les images fluorescentes ont été enregistrées en temps réel. La carte thermique montre ici la distribution de fluorescence d’une culture due à la production de protéines fluorescentes jaunes lors de l’activation du système optogénétique. La fluorescence d’environ 170 000 cellules a été analysée à partir de plus de 30 000 images, acquises à partir de 28 positions de scène pendant 70 heures.

Au cours de cette étude, la culture a été exposée à des intensités variables de lumière bleue pendant six heures d’intervalle, suivies de six heures d’obscurité totale. Les cellules avaient été exposées à la lumière avant la première mesure, c’est pourquoi son intensité de fluorescence diminue pendant la première période d’obscurité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures, sur une période de trois jours, si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est très important d’utiliser une technique stérile. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme le contrôle de rétroaction en temps réel, peuvent être utilisées pour contrôler la concentration en protéines. Cette technique permettra d’étudier dynamiquement des organismes dotés de constructions optogénétiques, sur de plus longues périodes, plus longtemps que ce qui est possible avec des plaques ou une culture par lots.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’intégrer un appareil de culture en continu, une lumière et un microscope, pour stimuler et étudier les microbes optogénétiques.