Un protocole pour l'utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

L’objectif global de cette procédure est de déterminer les forces exercées sur l’agent de liaison du cytosquelette nucléosquelette, ou complexe LINC, par microscopie FRET dans des cellules vivantes via un biocapteur conçu pour la protéine du complexe LINC, nesprin-2G. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanotransduction, telles que les forces exercées sur les protéines dans le noyau des cellules vivantes et la façon dont ces forces changent dans des conditions variantes. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à mesurer de très faibles niveaux de force sur les protéines et les cellules vivantes.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à capturer des images. Il est difficile d’optimiser la puissance et le gain du laser du microscope pour recevoir un bon signal entre tous les groupes expérimentaux. Pour commencer, cultivez des cellules de sablage de fibres NIH 3T3 à une confluence comprise entre 70 % et 90 % dans une boîte de culture cellulaire à six puits dans un incubateur de culture cellulaire standard avec régulation de la température et du CO2.

Dans une hotte de culture cellulaire, retirez le milieu et rincez chaque puits avec environ 1 millilitre d’un milieu cellulaire sérique réduit. Ajoutez 800 microlitres de milieu cellulaire sérique réduit dans chaque puits et placez la chambre à six puits dans l’incubateur. Ensuite, pipetez 700 microlitres de milieu cellulaire sérique réduit dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté L avec 35 microlitres de solution de transport lipidique pour former le mélange lipo.

Mélanger la suspension par pipetage. Ensuite, pipetez 100 microlitres du milieu à cellules sériques réduites dans chacun des six tubes de 1,5 millilitre étiquetés de un à six. Pipetez l’ADN plasmatique du capteur de tension nesprin, du contrôle de force zéro sans tête nesprin , du mTFP1 et de Vénus dans les tubes un à six, comme décrit dans le protocole de texte.

Ne réutilisez pas les pointes de pipette lorsque vous pipetez différents types d’ADN. Ensuite, pipetez 100 microlitres du mélange lipo du tube L dans chaque tube étiqueté, et mélangez par pipetage répété, à l’aide d’une pipette propre pour chaque tube. Incuber la suspension pendant 10 à 20 minutes.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chaque tube étiqueté dans un puits de la chambre à six puits préparée contenant des cellules. Étiquetez le haut de chaque puits avec l’ADN correspondant ajouté. Ensuite, placez la chambre à six puits dans un incubateur pendant quatre à six heures.

Après l’incubation, aspirez le milieu et ajoutez un à deux millilitres de milieu à cellules sériques réduites pour rincer. Aspirez le milieu cellulaire sérique réduit et ajoutez deux millilitres de trypsine dans chaque puits avant de placer la boîte à six puits dans l’incubateur pendant cinq à 15 minutes. Pendant que les cellules se détachent dans l’incubateur, enduisez six boîtes d’observation à fond de verre d’une couche de fibronectine à une concentration de 20 microgrammes par millilitre dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate.

Laissez les plats recouvrir la surface dans la hotte de culture cellulaire. Neutralisez la trypsine en ajoutant deux millilitres de DMEM une fois les cellules détachées. Ensuite, transférez le contenu de chaque puits dans un tube à centrifuger de 15 millilitres étiqueté et tournez à 90 fois g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à rotor oscillant.

Aspirez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans 1 000 microlitres de DMEM à l’aide d’une pipette. Aspirez le mélange de fibronectine des boîtes en verre et pipetez 1 000 microlitres de chaque suspension cellulaire sur les boîtes. Une fois que les cellules se sont déposées au fond des plats en verre, ajoutez un autre millilitre de média dans chaque puits.

Laissez les cellules se fixer et exprimer le capteur dans l’incubateur de cellules pendant au moins 18 à 24 heures. Pour vérifier l’efficacité de la transfection, utilisez un microscope fluorescent équipé d’une fréquence d’excitation proche de 462 nanomètres pour mTFP1, ou 525 nanomètres pour Vénus. Utilisez un filtre d’émission centré à près de 492 nanomètres pour mTFP1, ou 525 nanomètres pour Vénus.

Environ 18 à 24 heures après la fin de la transfection, utilisez un microscope à fluorescence inversée pour examiner l’efficacité de la transfection en comparant le nombre de cellules fluorescentes au nombre total de cellules visibles. Si les cellules vivantes ne peuvent pas être imagées dans les 48 heures suivant la transfection, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes. Laisser les cellules exprimer le capteur pendant 24 à 48 heures avant la fixation.

Stockez les cellules dans PBS et visualisez-les après 48 heures. Dans une hotte de culture cellulaire, remplacer le milieu cellulaire par un milieu d’imagerie complété par 10 % de sérum de veau fœtal. Placez les paraboles dans une platine de microscope confocal à température contrôlée.

Placez la parabole en verre avec les cellules transfectées mTFP1 sur l’objectif à huile à un grossissement de 60X avec une ouverture numérique de 1,4. Localisez les cellules exprimant mTFP1 en mode fluorescent à champ large. Avec une cellule fluorescente dans le champ de vision, sélectionnez le mode de détection spectrale et capturez l’image spectrale.

Incluez toutes les fréquences au-delà de 458 nanomètres en utilisant des incréments de 10 nanomètres. Sélectionnez une région fluorescente brillante sur la cellule. Ajoutez la moyenne du retour d’intérêt fluorescent en tant qu’intensité normalisée à la base de données spectrale en cliquant sur Enregistrer les spectres dans la base de données.

Optimiser la puissance et le gain laser de manière à obtenir un bon rapport signal/bruit. Les paramètres varient selon l’équipement. Répétez le processus pour les cellules exprimant Vénus et restez en mode spectral.

Utilisez une fréquence d’excitation de 488 nanomètres au lieu de 458 nanomètres. Ajustez les paramètres de puissance au besoin, mais ne modifiez pas les fréquences d’émission. Sélectionnez un retour sur investissement fluorescent d’environ 20 pixels de rayon.

Ajoutez la moyenne du retour d’intérêt fluorescent en tant qu’intensité normalisée à la base de données spectrale, en cliquant sur Enregistrer les spectres dans la base de données. Pour capturer les images non mélangées, basculez d’abord le mode de capture sur le démixage spectral. Ajoutez les empreintes spectrales de Vénus et de mTFP1 aux canaux de démixage.

Réglez le laser d’excitation sur une source d’argon de 458 nanomètres. Placez le curseur de visualisation du capteur de tension nesprin au-dessus de l’objectif d’huile 60X. Après avoir fait la mise au point sur une cellule fluorescente avec une expression suffisamment lumineuse, ajustez le gain et la puissance du laser pour optimiser le rapport signal sur bruit.

Capturez un minimum de 15 à 20 images de cellules de capteur de tension nesprin avec une luminosité relativement similaire et évitez une saturation excessive des pixels. Répétez le processus de capture d’image avec des cellules sans tête nesprin en utilisant des paramètres d’imagerie identiques. Une image agrandie 10X représentative de fibroblastes 3T3 transfectés avec un capteur de tension nesprin à l’aide d’un support médié par les lipides est présentée ici.

En règle générale, seule une fraction des cellules est transfectée dans un champ de vision donné. On voit ici une paire représentative de deux noyaux 3T3 exprimant la nesprine-TS dans les canaux spectralement non mélangés venus et mTFP. Une image couleur fusionnée des deux canaux est affichée dans le panneau le plus à droite.

Voici un échantillon représentatif de noyaux masqués de nesprin-TS provenant de cellules MDCK stables exprimant sur des substrats structurés et non structurés. Les images de rapport sont définies comme le rapport du canal de Vénus divisé par le canal mTFP et peuvent être utilisées pour effectuer des comparaisons de force quantitatives relatives. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures environ si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de marquer soigneusement les tubes d’ADN pendant la transfection et de maintenir les paramètres d’imagerie constants tout en capturant les images des résultats spectraux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des cellules avec le capteur de tension nesprin et de capturer des images résolues spectralement sur l’indice FRET de l’ordinateur qui est en corrélation avec la force sur le capteur de tension. Bien que dans ce cas, un capteur FRET soit utilisé pour la nesprine, il peut également être appliqué à d’autres protéines de la cellule où la force de mesure est souhaitée.