Name: Un protocole pour lutilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Apprenez à mesurer les forces mécaniques sur le complexe nucléaire LINC à l'aide de biocapteurs FRET dans des cellules NIH 3T3 vivantes. Cette méthode permet d'étudier la mécanotransduction au niveau nucléaire.

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Ce travail a été soutenu par le Thomas F. Miller et Kate Jeffress Memoria Trust (à DEC) et des subventions du NIH R35GM119617 (à DEC). L&#39;imagerie par microscopie confocale a été réalisée au Centre de VCU Caractérisation de base Nanomatériaux (CCN).

1. Obtenir Nesprin-2G ADN capteur et autres ADN plasmidique <ol><li> Obtenir Nesprin-2G TS (capteur de tension), le contrôle Nesprin-2G HL (sans tête), mTFP1, venus, et TSmod à partir d&#39;une source commerciale. Propager les plasmides d&#39;ADN et les purifier en utilisant des souches standards de E. coli, tels que DH5-α, comme décrit précédemment 12, 13. </li></ol> 2. Les cellules transfecter avec Nesprin-2G et autres ADN plasmidique <ol><li> Cultiver des cellules de fibroblastes NIH 3T3 à confluence 70-90% dans une boîte de culture cellulaire à 6 puits dans un incubateur de culture cellulaire standard avec la température (37 ° C) et de régulation de CO 2 (5%). Pour le milieu de croissance cellulaire, utiliser Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau foetal. </li><li> Dans une hotte de culture cellulaire, éliminer le milieu et rincer chaque puits avec environ 1 ml d&#39;un milieu de cellules à teneur réduite en sérum. Ajouter 800 pi de milieu cellulaire sérum réduit à chaque puitset mettre la chambre à 6 puits dans l&#39;incubateur. </li><li> Pipeter 700 ul de milieu de sérum réduit cellulaire dans un tube de 1,5 ml avec 35 ul de solution de véhicule lipidique pour former le « lipomix ». Mélanger par pipetage. Etiqueter le tube avec un « L. » </li><li> Recueillir six tubes de 1,5 ml et les étiqueter 1 à 6. Pipeter 100 ul de milieu de sérum réduit de cellule dans chaque tube. <ol><li> Utilisation de la concentration d&#39;ADN plasmidique provenant de l&#39;étape 1, la pipette 2 pg de Nesprin 2G-TS dans des tubes 1 et 2. Pipeter 2 pg de Nesprin-HL dans des tubes 3 et 4. Pipeter 1 ug de MTFP dans le tube 5. Pipeter 1 ug de mVenus dans le tube 6. ne pas réutiliser les embouts de pipette lors du pipetage différents types d&#39;ADN. </li></ol></li><li> Pipeter 100 ul de la lipomix du tube en « L » dans chaque tube marqué (1-6) et mélanger par pipetage répété. Utiliser une pipette propre pour chaque tube. Incuber pendant 10-20 min. </li><li> Ajouter 200 ul de chaque tube marqué à un puits dans la chambre 6 puits avec 70-90% de confluencecellules. Etiqueter le haut de chaque puits avec l&#39;ADN correspondant ajouté. Placer la chambre à 6 puits dans un incubateur pendant 4-6 h. </li><li> Aspirer le moyen et ajouter 1-2 ml de milieu cellulaire sérum réduit à rincer. Aspirer le milieu des cellules à teneur réduite en sérum, ajouter 2 ml de trypsine à chaque puits, et placer le plat à 6 puits dans l&#39;incubateur (5-15 min). </li><li> Bien que les cellules se détachent dans l&#39;incubateur, le manteau 6 plats de visualisation à fond de verre avec une couche de fibronectine à une concentration de 20 ug / mL dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser la vaisselle à revêtir la surface dans la hotte de culture cellulaire (environ 20 min). </li><li> Neutraliser la trypsine par addition de 2 ml de DMEM une fois que les cellules sont détachées. </li><li> Transférer le contenu de chaque puits à un tube de centrifugation marqué 15 ml et centrifuger à 90 xg pendant 5 min dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 1 000 pi de DMEM par mélange de pipette. </li><li> Aspirer le mélange de fibronectine à partir duplats à base de verre et de pipette de 1000 ul de chaque suspension cellulaire sur la vaisselle en verre. </li><li> Après que les cellules se déposent au fond des plats en verre (~ 15 min), ajouter un autre 1 ml de DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep à chaque puits et dans l&#39;incubateur de cellules. Permettre aux cellules de se fixer et d&#39;un capteur pour exprimer au moins 18 à 24 h. NOTE: Les cellules sont transfectées en utilisant des réactifs de transfection des lipides cationiques commerciaux (voir la table des matières). En variante, les lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés à l&#39;aide d&#39; un plasmide avec un gène conférant une résistance à une toxine (les plasmides pcDNA pour Nesprin-TS et -HL sont disponibles sur un site de dépôt de l&#39; ADN (voir le tableau des matériaux) fournir des cellules exprimant la résistance à la généticine ). En outre, des procédés d&#39;infection virale (lentivirus, retrovirus, ou adenovirus) peuvent être utilisés pour exprimer le capteur dans des cellules qui sont difficiles à transfecter. </li><li> En plus de Nesprin-TS, transfecter des cellules supplémentaires avec le Nesprin HL-zérole contrôle de conformité, tel que décrit dans les étapes 2.1-2.12; TSmod peut également être utilisé comme un contrôle zéro force et doit présenter FRET similaire à Nesprin-HL. </li><li> transfecter des cellules avec mTFP1 et venus de générer des empreintes digitales spectrales (voir l&#39;étape 4). REMARQUE: mTFP1 et expriment généralement vénus à des niveaux plus élevés que Nesprin-TS, et en tant que tels, des quantités plus faibles d&#39;ADN devront peut-être transfectées pour atteindre des niveaux d&#39;expression similaires. </li></ol> 3. Vérifier l&#39;efficacité Transfection <ol><li> Environ 18 à 24 h après la fin de la transfection, en utilisant un microscope à fluorescence inversée pour examiner l&#39;efficacité de la transfection en comparant le nombre de cellules fluorescentes et le nombre total de cellules en vue (généralement 5-30%). <ol><li> Utiliser un microscope à fluorescence équipé d&#39;une fréquence d&#39;excitation proche de 462 nm (mTFP1) ou 525 nm (Venus), et un filtre d&#39;émission centrée à proximité de 492 nm (mTFP1) ou 525 nm (VENUS). REMARQUE: Sinon, jeux de filtres GFP capturera une combinaison de mTFP1 et veles émissions Nus et permettront la confirmation de l&#39;efficacité de la transfection. </li></ol></li><li> cellules vivantes de l&#39;image dans les 48 h après la transfection. <ol><li> En variante, fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS (avec du calcium et de magnésium) pendant 5 min, de stocker dans du PBS, et la vue après 48 h 8. NOTE: Au-delà de 48 h, la qualité et la puissance du signal désintègre. La fixation des cellules préserve leur état, y compris le FRET étant exprimé 8; Cependant, les cellules ne devraient être imagés dans du PBS, en tant que moyen de montage peut affecter 14 FRET. Les cellules fixées ne peuvent être comparées à d&#39;autres cellules fixes, comme il peut y avoir un changement dans l&#39;expression. Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle (EPI). </li></ol></li></ol> 4. capture spectrale de Fingerprints mTFP1 et Vénus fluorophores pour Déconvolution spectrale <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, remplacer le milieu cellulaire avec l&#39;imagerie medium (tampon HEPES) complété avec 10% de sérum bovin foetal. </li><li> Placer les plats de visualisation à une température contrôlée (37 ° C) platine du microscope confocal. </li><li> Placer le plat de visualisation en verre avec des cellules transfectées mTFP1 plus de l&#39;objectif de l&#39;huile à un grossissement de 60X avec une ouverture numérique de 1,4. NOTE: L&#39;huile est utilisée sur un microscope à balayage laser sur l&#39;objectif 60X pour ressembler étroitement l&#39;indice de réfraction du substrat de verre. L&#39;huile est placé sur le dessus de l&#39;objectif et est en contact direct avec la lamelle de verre. </li><li> Localiser mTFP1 cellules exprimant avec une source d&#39;excitation de 458 nm et un filtre passe-bande d&#39;émission centrée à 500 nm. </li><li> Avec une cellule fluorescente dans le champ de vision, sélectionner le mode de détection spectrale ( « Mode Lambda » dans le logiciel utilisé ici) et de capturer l&#39;image spectrale (Figure 3-1); inclure toutes les fréquences au - delà de 458 nm en utilisant des incréments de 10 nm (Figure 3-3). Sélectionnez un Déess lumineuxrégion ent (ROI) sur la cellule (rayon de 20 pixels). NOTE: La forme spectrale du ROI mTFP1 exprimant doit rester dans la cellule relativement constante. Si la forme varie considérablement, réajustez le laser et obtenir les paramètres pour améliorer le rapport signal-bruit. </li><li> Ajouter le retour sur investissement fluorescent moyenne, l&#39;intensité normalisée à la base de données spectrale en cliquant sur « enregistrer des spectres à la base de données. » </li><li> Optimiser la puissance du laser et gagner de telle sorte qu&#39;un bon rapport signal-bruit est atteint. Les réglages varient pour différents équipements. Utilisation de cellules non fluorescentes, non transfectées en tant que référence d&#39;arrière-plan, augmenter le gain et la puissance jusqu&#39;à ce que les cellules sont lumineuses, mais pas au-delà de la plage dynamique du détecteur (point de saturation). les cellules d&#39;arrière-plan ne devraient pas avoir une fluorescence détectable après une moyenne. </li><li> Répétez le processus pour les cellules transfectées avec vénus les exceptions suivantes: <ol><li> Assurez-vous que la fréquence d&#39;excitation est à 515 nm et que le filtre passe-bande est thisntered près de 530 nm lors de la localisation des cellules exprimant vénus. </li><li> En &quot;mode spectral,&quot; utiliser une fréquence d&#39;excitation de 515 nm au lieu de 458 nm. </li></ol></li></ol> 5. Images capture Unmixed <ol><li> Changez le mode de capture à « Déconvolution spectrale. » </li><li> Ajouter les empreintes digitales spectrales des clovisses et mTFP1 dans les canaux de démixage (Figure 3, Sous-2). </li><li> Réglez le laser d&#39;excitation à une source d&#39;argon 458 nm. </li><li> Placez le plat de visualisation Nesprin-TS au-dessus de l&#39;objectif de l&#39;huile 60X. </li><li> Après mise au point sur une cellule fluorescente avec une expression suffisamment lumineux, ajuster la puissance de gain et laser pour optimiser le rapport signal-sur-bruit. REMARQUE: Étant donné que l&#39;efficacité de FRET de Nesprin-TS est près de 20%, l&#39;image doit être vénus sans mélange sensiblement plus faible que l&#39;image mTFP1 sans mélange. Une fois un réglage de puissance et le gain acceptable ont été déterminées itérativement, ces paramètres doivent rester constant pour toutes les images captured. </li><li> Capturer un minimum de 15-20 images de cellules Nesprin-TS avec une luminosité relativement similaire et d&#39;éviter la saturation du pixel excessive (tous les pixels saturés sont éliminés au cours du traitement de l&#39;image). </li><li> Répéter le processus de capture d&#39;image avec des cellules HL-Nesprin en utilisant des paramètres de formation d&#39;image identiques. </li></ol> 6. Traitement de l&#39;image et analyse des ratios d&#39;image <ol><li> En utilisant un logiciel open-source ImageJ (FIDJI) (http://fiji.sc/), ouvrez les images au format natif en utilisant BioFormats Reader. </li><li> Pré-traiter les images et calculer les images de rapport en utilisant des protocoles établis précédemment 15. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un procédé et la démonstration d&#39;imagerie des cellules vivantes de la tension mécanique dans Nesprin-2G, une protéine dans le complexe nucléaire CLIC, a été décrit ci-dessus. Avant ces travaux, diverses techniques, telles que l&#39; aspiration par micropipette, cytométrie magnétique bourrelet, et l&#39; ablation au laser au microscope, ont été utilisés pour appliquer de pression sur le noyau de la cellule et à mesurer les propriétés des matériaux en vrac 16, ...

Sensible à la force, des capteurs de FRET codés génétiquement ont récemment émergé comme un outil important pour mesurer des forces de traction à base de cellules vivantes, donnant un aperçu de la manière dont les forces mécaniques sont appliquées sur les protéines 1, 2, 3, 4. Avec ces outils, les chercheurs peuvent acquérir des images non effractive forces intracellulaires dans les cellules vivantes en utilisant des microscopes fluorescents classiques. Ces capteurs sont constitués d&#39;une paire FRET (donneur et accepteur protéines fluorescentes, le plus souvent un donneur et accepteur bleu jaune) séparées par un peptide élastique 3. Contrairement à C- ou le marquage N-terminal, ce capteur est inséré dans un site interne d&#39;une protéine pour mesurer la force mécanique transmise à travers la protéine, se comportant comme une jauge de contrainte moléculaire. Augmentation de la tension mécanique sur les résultats de détection à une distance accrue entre le FRET-pair, entraînant une diminution de FRET 3. En conséquence, le FRET est inversement proportionnelle à la force de traction. Ces capteurs à base de fluorescence ont été développés pour des protéines d&#39;adhésion focale (de vinculine 3 et Talin 4), les protéines du cytosquelette (α-actinine 5), et des protéines de jonction cellule-cellule (E-cadhérine 6, 7, VE-cadhérine 8, et PECAM 8). Le segment de liaison élastique le plus fréquemment utilisé et bien caractérisés dans ces biocapteurs est connu comme TSmod et se compose d&#39;une séquence répétitive de 40 acides aminés, (GPGGA) 8, qui a été dérivée de la protéine de soie d&#39;araignée flagelliforme. TSmod a été montré pour se comporter comme un ressort élastique nano-linéaire, avec une réactivité de FRET à 1 à 5 pN de la force de traction 3. Différentes longueurs de flagelliformes peuvent être utilisés pour modifier la dynamique range de la sensibilité de la force de FRET TSmod 9. En plus de flagelliformes, spectrine répète 5 et villine peptide de tête (connu sous le nom HP35) 4 ont été utilisés comme peptides élastiques entre les paires de FRET dans des biocapteurs de force similaire 4. Enfin, un récent rapport a montré que TSmod peut également être utilisé pour détecter les forces de compression 10. Nous avons récemment développé un capteur de force pour la liaison de la nucléo-cytosquelette (CLIC) complexe de protéines en utilisant Nesprin2G TSmod inséré dans une protéine tronquée Nesprin2G développé précédemment connu sous le mini-Nesprin2G (figure 2C), qui se comporte de manière similaire à endogène Nesprin-2G 11. Le complexe CLIC contient plusieurs protéines qui mènent de l&#39;extérieur vers l&#39;intérieur du noyau, reliant le cytosquelette cytoplasmique de la lamina nucléaire. Nesprin-2G est une protéine structurale lie à la fois à lacytosquelette d&#39;actine dans le cytoplasme et aux protéines SUN dans l&#39;espace périnucléaire. En utilisant notre biocapteur, nous avons pu montrer que Nesprin-2G est soumis à une tension dépendant de actomyosine dans les fibroblastes NIH3T3 2. Ce fut la première fois que la force a été mesurée directement sur une protéine dans le complexe nucléaire LINC, et il est susceptible de devenir un outil important pour comprendre le rôle de la force sur le noyau en mécanobiologie. Le protocole ci-dessous fournit une méthodologie détaillée de la façon d&#39;utiliser le capteur de force Nesprin-2G, y compris l&#39;expression du capteur de tension Nesprin (Nesprin-TS) dans des cellules de mammifères, ainsi que l&#39;acquisition et l&#39;analyse des images de FRET de cellules exprimant Nesprin- TS. En utilisant un microscope confocal inversé équipé d&#39;un détecteur spectral, une description de la façon de mesurer l&#39;émission sensibilisée FRET utilisant déconvolution spectrale et l&#39;imagerie ratiométrique de FRET est fourni. Les images de sortie ratiométrique peuvent être utilisés pour faire en tant que parentComparaisons des forces ntitative. Bien que ce protocole se concentre sur l&#39;expression de Nesprin-TS dans des fibroblastes, il est facilement adaptable à d&#39;autres cellules de mammifères, y compris les lignées cellulaires et les cellules primaires. En outre, ce protocole en ce qui concerne l&#39;acquisition et l&#39;analyse FRET image peut être facilement adaptée à d&#39;autres biocapteurs de force sur la base de FRET qui ont été développés pour d&#39;autres protéines.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>Extrait de https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td><td>Extrait de https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>Extrait de https://www.addgene.org/54613/</td></tr> <tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>Extrait de https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>Extraire des</td></tr> <tr><td>cellules https://www.addgene.org/26021/ compétentes</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>Liquid LB Media</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Solid LB Plaques de culture bactérienne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>Cuvette à quartz</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>Cuvette pour SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>Kit d’isolement d’ADN</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multiwell Boîte de culture en polystène à 6 puits Milieu</td></tr><tr><td>d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, milieu cellulaire</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Bovin Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>milieu cellulaire sérique réduit</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>milieu sérique réduit, « optimem"</td></tr><tr><td>Lipid Carrier Solution</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Réactif lipidique, « Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>1,5 mL tube en plastique stérile</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0,25 % Trypsine-EDTA (1x)</td></tr>verre fond de <tr><td>microscope Plat de visualisation</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm Plat avec puits inférieur de 20 mm #1.5 verre</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronectine protéine humaine, plasma</td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco’s Phosphate Tamponné Saline</td></tr><tr><td>15 mL tube à centrifuger stérile</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse à rotor oscillant&nbsp ;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>Rotor oscillant Thermo electron 236</td></tr><tr><td>Capot de biosécurité pour la culture cellulaire</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture cellulaire à température contrôlée</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent à LED inversée à grand champ</td> Life <td>technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Média d’imagerie tamponné HEPES transparent</td><td>Sondes</td> <td>moléculaires</td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Température contrôlée-inversée confocale avec sources laser 458 et 515 nm&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp ; LSM 710-w/spectral META détecteur</td><td></td></tr><tr><td>Outgrowth Media</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblastes</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour l&#39;utilisation förster resonance energy transfer (fret) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire linc

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Le complexe LINC a été supposé être la structure critique qui médie le transfert des forces mécaniques du cytosquelette au noyau. Nesprin-2G est un composant clé du complexe LINC qui relie le cytosquelette d’actine aux protéines membranaires (protéines du domaine SUN) dans l’espace périnucléaire. Ces protéines membranaires se connectent aux lamines à l’intérieur du noyau. Récemment, une sonde de force de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) a été clonée dans le mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (capteur de tension)) et utilisée pour mesurer la tension à travers Nesprin-2G dans des fibroblastes NIH3T3 en direct. Cet article décrit le processus d’utilisation de Nesprin-TS pour mesurer les forces du complexe LINC dans les fibroblastes NIH3T3. Pour extraire des informations FRET de Nesprin-TS, un aperçu de la façon de démélanger spectralement des images spectrales brutes en canaux fluorescents accepteurs et donneurs est également présenté. À l’aide d’un logiciel open source (ImageJ), les images sont prétraitées et transformées en images ratiométriques. Enfin, les données FRET de Nesprin-TS sont présentées, ainsi que des stratégies sur la façon de comparer les données entre différents groupes expérimentaux.

En suivant le protocole ci - dessus, l' ADN plasmidique a été acquis à partir du dépôt de l' ADN et transformé dans des cellules E. coli. E. coli exprimant l'ADN de la sonde ont été sélectionnés à partir des plaques de LB / ampicilline et amplifiés dans un bouillon LB liquide. Suite à l'amplification des vecteurs, des plasmides d'ADN ont été purifiés dans du tampon TRIS-EDTA en utilisant un étalon, le kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce. L' utilisation d' ...

Un certain nombre de biocapteurs de force basés sur FRET ont récemment été développés, permettant la résolution spécifique des protéines de la force intracellulaire. Dans ce protocole, nous démontrons comment l’un de ces capteurs, conçu pour l’agent de liaison de la protéine du complexe nucléosquelette-cytosquelette (LINC) Nesprin-2G, peut être utilisé pour mesurer les forces de l’actomyosine sur le complexe nucléaire LINC.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

L’objectif global de cette procédure est de déterminer les forces exercées sur l’agent de liaison du cytosquelette nucléosquelette, ou complexe LINC, par microscopie FRET dans des cellules vivantes via un biocapteur conçu pour la protéine du complexe LINC, nesprin-2G. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanotransduction, telles que les forces exercées sur les protéines dans le noyau des cellules vivantes et la façon dont ces forces changent dans des conditions variantes. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à mesurer de très faibles niveaux de force sur les protéines et les cellules vivantes.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à capturer des images. Il est difficile d’optimiser la puissance et le gain du laser du microscope pour recevoir un bon signal entre tous les groupes expérimentaux. Pour commencer, cultivez des cellules de sablage de fibres NIH 3T3 à une confluence comprise entre 70 % et 90 % dans une boîte de culture cellulaire à six puits dans un incubateur de culture cellulaire standard avec régulation de la température et du CO2.Dans une hotte de culture cellulaire, retirez le milieu et rincez chaque puits avec environ 1 millilitre d’un milieu cellulaire sérique réduit. Ajoutez 800 microlitres de milieu cellulaire sérique réduit dans chaque puits et placez la chambre à six puits dans l’incubateur. Ensuite, pipetez 700 microlitres de milieu cellulaire sérique réduit dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté L avec 35 microlitres de solution de transport lipidique pour former le mélange lipo.Mélanger la suspension par pipetage. Ensuite, pipetez 100 microlitres du milieu à cellules sériques réduites dans chacun des six tubes de 1,5 millilitre étiquetés de un à six. Pipetez l’ADN plasmatique du capteur de tension nesprin, du contrôle de force zéro sans tête nesprin , du mTFP1 et de Vénus dans les tubes un à six, comme décrit dans le protocole de texte.Ne réutilisez pas les pointes de pipette lorsque vous pipetez différents types d’ADN. Ensuite, pipetez 100 microlitres du mélange lipo du tube L dans chaque tube étiqueté, et mélangez par pipetage répété, à l’aide d’une pipette propre pour chaque tube. Incuber la suspension pendant 10 à 20 minutes.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chaque tube étiqueté dans un puits de la chambre à six puits préparée contenant des cellules. Étiquetez le haut de chaque puits avec l’ADN correspondant ajouté. Ensuite, placez la chambre à six puits dans un incubateur pendant quatre à six heures.Après l’incubation, aspirez le milieu et ajoutez un à deux millilitres de milieu à cellules sériques réduites pour rincer. Aspirez le milieu cellulaire sérique réduit et ajoutez deux millilitres de trypsine dans chaque puits avant de placer la boîte à six puits dans l’incubateur pendant cinq à 15 minutes. Pendant que les cellules se détachent dans l’incubateur, enduisez six boîtes d’observation à fond de verre d’une couche de fibronectine à une concentration de 20 microgrammes par millilitre dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate.Laissez les plats recouvrir la surface dans la hotte de culture cellulaire. Neutralisez la trypsine en ajoutant deux millilitres de DMEM une fois les cellules détachées. Ensuite, transférez le contenu de chaque puits dans un tube à centrifuger de 15 millilitres étiqueté et tournez à 90 fois g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à rotor oscillant.Aspirez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans 1 000 microlitres de DMEM à l’aide d’une pipette. Aspirez le mélange de fibronectine des boîtes en verre et pipetez 1 000 microlitres de chaque suspension cellulaire sur les boîtes. Une fois que les cellules se sont déposées au fond des plats en verre, ajoutez un autre millilitre de média dans chaque puits.Laissez les cellules se fixer et exprimer le capteur dans l’incubateur de cellules pendant au moins 18 à 24 heures. Pour vérifier l’efficacité de la transfection, utilisez un microscope fluorescent équipé d’une fréquence d’excitation proche de 462 nanomètres pour mTFP1, ou 525 nanomètres pour Vénus. Utilisez un filtre d’émission centré à près de 492 nanomètres pour mTFP1, ou 525 nanomètres pour Vénus.Environ 18 à 24 heures après la fin de la transfection, utilisez un microscope à fluorescence inversée pour examiner l’efficacité de la transfection en comparant le nombre de cellules fluorescentes au nombre total de cellules visibles. Si les cellules vivantes ne peuvent pas être imagées dans les 48 heures suivant la transfection, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes. Laisser les cellules exprimer le capteur pendant 24 à 48 heures avant la fixation.Stockez les cellules dans PBS et visualisez-les après 48 heures. Dans une hotte de culture cellulaire, remplacer le milieu cellulaire par un milieu d’imagerie complété par 10 % de sérum de veau fœtal. Placez les paraboles dans une platine de microscope confocal à température contrôlée.Placez la parabole en verre avec les cellules transfectées mTFP1 sur l’objectif à huile à un grossissement de 60X avec une ouverture numérique de 1,4. Localisez les cellules exprimant mTFP1 en mode fluorescent à champ large. Avec une cellule fluorescente dans le champ de vision, sélectionnez le mode de détection spectrale et capturez l’image spectrale.Incluez toutes les fréquences au-delà de 458 nanomètres en utilisant des incréments de 10 nanomètres. Sélectionnez une région fluorescente brillante sur la cellule. Ajoutez la moyenne du retour d’intérêt fluorescent en tant qu’intensité normalisée à la base de données spectrale en cliquant sur Enregistrer les spectres dans la base de données.Optimiser la puissance et le gain laser de manière à obtenir un bon rapport signal/bruit. Les paramètres varient selon l’équipement. Répétez le processus pour les cellules exprimant Vénus et restez en mode spectral.Utilisez une fréquence d’excitation de 488 nanomètres au lieu de 458 nanomètres. Ajustez les paramètres de puissance au besoin, mais ne modifiez pas les fréquences d’émission. Sélectionnez un retour sur investissement fluorescent d’environ 20 pixels de rayon.Ajoutez la moyenne du retour d’intérêt fluorescent en tant qu’intensité normalisée à la base de données spectrale, en cliquant sur Enregistrer les spectres dans la base de données. Pour capturer les images non mélangées, basculez d’abord le mode de capture sur le démixage spectral. Ajoutez les empreintes spectrales de Vénus et de mTFP1 aux canaux de démixage.Réglez le laser d’excitation sur une source d’argon de 458 nanomètres. Placez le curseur de visualisation du capteur de tension nesprin au-dessus de l’objectif d’huile 60X. Après avoir fait la mise au point sur une cellule fluorescente avec une expression suffisamment lumineuse, ajustez le gain et la puissance du laser pour optimiser le rapport signal sur bruit.Capturez un minimum de 15 à 20 images de cellules de capteur de tension nesprin avec une luminosité relativement similaire et évitez une saturation excessive des pixels. Répétez le processus de capture d’image avec des cellules sans tête nesprin en utilisant des paramètres d’imagerie identiques. Une image agrandie 10X représentative de fibroblastes 3T3 transfectés avec un capteur de tension nesprin à l’aide d’un support médié par les lipides est présentée ici.En règle générale, seule une fraction des cellules est transfectée dans un champ de vision donné. On voit ici une paire représentative de deux noyaux 3T3 exprimant la nesprine-TS dans les canaux spectralement non mélangés venus et mTFP. Une image couleur fusionnée des deux canaux est affichée dans le panneau le plus à droite.Voici un échantillon représentatif de noyaux masqués de nesprin-TS provenant de cellules MDCK stables exprimant sur des substrats structurés et non structurés. Les images de rapport sont définies comme le rapport du canal de Vénus divisé par le canal mTFP et peuvent être utilisées pour effectuer des comparaisons de force quantitatives relatives. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures environ si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de marquer soigneusement les tubes d’ADN pendant la transfection et de maintenir les paramètres d’imagerie constants tout en capturant les images des résultats spectraux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des cellules avec le capteur de tension nesprin et de capturer des images résolues spectralement sur l’indice FRET de l’ordinateur qui est en corrélation avec la force sur le capteur de tension. Bien que dans ce cas, un capteur FRET soit utilisé pour la nesprine, il peut également être appliqué à d’autres protéines de la cellule où la force de mesure est souhaitée.

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Un protocole pour lutilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC (Vidéo) | JoVE Journal

Un protocole pour l'utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

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