ACT-PRESTO: Dégagement de tissus biologiques et méthodes immunomarquage pour Volume Imaging

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir le tissu dégagé et intact et de visualiser ses informations moléculaires tridimensionnelles à l’aide de méthodes d’immunomarquage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la biologie du développement, telles que les connexions neuronales, la catégorisation moléculaire et les changements structurels au cours du développement. Le principal avantage de cette technique est que le tissu permet clairement l’analyse au niveau subcellulaire de grands échantillons sans section.

Pour commencer cette procédure, incubez les organes fixes dans une solution de monomère d’hydrogel A4P0 à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures en agitant doucement. Après cela, ajoutez cinq millilitres de solution de monomère d’hydrogel dans un tube à fond rond de 10 millilitres. Ensuite, transférez-y l’échantillon de cerveau de souris et enveloppez le haut du tube avec du Parafilm.

Ensuite, faites buller de l’azote dans le liquide avec l’échantillon de cerveau infusé d’hydrogel pendant une minute. Fermez rapidement et hermétiquement le tube contenant l’échantillon. Transférez le tube dans un bain-marie pendant deux heures.

Après cela, vérifiez la viscosité de l’hydrogel, puis lavez brièvement l’échantillon polymérisé avec 0,1 X PBS pour éliminer l’excès d’hydrogel. Dans cette étape, transférez l’échantillon polymérisé dans un récipient en tissu. Et placez le récipient de mouchoir dans la chambre ETC.

Ensuite, remplissez la chambre ETC avec un tampon ETC à l’aide d’une pompe péristaltique. Définissez les conditions ETC et activez-le. Des tranches de cerveau d’un à deux millimètres d’épaisseur sont nettoyées en deux heures.

Et tout un cerveau est suffisamment nettoyé en cinq à six heures. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube conique de 50 millilitres avec 45 millilitres de 0,1 X PBS. Lavez l’échantillon plusieurs fois avec 0,1 X PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles lorsque le tube est brièvement secoué pour confirmer l’élimination complète de la FDS.

Pour effectuer c-PRESTO, transférez un petit échantillon dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de solution de dilution d’anticorps avec un facteur de dilution de un à 500 pour les anticorps de collagène de type quatre et centrifugez le tube à 600 fois g pendant deux heures. Après cela, lavez l’échantillon coloré avec 0,1 X PBS par centrifugation à 600 fois g pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de dilution d’anticorps avec un facteur de dilution de un à 500 pour l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué Cy3 et centrifugez-le 600 fois g pendant deux heures. Ensuite, laver l’échantillon coloré avec 0,1 X PBS par centrifugation à 600 fois g pendant 30 minutes. Pour effectuer s-PRESTO pour les tissus plus gros, transférez l’échantillon dans une seringue reliée à une valve à trois voies en position de valve fermée.

Ajoutez cinq à sept millilitres de solution de dilution d’anticorps avec un facteur de dilution de un à 500 pour l’anticorps de collagène de type quatre. Par la suite, ajoutez la solution d’anticorps dans l’échantillon en ouvrant la valve. Ensuite, en position de valve ouverte, réglez le piston de la seringue sur la position de 17 millilitres pour fournir suffisamment d’espace pour le mouvement de retrait de la perfusion.

Ensuite, fermez la valve à trois voies une fois le réglage de la seringue terminé. Placez la seringue contenant l’échantillon sur un pousse-seringue. Réglez les conditions du pousse-seringue sur un volume de prélèvement de perfusion de dix millilitres par minute et un temps de pause de quatre minutes en mode cycle continu.

Ensuite, faites fonctionner le pousse-seringue pendant trois à 24 heures à température ambiante. Ensuite, ouvrez la vanne à trois voies et remplacez la solution par 0,1 X PBS. Lavez l’échantillon taché deux fois avec 0,1 X PBS pendant une heure à chaque fois, à l’aide du pousse-seringue.

Ensuite, remplacez le PBS par la solution de dilution d’anticorps contenant l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué Cy3 et faites fonctionner le pousse-seringue pendant trois à 24 heures. Ensuite, ouvrez la vanne à trois voies et remplacez la solution par 0,1 X PBS. Avant l’imagerie, incubez l’échantillon coloré dans une quantité appropriée de solution de montage cubique pendant une heure à température ambiante en agitant doucement.

Au bout d’une heure, remplacez la solution par une solution de montage cubique fraîche et incubez pendant une heure supplémentaire. Étant donné que les anticorps ne peuvent pas pénétrer dans les tissus denses par diffusion, les méthodes d’immunomarquage PRESTO sont conçues pour infuser activement les macromolécules et délivrer des réactifs dans les tissus denses. L’application de forces centrifuges à l’aide d’une centrifugeuse de table standard a considérablement facilité l’administration d’anticorps.

L’application d’un flux de convection à l’aide d’une pompe à seringue a également amélioré la pénétration des anticorps. Pour s-PRESTO, un pousse-seringue a été utilisé pour délivrer les anticorps. Les organes de la souris, tels que les reins et le foie, ont été marqués avec du collagène de type 4.

Par rapport aux méthodes conventionnelles, trois heures de c ou s-PRESTO augmentent considérablement la profondeur de l’étiquetage. Dans le rein et le foie, la profondeur de l’axe z atteint 300 à 350 micromètres ou plus profondément dans les échantillons PRESTO, tandis que les échantillons témoins sont marqués à une profondeur de seulement 40 à 50 micromètres. Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en une journée pour les tissus clairement si elles sont exécutées correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder clairement le temps de fixation des tissus, de l’émulsion de monomère d’hydrogel et du tissu électrophorétique. Après la procédure, d’autres méthodes telles que l’immunomarquage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’analyse de la dynamique cellulaire et l’identification d’une cavité neuronale à travers plusieurs organes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences médicales pour explorer le diagnostic des maladies.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire l’enrobage d’hydrogel et la polymérisation tissulaire. N’oubliez pas que travailler avec une solution de monomère d’hydrogel peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.