Un protocole optimisé pour l'analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

L’objectif global de cette procédure est de mesurer avec précision la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les lymphocytes à l’aide d’un test de flux extracellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunométabolisme, telles que les changements métaboliques qui se produisent dans les cellules immunitaires lors de l’activation, de la différenciation ou au cours de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser efficacement et en temps réel les profils métaboliques de plus de 90 échantillons à la fois.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du métabolisme des lymphocytes, elle peut également être appliquée à d’autres cellules, y compris les cellules non adhérentes qui nécessitent l’ajout de plaques avec une perturbation minimale de leur fonctionnalité. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les lymphocytes sont fragiles et nécessitent une manipulation douce pour maintenir leur fonctionnalité et leur viabilité. La veille de l’expérience, soulevez la cartouche du capteur de l’analyseur de flux extracellulaire et remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 microlitres de solution de calibre.

Ensuite, abaissez la cartouche sur la plaque, immergez les capteurs dans la solution d’étalonnage et incubez la cartouche dans un incubateur à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone ni azote pendant la nuit. Le lendemain matin, enduire chaque puits d’une plaque de dosage de 96 puits avec 25 microlitres de solution adhésive et incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, aspirez l’adhésif et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’eau stérile.

Pendant que la plaque sèche à l’air, placez une passoire à cellules de 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres et transférez les organes prélevés sur la passoire. À l’aide du piston d’une seringue stérile de trois millilitres, écrasez le tissu à travers la passoire, en gardant le filtre et les organes humides tout au long du processus de macération, avec l’ajout d’un tampon MS si nécessaire. Ensuite, rincez la crépine avec cinq à 10 millilitres de tampon MS, puis centrifugez la suspension cellulaire résultante.

Remettez le granule en suspension dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges ACK. Après cinq minutes sur la glace, rétablissez la ténacité avec 10 à 20 millilitres de tampon MS et centrifugez à nouveau les cellules. À la fin de la centrifugation, placez une crépine à cellules de 30 microns sur un tube conique de 15 millilitres et amorcez la crépine avec un millilitre de tampon MS.

Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de tampon MS frais et filtrez la suspension cellulaire à travers la passoire pour éliminer les agrégats de globules rouges lysés. Ajoutez quatre millilitres de tampon MS frais pour rincer le tube de lyse vide et passez le lavage à travers la passoire. Comptez les cellules et aliquotez un nombre approprié de splénocytes pour le test de flux extracellulaire.

Ensuite, granulez les deux ensembles de cellules, en suspendant à nouveau l’échantillon de splénocytes pour le test de flux extracellulaire dans cinq millilitres de milieu RF 10 sur glace. Mettre en suspension les cellules pour l’isolement des billes dans les volumes appropriés de cocktail d’anticorps à la biotine, de microbilles anti-biotine et de tampon MS pendant les temps d’incubation indiqués à deux à huit degrés Celsius. À la fin de la deuxième incubation, recueillir les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 500 microlitres de tampon MS frais par une fois 10 dans les huit cellules.

Ensuite, chargez la colonne appropriée sur l’aimant de séparation et amorcez la colonne avec trois millilitres de tampon MS, en éliminant le flux. Placez un tube conique stérile de 15 millilitres sous la colonne et chargez la colonne avec tout le volume de l’échantillon cellulaire. Rincez ensuite le tube d’incubation cellulaire avec trois millilitres de tampon MS frais, en recueillant le lavage dans le tube conique.

Une fois que le dernier élu a été collecté, remplissez le tube jusqu’à un volume final de 15 millilitres de tampon MS et centrifugez les cellules isolées négativement. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu RF 10 frais sur de la glace. Au plus tard trois heures après l’isolement, centrifuger tous les échantillons de cellules et remettre les pastilles en suspension dans cinq millilitres du milieu de dosage approprié pour une autre centrifugation.

Après la deuxième centrifugation, remettre les pastilles en suspension à la concentration expérimentale appropriée pour obtenir un volume final de 180 microlitres de cellules par puits dans un milieu de dosage frais et déposer 180 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Ensuite, centrifugez la plaque pour faire adhérer solidement les cellules au fond des puits, puis remettez la plaque dans l’incubateur.

Après 30 minutes, utilisez une micro-pipette pour charger les composés d’intérêt à 37 degrés Celsius fraîchement préparés dans les ports d’injecteur appropriés de la cartouche de capteur de l’analyseur de flux extracellulaire, en chargeant tout arrière-plan de contrôle et les ports non expérimentaux avec le fluide seul. Remettez la cartouche chargée dans l’incubateur et configurez le programme de dosage des flux extracellulaires. Ensuite, chargez la cartouche et lancez le programme en remplaçant la plaque d’étalonnage par la plaque d’essai après l’étalonnage comme demandé.

Après le test de flux extracellulaire, procédez aux mesures de la teneur en protéines. Plus de 90 % de toutes les populations cellulaires sont viables, avec une pureté de 98 à 99 % observée pour les lymphocytes. La confluence de chaque type de cellule est en corrélation avec les densités initiales de placage.

Les concentrations en protéines du lysat sont en corrélation linéaire avec les densités de placage, ce qui confirme que les concentrations en protéines peuvent être utilisées pour normaliser avec précision les données de flux extracellulaires. Un nombre plus élevé de cellules est corrélé à un taux de consommation d’oxygène mesuré plus élevé, ainsi qu’à des réponses plus spectaculaires aux inhibiteurs mitochondriaux. Des densités de placage plus élevées entraînent des mesures similaires du taux de consommation d’oxygène normalisé dans les cellules T et les splénocytes, tandis que cinq et 1,25 fois 10 à cinq cellules par puits entraînent des mesures de taux de consommation d’oxygène normalisés similaires dans les cellules B.

Les paramètres de la respiration mitochondriale sont également corrélés linéairement avec les densités de placage. De plus, la faible fuite de protons indique que la majeure partie de la respiration de base est utilisée pour la synthèse de l’ATP. Des densités de placage plus élevées entraînent des taux d’acidification extracellulaire plus élevés et des réponses plus importantes aux inhibiteurs mitochondriaux.

Les paramètres de glycolyse sont linéairement corrélés avec les densités de placage cellulaire, la densité élevée de placage étant déterminée comme étant la plus optimale pour un test de stress de glycolyse réussi. Le glucose stimule légèrement la respiration mitochondriale qui est inhibée par l’oligomycine tandis que la 2-DG n’affecte pas de manière significative la consommation d’oxygène. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en six à huit heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules sur la glace avant l’analyse du flux extracellulaire et de compter et de plaquer avec précision les cellules. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que la mesure du potentiel mitochondrial et de l’absorption du glucose, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant l’état métabolique des cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les lymphocytes et d’effectuer un test de flux extracellulaire.