Name: Un protocole optimisé pour lanalyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les lymphocytes de souris. Cette technique d'analyse de flux extracellulaire permet l'étude en temps réel du métabolisme immunitaire.

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Les auteurs remercient le Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pour son soutien et la discussion, Mme Ann Kim pour l’optimisation du protocole d’isolement des lymphocytes B, le Dr Joseph Brzostowski pour son aide avec la microscopie et Mme Mirna Peña pour l’entretien des animaux utilisés. Cette étude a été financée par les programmes de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’National Institute of Allergy and Infectious Diseases et du National Heart, Lung, and Blood Institute.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. Les frais d’accès ouvert pour cet article ont été fournis par Agilent Technologies.

Nous avons développé le protocole a permis l&#39;isolement efficace des sous-ensembles de lymphocytes purs et viables, qui ont ensuite été utilisés dans l&#39;analyse du flux extracellulaire à différentes concentrations, afin d&#39;évaluer les différences dans la glycolyse et la performance de la respiration mitochondriale. Ce protocole est conçu spécifiquement pour les lymphocytes et aborde les considérations particulières liées à ces types de cellules, comme une faible activité métabolique de base, de la fragilité, basse fréquence, et leur incapacité à adhérer à des plaques d&#39;essai. Par conséquent, par rapport à des protocoles publiés précédemment 11,12, notre méthode offre un guide plus pratique et mieux optimisé pour les chercheurs travaillant dans le domaine de l&#39; immunologie. Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, y compris l&#39;obtention des populations de cellules pures et viables, plaquant les cellules à confluence optimale, et en normalisant les extracellulaires mesures d&#39;analyse de flux à la concentration de protéine dans chaque puits. inombre de cellules étalées préside d&#39;abord pourrait à la fois être visualisées par microscopie optique et également être quantifiée en utilisant des mesures de concentration en protéines. La corrélation linéaire entre le nombre de cellules et la concentration en protéines a confirmé que la concentration de la protéine peut en effet être utilisé comme un moyen pour normaliser les effets des variations du nombre de cellules entre les différents puits. En normalisant les résultats d&#39; OCR ECAR et aux concentrations de protéine, nous avons montré que, malgré inférieure confluence des cellules, aussi peu que 2,5 x 10 5 cellules / puits pourraient être utilisés dans la plupart des dosages sans compromettre la qualité des données. Cependant, la limite inférieure de cellules qui peuvent être utilisés varient entre les types et les dosages cellulaires. Par exemple, tout en aussi peu que 1,25 x 10 5 cellules pourraient être utilisées pour cellules B mesures OCR, même 2,5 x 10 5 cellules / puits ne suffisaient pas pour évaluer la performance de la glycolyse du même type de cellule. Par conséquent, aussi longtemps que le nombre de cellules ne sont pas un facteur limitatif, le placage au-dessus90% de confluence, ce qui correspond approximativement à 5 x 10 5 lymphocytes / puits, est préférable. Une optimisation supplémentaire peut être requise lorsque des cellules de tailles différentes, telles que précédemment activés et des lymphocytes sont partiellement différenciées-utilisées. En outre, l&#39;utilisation de lymphocytes primaires préalablement cultivées, il peut y avoir une variation de la viabilité cellulaire entre les différentes conditions de traitement, ce qui diminuerait la fiabilité de la concentration de protéine en tant que mesure du nombre de cellules mortes depuis ou les cellules mourantes peuvent également contribuer à la teneur en protéines mesurée . Dans de tels cas, il pourrait être utile pour trier les cellules vivantes par cytométrie en flux avant d&#39;effectuer les analyses de flux extracellulaire. Dans nos tests utilisant des populations de lymphocytes fraîchement isolés et très viables, nous avons obtenu des données fonctionnelles fiables pour les deux mesures de l&#39;OCR et ECAR. Bien que tous les types de cellules se sont comportés de manière similaire dans le test de stress mitochondrial, des différences frappantes entre les types de cellules étaientobservée dans le test de stress de la glycolyse. Par exemple, la performance glycolytique des lymphocytes T naïfs était faible par rapport aux splénocytes ou les cellules B, et il n&#39;a pas changé avec l&#39;ajout d&#39;oligomycine. Cette observation est conforme aux études publiées antérieurement 7,30, ce qui confirme la validité de notre protocole. En conclusion, notre méthode offre un moyen efficace et pratique de tester l&#39;activité métabolique des lymphocytes en utilisant un analyseur de flux extracellulaire, et il peut être utile dans un large éventail d&#39;études immunologiques explorant les changements métaboliques dans les cellules immunitaires lors de l&#39;activation, la différenciation cellulaire ou en raison à des phénotypes de maladies telles que l&#39;infection, l&#39;auto-immunité et les hémopathies malignes.

La réponse immunitaire contre des antigènes est un équilibre étroitement régulé entre l&#39;activation immunitaire et la suppression immunitaire. Activation du système immunitaire entraîne une prolifération rapide et la migration cellulaires, ainsi que la production de cytokines, la sécrétion d&#39; anticorps et une augmentation de la phagocytose en réponse à l&#39; effet stimulant, tandis que la suppression immunitaire inhibe simplement ces événements et il est donc important dans la prévention des réponses immunitaires inutiles 1-6. Des études récentes ont montré qu&#39;une liaison directe entre l&#39;état d&#39;activation des cellules immunitaires et de l&#39;activité de diverses voies métaboliques 7. Les cellules immunitaires peuvent se déplacer entre repos et activés par les états de commutation d&#39;énergie produisant des voies et hors tension. En outre, il a été observé que différents types de cellules immunitaires peuvent utiliser différentes stratégies métaboliques pour alimenter les besoins accrus en énergie pendant l&#39;activation. Par exemple, tandis que l&#39; activation des lymphocytes T dirige les cellules dans un état presque complètement glycolytique 8 </sup&gt;, les lymphocytes B activés utiliser un équilibre de la glycolyse et la phosphorylation oxydative 9,10. Ces études soulignent l&#39;importance d&#39;étudier les effets de l&#39;activation des cellules immunitaires sur le métabolisme cellulaire. En temps réel, des mesures simultanées de taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) et le taux d&#39;acidification extracellulaire (ECAR), comme indicateurs de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, est une stratégie commune pour faire face aux états d&#39;énergie produisant des voies 11-13. Afin d&#39;atteindre cet objectif, un analyseur de flux extracellulaire, tel que le 96 Hippocampe XF, est couramment utilisé. Un tel instrument peut rapidement comparer les changements dans l&#39;OCR et ECAR pour tous les types de cellules ou sur différentes conditions de stimulation. Jusqu&#39;à présent, divers types de cellules, y compris les cellules du système immunitaire, ont été étudiées à l&#39;aide de ces dispositifs. Cependant, un protocole optimisé spécialement conçu pour les cellules immunitaires ne sont pas disponibles. Les cellules immunitaires, en particulier les lymphocytes, diffèrent d&#39;otses types cellulaires de plusieurs façons critiques. Les lymphocytes sont des cellules fragiles qui ne survivent pas pendant de longues durées dans des conditions ex vivo 14-16. Ceci est encore plus question quand ils sont cultivés dans des milieux de croissance suboptimale manque de nutriments essentiels, tels que ceux utilisés dans l&#39;analyse de flux extracellulaire. A la différence des macrophages et de nombreuses lignées cellulaires, les lymphocytes ne respectent pas les surfaces en plastique; il est donc essentiel de les attacher à la plaque d&#39;analyse sans générer de stress. Enfin, certaines sous - populations lymphocytaires peuvent être extrêmement rares et les récolter au, des quantités optimales requises pourraient être difficiles 17-19. Ici, nous fournissons un protocole optimisé qui est spécifiquement développé pour les lymphocytes. Utilisation de splénocytes, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 + naïfs isolés de la rate de la souris et les ganglions lymphatiques 20, nous montrons les caractéristiques de leur état de repos glycolyse et la phosphorylation oxydative à différent densités cellulaires. Les données ont été normalisées pour tenir compte des différences dans le nombre de cellules initiales pour chaque puits en mesurant le lysat cellulaire des concentrations de protéine de dosage d&#39;extrémité, qui sont directement proportionnelles aux nombres de cellules. Notre protocole fournit non seulement des lignes directrices pour l&#39;isolement rapide de lymphocytes viables pour les dosages de flux extracellulaire, mais il permet aussi de travailler à des concentrations cellulaires suboptimales sans compromettre la qualité des données.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7,2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Pour faire tampon MACS</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Pour faire tampon MACS</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8</td><td>Qualité Biologique</td><td>10128-446</td><td>Pour faire</td></tr> tampon <tr><td>MACS solution de rinçage autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Au lieu de PBS + EDTA pour faire tampon MS. Également utilisé dans autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contient du rouge de phénol et de la L-glutamine</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>Pour l’inactivation de la chaleur, décongeler la bouteille de bouillon congelé dans un 37 &deg ; C puis inactiver à 56 &deg ; C pendant 30 min. Sérum aliquote inactivé à la chaleur pour le stockage ( par exemple , en tubes coniques de 50 ml) et congélation à -20 &deg ; C jusqu’à ce que nécessaire.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combinez le Strep Pen Strep avec L-Glut 1:1 (si vous faites 500 ml de milieu, faites un total de 12 ml Pen Strep/L-Glut) ; maintenez les aliquotes à -20 &deg ; C jusqu’au moment de faire le support.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Composant du RF10 et du milieu de stress</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Composant du RF10 et du milieu de stress</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Composant de la solution d’acides aminés non essentiels RF10</td></tr><tr><td>MEM (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Composant du RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Composant du RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Seringue Monoject 3 ml, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Tubes à centrifuger coniques&nbsp ;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Utilisé dans l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Tubes à centrifuger coniques&nbsp ;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Utilisé dans l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Utilisé dans l’isolement</td></tr><tr><td>cellulaire CellTrics 30 &mu ; Filtre à cellules m, stérile, mono-emballé</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Kit d’isolement des cellules B, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Na&iuml ; ve CD4+ Kit d’isolement des cellules T, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Utilisé pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Utilisé pour</td></tr><tr><td>l’isolement cellulaire MidiSéparateur</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Aimant pour séparation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Support pour aimants</td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Solution de rinçage pour autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>Instrument de séparation autoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Adhésif cellulaire. Prenez soin de noter la concentration, car chaque lot est différent (le paquet est de 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophénol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Roténone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Halt Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Livré sous forme de cocktail 100x, combiner avec RIPA pour former 1x solution pour lyse.</td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Suivez les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Comprend des plaques de dosage, des cartouches, des guides de chargement pour le transfert des composés vers la cartouche de dosage et une solution d’étalonnage.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Utilisé pour préparer les milieux de test de stress</td></tr><tr><td>Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Unités de filtre sous vide stérile, 0,22 &mu ; m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Utilisé pour les médias filtrants stériles.</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>dissous à 0,1 M et utilisé pour diluer Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

un protocole optimisé pour l&#39;analyse glycolyse et mitochondrial respiration dans lymphocytes

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Les lymphocytes répondent à une variété de stimuli en activant les voies de signalisation intracellulaire, ce qui à son tour conduit à une rapide prolifération cellulaire, la migration et la différenciation et la production de cytokines. Tous ces événements sont étroitement liés à l&#39;état d&#39;énergie de la cellule, et d&#39;étudier ainsi les voies de production d&#39;énergie peut donner des indices sur la fonctionnalité globale de ces cellules. L&#39;analyseur de flux extracellulaire est un dispositif couramment utilisé pour évaluer la performance de la glycolyse et la respiration mitochondriale dans de nombreux types cellulaires. Ce système a été utilisé pour étudier les cellules immunitaires dans quelques rapports publiés, mais un protocole global optimisé en particulier pour les lymphocytes est manquant. Les lymphocytes sont des cellules fragiles qui survivent mal en conditions ex vivo. Souvent les sous-ensembles de lymphocytes sont rares, et de travailler avec un faible nombre de cellules est inévitable. Ainsi, une stratégie expérimentale qui traite de ces difficultés est nécessaire. Ici, nous fournissons un protocolequi permet l&#39;isolement rapide des lymphocytes viables à partir des tissus lymphoïdes, ainsi que pour l&#39;analyse de leurs états métaboliques dans l&#39;analyseur de flux extracellulaire. En outre, nous fournissons des résultats d&#39;expériences dans lesquelles on a comparé les activités métaboliques de plusieurs sous-types de lymphocytes à différentes densités cellulaires. Ces observations suggèrent que notre protocole peut être utilisé pour obtenir des résultats cohérents, bien standardisés, même à de faibles concentrations de cellules, et donc il peut avoir de vastes applications dans les futures études portant sur la caractérisation des événements métaboliques dans les cellules immunitaires.

L’étude du métabolisme devient de plus en plus pertinente pour la recherche immunologique. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les splénocytes de souris et les lymphocytes T et B.

Un protocole optimisé pour l&#39;analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer avec précision la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les lymphocytes à l'aide d'un dosage du flux extracellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunométabolisme, telles que les modifications métaboliques qui surviennent dans les cellules immunitaires lors de leur activation, de leur différenciation ou au cours d'une maladie. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'analyse efficace et en temps réel des profils métaboliques de plus de 90 échantillons simultanément.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le métabolisme des lymphocytes, elle peut également être appliquée à d'autres cellules, y compris les cellules non adhérentes qui nécessitent l'ajout d'une plaque, avec une perturbation minimale de leur fonctionnalité. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les lymphocytes sont fragiles et requièrent une manipulation délicate pour préserver leur fonctionnalité et leur viabilité. La veille de l'expérience, soulevez la cartouche de capteurs de l'analyseur de flux extracellulaire et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microliters de solution calibrante.Ensuite, abaissez la cartouche sur la plaque, en immergeant les capteurs dans la solution d'étalonnage, et incubez la cartouche toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone ni azote. Le lendemain matin, recouvrez chaque puits d'une plaque d'analyse de 96 puits avec 25 microlitres de solution adhésive et incubez la plaque à température ambiante pendant 20 minutes. À la fin de l'incubation, aspirez la solution adhésive et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d'eau stérile.Pendant que la plaque sèche à l'air, placez un tamis cellulaire de 70 micromètres au-dessus d'un tube conique de 50 millilitres et transférez les organes récoltés sur le tamis. À l'aide du piston d'une seringue stérile de trois millilitres, écrasez le tissu à travers le tamis, en gardant le filtre et les organes humides tout au long du processus de macération en ajoutant du tampon MS selon les besoins. Ensuite, rincez le tamis avec cinq à 10 millilitres de tampon MS, puis centrifugez la suspension cellulaire obtenue.Resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de lyse des érythrocytes ACK. Après cinq minutes sur de la glace, réajuster la teneur avec 10 à 20 millilitres de tampon MS et centrifuger à nouveau les cellules. À la fin de la centrifugation, placer un tamis cellulaire de 30 microns au-dessus d'un tube conique de 15 millilitres et amorcer le tamis avec un millilitre de tampon MS.Resuspendre les cellules dans cinq millilitres de tampon MS frais et filtrer la suspension cellulaire à travers le tamis afin d'éliminer les agrégats de globules rouges lysés. Ajouter quatre millilitres de tampon MS frais pour rincer le tube de lyse vide et faire passer le rinçage à travers le tamis. Compter les cellules et aliquoter un nombre approprié de splénocytes pour le dosage du flux extracellulaire.Ensuite, mettre en pellet les deux lots de cellules, puis resuspendre l'échantillon de splénocytes destiné au test de flux extracellulaire dans cinq millilitres de milieu RF 10 sur de la glace. Resuspendre les cellules destinées à l'isolement par billes dans les volumes appropriés de cocktail d'anticorps biotinylés, de microbilles anti-biotine et de tampon MS, pendant les durées d'incubation indiquées à deux à huit degrés Celsius. À la fin de la deuxième incubation, récupérer les cellules par centrifugation et resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon MS frais par 1 × 10⁸ cellules.Placez ensuite la colonne appropriée sur l'aimant de séparation et préparez la colonne en y ajoutant trois millilitres de tampon MS, en éliminant le flux traversant. Placez un tube conique stérile de 15 millilitres sous la colonne et chargez-y tout le volume de l'échantillon cellulaire. Rincez ensuite le tube d'incubation des cellules avec trois millilitres de tampon MS frais, en récupérant le lavage dans le tube conique.Après avoir collecté le dernier éluat, compléter le tube à un volume final de 15 millilitres de tampon MS et centrifuger les cellules isolées négativement. Ensuite, resuspendre le culot dans cinq millilitres de milieu RF 10 frais sur de la glace. Pas plus de trois heures après l'isolement, centrifuger tous les échantillons cellulaires et resuspendre les culots dans cinq millilitres de milieu d'essai approprié pour une autre centrifugation.Après la deuxième centrifugation, resuspendre les culots à la concentration expérimentale appropriée afin d'obtenir un volume final de 180 microlitres de cellules par puits dans un milieu d'essai frais, puis distribuer 180 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Ensuite, centrifuger la plaque pour fixer solidement les cellules au fond des puits, puis replacer la plaque dans l'incubateur.Après 30 minutes, utilisez une micropipette pour charger les composés d'intérêt fraîchement préparés à 37 degrés Celsius dans les orifices d'injection appropriés de la cartouche de capteurs de l'analyseur de flux extracellulaire, en chargeant les orifices de contrôle de fond et non expérimentaux avec du milieu seul. Replacez la cartouche chargée dans l'incubateur et configurez le programme d'analyse du flux extracellulaire. Ensuite, chargez la cartouche et lancez le programme, en remplaçant la plaque d'étalonnage par la plaque d'analyse après l'étalonnage, comme indiqué.Après le dosage du flux extracellulaire, procéder aux mesures de la teneur en protéines. Plus de 90 % de toutes les populations cellulaires sont viables, avec une pureté observée de 98 à 99 % pour les lymphocytes. La confluence de chaque type cellulaire est corrélée aux densités initiales de mise en culture.Les concentrations en protéines du lysat sont linéairement corrélées aux densités de semis, ce qui confirme que les concentrations en protéines peuvent être utilisées pour normaliser avec précision les données de flux extracellulaires. Un nombre plus élevé de cellules est corrélé à un taux de consommation d'oxygène mesuré plus élevé, ainsi qu'à des réponses plus marquées aux inhibiteurs mitochondriaux. Des densités de semis plus élevées conduisent à des mesures similaires du taux de consommation d'oxygène normalisé chez les lymphocytes T et les splénocytes, tandis que cinq fois et 1,25 fois 10 à la puissance cinq cellules par puits donnent des mesures similaires du taux de consommation d'oxygène normalisé chez les cellules B.Les paramètres de la respiration mitochondriale sont également corrélés linéairement avec les densités de semis. De plus, la faible fuite de protons indique que la majeure partie de la respiration de base est utilisée pour la synthèse d'ATP. Des densités de semis plus élevées entraînent des taux d'acidification extracellulaire plus élevés et des réponses plus importantes aux inhibiteurs mitochondriaux.Les paramètres de la glycolyse sont linéairement corrélés aux densités de semis cellulaire, la densité élevée de semis s'avérant être la plus optimale pour un test de stress glycolytique réussi. Le glucose stimule légèrement la respiration mitochondriale, laquelle est inhibée par l'oligomycline, tandis que le 2-DG n'affecte pas de manière significative la consommation d'oxygène. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures si elle est correctement exécutée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les cellules sur de la glace avant l'analyse du flux extracellulaire et de compter et de semer les cellules avec précision. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la mesure du potentiel mitochondrial et de l'absorption du glucose, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'état métabolique des cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les lymphocytes et réaliser un dosage du flux extracellulaire.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d'un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.

Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.

Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

La bioénergie des lymphocytes T CD8 peut être interrogée à l’aide du test de stress Mito. Cette méthodologie peut être utilisée pour étudier la programmation métabolique aiguë et chronique. Ce protocole décrit des approches pour examiner les relations entre la biologie des récepteurs des lymphocytes T et l’analyse bioénergétique.

Mesure de la fonction mitochondriale des lymphocytes T CD8 naïfs et effecteurs

La respiration mitochondriale dans les cellules entières de levure est un indicateur précieux de la bioénergétique cellulaire. Nous présentons ici un protocole pour quantifier ce phénotype applicable à différentes espèces de levures.

Quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules entières de levure

Ici, nous décrivons en détail les méthodes d’extraction des macrophages de la moelle osseuse, de la rate et du cœur infarctus, puis d’évaluation du flux métabolique dans les cellules vivantes.

Analyse du flux métabolique ex vivo dans les macrophages spléniques et cardiaques et les monocytes de la moelle osseuse

Ce protocole décrit une méthode rentable pour réaliser un test de résistance à la glycolyse afin de quantifier la reprogrammation métabolique dans la microglie primaire de la souris. Après isolement et stimulation inflammatoire, le taux d’acidification extracellulaire (RARE) est mesuré à l’aide de réactifs fraîchement préparés et ajustés en pH, suivi d’une normalisation des protéines afin de permettre une évaluation précise et reproductible des déplacements glycolytiques.

Étude de la glycolyse dans la microglie primaire à l’aide d’un test de flux extracellulaire

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Nous présentons notre protocole optimisé nucléofection à haut débit comme un moyen efficace de transfection humaines primaires dérivées de monocytes des cellules dendritiques avec soit l'ADN plasmidique ou siRNA sans causer la maturation des cellules. En outre, nous fournir des preuves pour faire taire les siARN réussie de gène ciblé RIG-I à la fois au niveau ARNm et des protéines.

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Découvrez une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les lymphocytes de souris. Cette technique d'analyse de flux extracellulaire permet l'étude en temps réel du métabolisme immunitaire.

Un protocole optimisé pour l'analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

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