Analyse spatiale et temporelle d'Active ERK dans le C. elegans germinale

L’objectif global de cette expérience est d’analyser les niveaux actifs d’ERK in vivo dans les gonades de C. elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation ERK et des cellules germinales, telles que les effets des traitements médicamenteux ou des perturbations génétiques sur la voie RAS-ERK et donc le développement des cellules germinales. Le principal avantage de cette technique est que le modèle et l’intensité du signal ERK peuvent être quantifiés in vivo.

Choisissez 100 à 150 vers au stade de développement souhaité et collectez-les dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de tampon M9. Ensuite, remplissez le tube de microcentrifugation avec 900 microlitres supplémentaires de tampon M9 et centrifugez-le à 1000 fois g pendant une minute à température ambiante. Sous un microscope à dissection, retirez délicatement 900 microlitres du tampon M9.

Ensuite, répétez le lavage deux fois de plus pour éliminer la plupart des bactéries attachées. Ensuite, à l’aide d’une pointe de micropipette de 200 microlitres avec une perce à extrémité large, transférez les vers dans 100 microlitres de tampon M9 dans un plat de montre en verre à fond plat. Ensuite, ajoutez un à trois microlitres de lévamisole 0,1 molaire dans le plat et remuez-le doucement.

Maintenant, attachez deux aiguilles de calibre 25 à deux seringues pour fabriquer un outil de dissection pour chaque main. À l’aide d’un microscope à dissection, placez chaque aiguille sous et au-dessus de chaque ver et faites une coupe fine sur chaque ver près du deuxième bulbe pharyngé, à l’aide d’un mouvement de ciseaux. Coupez tous les animaux au moins une fois, le tout en cinq minutes, pour que le lévamisole reste efficace.

Il est très important que la dissection des animaux dans le plat soit terminée en moins de cinq minutes. Dans le cas où une gonade extrudée n’est pas visible, sautez simplement cet animal. Des gonades extrudées appropriées sont visibles ici.

Une fois la dissection terminée, ajoutez sous une hotte deux millilitres de paraformaldéhyde à 3 % directement dans le plat de montre en verre et couvrez-le de Parafilm. Ensuite, attendez dix minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre de neuf pouces, ajoutez trois millilitres de PBS-T dans le verre de la montre et mélangez la solution à l’aide de la pipette.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre neuve, prélevez les cinq millilitres de liquide contenant les vers et transférez-les dans un tube conique en verre frais de cinq millilitres. Ensuite, centrifugez le tube pendant 30 secondes dans une centrifugeuse clinique à 1000 g. Maintenant, sous un microscope à dissection, retirez et jetez le surnageant sans perturber les tissus disséqués.

Ensuite, à l’aide de cinq millilitres d’aliquotes de PBS-T, répétez l’étape de lavage deux fois de plus et terminez avec les vers dans un petit volume de solution. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, ajoutez deux millilitres de 100 % de méthanol et mélangez doucement les tissus en les tirant de haut en bas avec une pipette Pasteur fraîche. Maintenant, incubez le tube à moins 20 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Après le traitement au méthanol, effectuez trois lavages PBS-T et terminez avec environ 500 microlitres de PBS-T. Maintenant, à l’aide d’une pipette Pasteur fraîche, transférez les tissus dans un nouveau tube en verre d’un millilitre et laissez-les se déposer par gravité. Après cinq à 10 minutes, utilisez une pipette neuve et l’aide d’un microscope pour retirer autant de lavage que possible du tube sans déranger les tissus.

Pour démarrer le blocage, ajoutez 100 microlitres de sérum de chèvre normal à 30 %, qui est le tampon de blocage. Ensuite, couvrez le tube de Parafilm et laissez-le reposer à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, à l’aide d’un microscope, retirez autant de liquide que possible à l’aide d’une pipette neuve.

Ensuite, faites 100 microlitres d’anticorps MAPKYT dilués à raison d’un sur 400 dans 30 % NGS et ajoutez-le aux tissus. Ensuite, scellez le tube avec du Parafilm et incubez-le toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, réchauffez les tubes à température ambiante et ajoutez 800 microlitres de PBS-T.

Ensuite, aspirez l’échantillon dans une pipette en verre frais et relâchez-les doucement pour obtenir une suspension uniforme. Une fois que les mouchoirs se sont déposés au fond, retirez soigneusement le surnageant et répétez le lavage trois fois au total, toujours à l’aide d’une pipette neuve et sans jamais utiliser de vortex. L’anticorps secondaire est appliqué tout comme l’anticorps primaire, mais une attention supplémentaire est accordée au maintien des tissus dans l’obscurité à partir de maintenant jusqu’à ce qu’ils puissent être imagés.

Après l’incubation avec l’anticorps secondaire, ajoutez 800 microlitres de la solution DAPI diluée dans les tissus une fois le dernier lavage retiré. Couvrez l’embouchure du tube avec du Parafilm et incubez-le à température ambiante pendant 20 minutes. Plus tard, sous un microscope de dissection, prélevez la plus grande partie possible de la solution DAPI à l’aide d’une pipette neuve.

Après avoir enlevé la dernière tache ou lavé, ajoutez une goutte de solution de montage dans les tubes. Maintenant, préparez une diapositive de montage avec un tampon d’agarose. Ajoutez une goutte d’agarose fondu à 2 % sur une lame de verre propre et placez rapidement une deuxième lame propre perpendiculairement à l’agarose et sur celle-ci.

Enfin, retirez très délicatement la lame de microscope supérieure. Maintenant, transférez les animaux disséqués sur le tampon et retirez tout l’excès de liquide du tampon à l’aide d’un microscope. Enfin, appliquez une lamelle de 24 x 50 millimètres sans former de bulles d’air.

Une fois le couvercle appliqué, n’appliquez aucune pression supplémentaire. Cela entraîne souvent une perte de signal. Des images représentatives d’animaux hermaphrodites adultes de type sauvage ont révélé que la forme active diphosphorylée d’ERK est généralement visualisée dans la région du pachytène moyen, zone 1, et dans les ovocytes les plus matures de la zone 2.

Les perturbations dans ce modèle d’activation reflètent des changements dans la voie de signalisation. Les lignées germinales femelles ne spécifient pas de spermatozoïdes et ne présentent donc pas d’activation de ERK dans la zone 2, avec seulement une faible activation dans la zone 1. Une fois maîtrisée, cette technique peut prendre au plus deux jours, le premier jour prenant le plus de temps, avec une heure, si elle est exécutée correctement.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’ARN poisson peuvent être utilisées pour quantifier des choses, telles que le niveau de transcription de l’ARN, en plus des informations sur l’abondance des protéines. Après son développement en 1995, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement des cellules germinales pour mesurer les niveaux d’abondance des protéines in vivo et suivre la morphologie des chromosomes chez C. elegans.