Rapid Neuronal Différenciation des Induced cellules souches pluripotentes pour mesurer l'activité réseau sur Arrays Micro-électrode

Nous modifions et mettre en œuvre un protocole précédemment publié décrivant la différenciation rapide, reproductible et efficace des humains induite par cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) dans les neurones corticaux excitateurs ^12. Plus précisément, notre modification permet un contrôle de la densité des cellules neuronales et l'utilisation sur des réseaux de micro-électrodes pour mesurer les propriétés électrophysiologiques au niveau du réseau.

L’objectif global de ce protocole de différenciation neuronale est de générer des réseaux neuronaux à partir des cellules souches pluripotentes induites par l’homme qui se développent sur des réseaux de microélectrodes de manière rapide et contrôlée. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences. Il peut être utilisé pour étudier les mécanismes biologiques sous-jacents aux troubles neurologiques, mais il peut également être utilisé pour répondre à des questions neurobiologiques plus fondamentales.

Le principal avantage de cette technique est la différenciation rapide des cellules souches pluripotentes induites en neurones de manière contrôlée. Le premier jour, DMEM/F12, CDS et E8 chauds avec 1 % de pénicilline streptomycine à température ambiante. Ensuite, ajoutez de la doxycycline au milieu E8 pour obtenir une concentration finale de quatre microgrammes par millilitre, puis ajoutez un inhibiteur de roche au mélange.

Aspirez le milieu usé de la RTTANGN2 hiPSC positifs et ajoutez un millilitre de CDS aux cellules. Par la suite, incubez les cellules pendant trois à cinq minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. Au microscope, vérifiez si les cellules se détachent les unes des autres.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMEM/F12 dans le puits. Suspendez doucement les cellules à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, puis transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez sept millilitres de DMEM/F12 à la suspension cellulaire et faites tourner les cellules à 200 x g pendant cinq minutes.

Au bout de cinq minutes, aspirez le surnageant et ajoutez deux millilitres du milieu E8 préparé. Dissociez les hiPSC en plaçant l’extrémité d’une pipette de 1 000 microlitres contre le côté du tube de 15 millilitres et en remettant doucement les cellules en suspension. Au microscope, vérifiez si les cellules sont dissociées.

Ensuite, déterminez le nombre de cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les AEM à six puits, diluer les cellules pour obtenir une suspension cellulaire de 7,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Pour les lamelles, diluez les cellules pour obtenir une suspension cellulaire de quatre fois 10 à la quatrième cellule par millilitre.

Aspirer la laminine diluée des lamelles de recouvrement et des six AEM de puits. Pour les MEA à six puits, plaquez les cellules en ajoutant 100 microlitres de suspension cellulaire à la zone de l’électrode active dans chaque puits. Ensuite, plaquez les cellules en ajoutant 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 24 puits.

Ensuite, placez les six MEA de puits ou la plaque de 24 puits dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. Après deux heures, ajoutez soigneusement 500 microlitres du milieu E8 préparé dans chaque puits des six MEA de puits. Par la suite, placez les six AEM bien placés pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius.

Le troisième jour, réchauffez 0,05 % de trypsine-EDTA à température ambiante. DPBS et DMEM/F12 chauds avec 1 % de pénicilline streptomycine à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez le milieu épuisé de la culture d’astrocytes de rat.

Lavez la culture en ajoutant cinq millilitres de DPBS et agitez-la doucement. Ensuite, aspirez le DPBS et ajoutez cinq millilitres de 0,05 % de trypsine-EDTA. Agitez doucement la trypsine-EDTA.

Ensuite, incubez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. Par la suite, vérifiez au microscope si les cellules sont détachées. Détachez les dernières cellules en frappant la fiole à quelques reprises.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DMEM/F12 dans la fiole. Essayez d’évaluer doucement les cellules à l’intérieur du ballon à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Ensuite, collectez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Faites tourner le tube à 200 x g pendant huit minutes. Après cela, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de DMEM/F12. Déterminez le nombre de cellules par millilitre à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, ajoutez 7,5 fois 10 au quatrième astrocyte à chaque puits des six MEA de puits. Et ajoutez deux fois 10 au quatrième astrocytes à chaque puits de la plaque à 24 puits. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius.

Acquérez les données à 1 200 fois l’amplification et échantillonnez le signal à 10 kilohertz à l’aide de la carte d’acquisition de données MCS. Enregistrer 20 minutes d’activité électrophysiologique de neurones dérivés de hiPSC cultivés sur des MEA. Pendant l’enregistrement, maintenez la température à 37 degrés Celsius et empêchez l’évaporation du fluide et les changements de pH en délivrant un flux lent et constant de gaz humidifié sur les MEA.

Après cela, analysez les données à l’aide d’un paquet logiciel personnalisé. Cette figure montre les changements d’expression des marqueurs neuronaux MAP2 dans la synapsine au cours du processus de différenciation, ce qui indique la maturation neuronale. Ce graphique montre que l’expression de la synapsine est mesurée pour les cellules individuelles augmentées au cours du processus de différenciation.

La synapsine qui est exprimée dans les cellules après trois semaines de différenciation co-localisée avec la PSD-95, indiquant la présence de synapses fonctionnelles. Ici, le patch clamp de cellules entières a été effectué à différents moments du processus de différenciation pour mesurer l’activité électrophysiologique des cellules. Les cellules ont été capables de générer des potentiels d’action à différents points temporels.

Et le pourcentage de cellules dopées augmentant au fil du temps montre que la majorité des cellules sont capables de générer des potentiels d’action, même au stade précoce de la différenciation. Patch clamp a également été utilisé pour mesurer les courants postsynaptiques excitateurs reçus par les cellules. Le nombre d’entrées que les cellules reçoivent a augmenté au cours du processus de différenciation.

La fréquence et l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs ont augmenté au cours du processus de différenciation. L’activité électrophysiologique des cellules différenciées sur des réseaux de microélectrodes a été mesurée pendant le processus de différenciation. Ici, l’activité du réseau neuronal a augmenté au cours du processus de différenciation et a montré des événements synchrones après 23 jours.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour différencier les cellules souches pluripotentes induites en réseaux neuronaux fonctionnels en trois à quatre semaines. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler stérilement et de traiter les cellules en douceur. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests pharmacologiques peuvent être utilisées pour sauver le phénotype, observé dans les lignées cellulaires des patients.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour étudier officiellement les défauts d’activité du réseau dans les troubles neurologiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de différencier, d’induire des cellules souches pluripotentes dans les neurones de manière rapide et contrôlée.