Matrices 2D et 3D pour étudier la formation et l'activité invadosome linéaire

Notre groupe travaille sur l’interaction entre la cellule et la matrice extracellulaire. Les cellules peuvent produire mais peuvent également dégrader l’élément de la matrice extracellulaire. La dégradation de la matrice peut se produire au cours de processus physiologiques mais aussi pathologiques, tels que la neurodégénérescence et l’invasion d’une tumeur cellulaire.

Au niveau cellulaire, on peut remarquer la présence d’une structure à base d’actine impliquée dans la dégradation de la matrice. Et ces structures sont appelées invadosomes. L’invadosome, c’est un terme général qui inclut les podosomes dans les cellules normales et l’invadopodie dans les cellules cancéreuses.

La dégradation de cet invadosome peut s’auto-organiser en différentes formes, points, agrégats et rosettes. Et l’activité de cet invadosome est pilotée par les métalloprotéinases, telles que MMP2 et MT1-MMP. Ce n’est que depuis longtemps que le couple, MMP2, MT1-MMP est activé par les fibrilles de collagène de type 1.

Pour étudier l’activité des invadosomes, un test zymographique in situ classique a été utilisé. Mais pour étudier le rôle et l’impact des fibrilles de collagène de type 1 dans les invadosomes, nous avons décidé de créer un nouveau test. Pour ce faire, nous avons créé une matrice mixte composée de gélatine et de fibrilles de collagène de type 1.

Dans ce film en première partie, Eloide Henriet va vous montrer comment nous générons ce genre de matrice. Dans la deuxième partie, Zakaria Ezzoukhry vous montrera comment nous sommes capables de mesurer l’impact des fibrilles de collagène de type 1 dans la morphologie, la formation et l’activation des invadosomes. Et dans la dernière partie, Julie Di Marino vous montrera comment nous adaptons un test d’invasion de collagène en 3D.

Je vais vous montrer comment préparer une matrice mixte composée de gélatine et de fibrilles de collagène de type 1. Je vais faire deux types de matrice mixte. L’un pour faire le test zymographique in situ avec de la gélatine de fluorescéine et du collagène de type 1 non fluorescéine.

Et un autre nous permettant de visualiser les fibrilles de collagène avec de la gélatine non fluorescéine et des fibrilles de collagène marquées. Pour préparer la matrice de gélatine, aliquote 20 gouttelettes de gélatine d’un microlitre sur un morceau de parafilm. Couvrez chaque gouttelette avec une lamelle en verre autoclave.

Incuber à température ambiante pendant 20 minutes et à l’abri de la lumière. Pour la fixation de la gélatine, aliquote 40 microlitres de gouttelettes de glutaraldéhyde à 0,5 % dans du PBS. À l’aide d’une pince, transférez les lamelles enrobées de gélatine sur chaque gouttelette de glutaraldéhyde.

Incuber à température ambiante pendant 40 minutes et à l’abri de la lumière. Prenez une plaque de culture cellulaire multipuits et remplissez chaque puits avec 500 microlitres de PBS stérile 1X. À la fin de la période d’incubation, placez chaque lamelle, côté gélatine vers le haut, dans chaque puits.

Lavez les lamelles deux fois dans 1X PBS pendant cinq minutes chacune. À cette étape, les lamelles peuvent être utilisées pour l’expérimentation ou stockées pour une utilisation ultérieure. Pipette 0,4 mg par ml de collagène dans un tube.

Ajouter le colorant fluorescent pour une concentration finale de 10 microgrammes par ml. Mélanger la solution dans le tube et incuber pendant cinq minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Diluer jusqu’au volume final avec 1x DPBS et ajouter 500 microlitres de solution sur des lamelles recouvertes de gélatine dans une plaque multipuits.

Incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius pour la polymérisation du collagène. Après l’incubation, retirez l’excès de collagène. Ajoutez des cellules pour un volume final de 500 microlitres et incubez les cellules à 37 degrés Celsius avant la fixation.

Ce type de matrices pourrait être modifié avec d’autres éléments matriciels tels que la fibronectine, la vitronectine ou le collagène de type IV. Pour ma part, je vais vous montrer comment réaliser l’immunofluorescence en utilisant Tks5, un marqueur des invadosomes, et comment quantifier les invadosomes linéaires sur des lamelles enrobées de collagène de type 1. Nous pouvons présenter les résultats par le nombre de cellules présentes dans les invadosomes linéaires, mais nous pouvons également présenter le nombre de structures dans chaque cellule.

Fixez les lamelles pendant 10 minutes dans 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Lavez deux fois avec 1x PBS et perméabilisez les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 10 minutes. Aliquote 50 microlitres de gouttelettes de solution d’anticorps primaires dans 4 % BSA dans 1x PBS sur un morceau de parafilm.

Placez chaque lamelle sur une gouttelette. Incuber pendant 40 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Lavez les lamelles deux fois avec 1x PBS et incubez les lamelles dans des anticorps secondaires, de la colloïdine et du colorant Hoechst pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.

Après l’incubation, laver deux fois avec 1x PBS, suivi d’eau distillée pour éliminer les sels. Montez les lamelles sur une lame de verre avec un support de montage polymérisant. Laissez la lame sécher toute la nuit à température ambiante avant l’imagerie.

Pour l’analyse d’images, acquérir une image de l’actine et de Tks5 de manière séquentielle à l’aide d’un microscope confocal. Pour quantifier la taille et le nombre d’invadosomes linéaires par cellule, utilisez le logiciel ImageJ et la macro fournie. Exécutez d’abord la macro dans ImageJ et ouvrez l’image d’actine.

Ensuite, ouvrez l’image Tks5. Définissez le seuil et appliquez la macro. Les résultats analysés apparaîtront dans deux tableaux.

Le nombre d’invadosomes linéaires par cellule et d’autres informations telles que le pourcentage de surface utilisée par les invadosomes linéaires dans la cellule seront indiqués dans le tableau récapitulatif. La taille de chaque invadosome linéaire sera indiquée dans le tableau des résultats. Après la quantification des images, nous pouvons présenter les résultats en montrant le nombre de structures par cellule.

Donc, de mon côté, nous adaptons une méthode pour mettre en évidence la présence d’invadosomes linéaires en 3D. Nous avons réalisé que le gel n’est composé que de fibrilles de collagène un et que ce test est utilisé pour évaluer l’invasion cellulaire dans le contexte du collagène un. Préparez une solution de collagène de type 1 sur glace à une concentration finale de deux mg par ml.

Ajouter le colorant fluorescent à une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Mélangez la solution et incubez sur de la glace pendant cinq minutes à l’abri de la lumière. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de glace 10x PBS.

Ajoutez ensuite 6,25 microlitres d’hydroxyde de sodium glacé à une molaire. Ajoutez de l’eau stérile pour obtenir la bonne concentration et mélangez la solution. Placez les inserts de la chambre Boyden dans une boîte de culture cellulaire multipuits.

Ajoutez 100 microlitres de collagène, une solution dans chaque insert. Pour polymériser le gel de collagène, incubez le plat pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajouter un milieu de culture cellulaire enrichi en sérum dans chaque puits et placer les inserts dans le milieu.

Ensemencez 30 000 cellules dans un milieu sans sérum sur le gel de collagène. Pour fixer les cellules, ajoutez une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans un puits vide. Retirez le milieu cellulaire de l’insert sans toucher le gel de collagène.

Placez l’insert dans des puits avec la solution de paraformaldéhyde à 4 % et ajoutez une solution supplémentaire de paraformaldéhyde à 4 % sur le gel de collagène. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après la fixation, retirez la solution de paraformaldéhyde à 4 % et lavez avec 1x PBS.

Après le lavage, le gel de collagène doit devenir transparent. Les inserts sont maintenant prêts pour l’immunofluorescence. Égouttez d’abord les inserts.

Placez ensuite les inserts dans de nouveaux puits de la plaque multipuits. Pour perméabiliser les cellules, ajoutez une solution de 0,2 % de Triton X-100 dans 1X PBS sur le gel de collagène pendant 30 minutes. Égouttez les inserts.

Lavez avec 1X PBS et ajoutez une solution d’anticorps primaires sur le gel de collagène pendant une heure à l’abri de la lumière. Retirez la solution d’anticorps primaire, lavez-la avec 1X PBS et incubez le gel de collagène avec la solution d’anticorps secondaire pendant 1,5 heure à l’abri de la lumière. Lavez la solution d’anticorps secondaire avec 1X PBS.

Pour préparer le gel de collagène au montage, coupez la membrane d’insertion avec un scalpel. Placez le gel de collagène fixé à la membrane dans un plat à fond de verre. Il est important que le haut du gel soit en contact avec le fond du plat.

Ajoutez un support de montage et une lamelle sur le dessus pour l’observation en microscopie. Avec ce test, nous avons démontré le rôle clé du récepteur DDR1 dans l’invasion cellulaire dans le gel de collagène. Ce test peut également être utilisé pour évaluer l’effet des médicaments sur l’invasion cellulaire.

Dans nos différentes études, nous avons démontré que le simple fait d’ajouter un nouvel élément de matrice extracellulaire dans sa confirmation physiologique, ici les fibrilles de collagène de type 1, peut modifier la morphologie, la composition moléculaire et l’activité des invadosomes. Donc, en utilisant les différents tests décrits dans ce film, nous avons démontré l’existence de nouvelles structures, d’une nouvelle organisation des invadosomes que nous avons nommés invadosomes linéaires. En générant des matrices complexes et plus physiologiques, nous permettons d’identifier de nouvelles voies impliquées dans l’addition, la migration et l’invasion cellulaires.