Un protocole optimisé pour l'analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

L'objectif général de cette procédure est de mesurer avec précision la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les lymphocytes à l'aide d'un dosage du flux extracellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunométabolisme, telles que les modifications métaboliques qui surviennent dans les cellules immunitaires lors de leur activation, de leur différenciation ou au cours d'une maladie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'analyse efficace et en temps réel des profils métaboliques de plus de 90 échantillons simultanément.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le métabolisme des lymphocytes, elle peut également être appliquée à d'autres cellules, y compris les cellules non adhérentes qui nécessitent l'ajout d'une plaque, avec une perturbation minimale de leur fonctionnalité. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les lymphocytes sont fragiles et requièrent une manipulation délicate pour préserver leur fonctionnalité et leur viabilité. La veille de l'expérience, soulevez la cartouche de capteurs de l'analyseur de flux extracellulaire et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microliters de solution calibrante.

Ensuite, abaissez la cartouche sur la plaque, en immergeant les capteurs dans la solution d'étalonnage, et incubez la cartouche toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone ni azote. Le lendemain matin, recouvrez chaque puits d'une plaque d'analyse de 96 puits avec 25 microlitres de solution adhésive et incubez la plaque à température ambiante pendant 20 minutes. À la fin de l'incubation, aspirez la solution adhésive et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d'eau stérile.

Pendant que la plaque sèche à l'air, placez un tamis cellulaire de 70 micromètres au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres et transférez les organes récoltés sur le tamis. À l'aide du piston d'une seringue stérile de trois millilitres, écrasez le tissu à travers le tamis, en gardant le filtre et les organes humides tout au long du processus de macération en ajoutant du tampon MS selon les besoins. Ensuite, rincez le tamis avec cinq à 10 millilitres de tampon MS, puis centrifugez la suspension cellulaire obtenue.

Resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de lyse des érythrocytes ACK. Après cinq minutes sur de la glace, réajuster la teneur avec 10 à 20 millilitres de tampon MS et centrifuger à nouveau les cellules. À la fin de la centrifugation, placer un tamis cellulaire de 30 microns au-dessus d'un tube conique de 15 millilitres et amorcer le tamis avec un millilitre de tampon MS.

Resuspendre les cellules dans cinq millilitres de tampon MS frais et filtrer la suspension cellulaire à travers le tamis afin d'éliminer les agrégats de globules rouges lysés. Ajouter quatre millilitres de tampon MS frais pour rincer le tube de lyse vide et faire passer le rinçage à travers le tamis. Compter les cellules et aliquoter un nombre approprié de splénocytes pour le dosage du flux extracellulaire.

Ensuite, mettre en pellet les deux lots de cellules, puis resuspendre l'échantillon de splénocytes destiné au test de flux extracellulaire dans cinq millilitres de milieu RF 10 sur de la glace. Resuspendre les cellules destinées à l'isolement par billes dans les volumes appropriés de cocktail d'anticorps biotinylés, de microbilles anti-biotine et de tampon MS, pendant les durées d'incubation indiquées à deux à huit degrés Celsius. À la fin de la deuxième incubation, récupérer les cellules par centrifugation et resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon MS frais par 1 × 10⁸ cellules.

Placez ensuite la colonne appropriée sur l'aimant de séparation et préparez la colonne en y ajoutant trois millilitres de tampon MS, en éliminant le flux traversant. Placez un tube conique stérile de 15 millilitres sous la colonne et chargez-y tout le volume de l'échantillon cellulaire. Rincez ensuite le tube d'incubation des cellules avec trois millilitres de tampon MS frais, en récupérant le lavage dans le tube conique.

Après avoir collecté le dernier éluat, compléter le tube à un volume final de 15 millilitres de tampon MS et centrifuger les cellules isolées négativement. Ensuite, resuspendre le culot dans cinq millilitres de milieu RF 10 frais sur de la glace. Pas plus de trois heures après l'isolement, centrifuger tous les échantillons cellulaires et resuspendre les culots dans cinq millilitres de milieu d'essai approprié pour une autre centrifugation.

Après la deuxième centrifugation, resuspendre les culots à la concentration expérimentale appropriée afin d'obtenir un volume final de 180 microlitres de cellules par puits dans un milieu d'essai frais, puis distribuer 180 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Ensuite, centrifuger la plaque pour fixer solidement les cellules au fond des puits, puis replacer la plaque dans l'incubateur.

Après 30 minutes, utilisez une micropipette pour charger les composés d'intérêt fraîchement préparés à 37 degrés Celsius dans les orifices d'injection appropriés de la cartouche de capteurs de l'analyseur de flux extracellulaire, en chargeant les orifices de contrôle de fond et non expérimentaux avec du milieu seul. Replacez la cartouche chargée dans l'incubateur et configurez le programme d'analyse du flux extracellulaire. Ensuite, chargez la cartouche et lancez le programme, en remplaçant la plaque d'étalonnage par la plaque d'analyse après l'étalonnage, comme indiqué.

Après le dosage du flux extracellulaire, procéder aux mesures de la teneur en protéines. Plus de 90 % de toutes les populations cellulaires sont viables, avec une pureté observée de 98 à 99 % pour les lymphocytes. La confluence de chaque type cellulaire est corrélée aux densités initiales de mise en culture.

Les concentrations en protéines du lysat sont linéairement corrélées aux densités de semis, ce qui confirme que les concentrations en protéines peuvent être utilisées pour normaliser avec précision les données de flux extracellulaires. Un nombre plus élevé de cellules est corrélé à un taux de consommation d'oxygène mesuré plus élevé, ainsi qu'à des réponses plus marquées aux inhibiteurs mitochondriaux. Des densités de semis plus élevées conduisent à des mesures similaires du taux de consommation d'oxygène normalisé chez les lymphocytes T et les splénocytes, tandis que cinq fois et 1,25 fois 10 à la puissance cinq cellules par puits donnent des mesures similaires du taux de consommation d'oxygène normalisé chez les cellules B.

Les paramètres de la respiration mitochondriale sont également corrélés linéairement avec les densités de semis. De plus, la faible fuite de protons indique que la majeure partie de la respiration de base est utilisée pour la synthèse d'ATP. Des densités de semis plus élevées entraînent des taux d'acidification extracellulaire plus élevés et des réponses plus importantes aux inhibiteurs mitochondriaux.

Les paramètres de la glycolyse sont linéairement corrélés aux densités de semis cellulaire, la densité élevée de semis s'avérant être la plus optimale pour un test de stress glycolytique réussi. Le glucose stimule légèrement la respiration mitochondriale, laquelle est inhibée par l'oligomycline, tandis que le 2-DG n'affecte pas de manière significative la consommation d'oxygène. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures si elle est correctement exécutée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les cellules sur de la glace avant l'analyse du flux extracellulaire et de compter et de semer les cellules avec précision. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la mesure du potentiel mitochondrial et de l'absorption du glucose, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'état métabolique des cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les lymphocytes et réaliser un dosage du flux extracellulaire.