Efficace et Antibody Étiquetage par Strain promu Azide-alcyne cycloaddition spécifique du site

L’objectif global de cette procédure est d’introduire des sondes chimiques spécifiques dans un fragment d’anticorps en incorporant génétiquement un acide aminé contenant de l’azoture. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie chimique, telles que la modification, l’ingénierie et la conjugaison des protéines. Le principal avantage de cette technique est que votre sonde ou bouillon cible peut être introduit localement dans des protéines ou des anticorps par simple mélange.

Après avoir construit les plasmides, ajoutez un microlitre de chacun à 20 microlitres de la souche DH10-bêta d’E.Coli à une concentration de deux fois 10 à huit cellules par microlitre dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement la solution. Placez ensuite 20 microlitres de la solution mélangée dans une cuvette propre.

Réglez la machine d’électroporation sur 25 microfarads et 2,5 kilovolts. Insérez ensuite la cuvette dans la glissière de la chambre de choc. Poussez la glissière dans la chambre jusqu’à ce que la cuvette entre en contact ferme avec les électrodes de la chambre.

Appuyez une fois sur le bouton d’impulsion jusqu’à ce que la machine d’électroporation émette un bip. Après cela, ajoutez rapidement un millilitre de milieu SOC dans la cuvette. Transférez ensuite le mélange dans un tube à essai.

Incuber en secouant à 37 degrés Celsius pendant une heure. Une fois l’incubation terminée, étalez les cellules E.Coli transformées sur des plaques de gélose au bouillon de lysogénie contenant des antibiotiques appropriés. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 heures.

Une fois l’incubation sur plaque terminée, inoculer une seule colonie transformée dans cinq millilitres de milieu LB contenant des antibiotiques. Incuber en secouant pendant 12 heures à 37 degrés Celsius. Transférez ensuite la culture primaire dans 200 millilitres de milieu LB avec 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline et un millimolaire AF. Incuber en secouant à 37 degrés Celsius pendant au moins trois heures.

Ajouter deux millilitres d’arabinose 1,6 molaire lorsque la culture atteint une densité optique de 0,8 à 550 nanomètres. Ensuite, incubez en secouant à 30 degrés Celsius pendant 12 heures. Lorsque l’incubation est terminée, récoltez les cellules par centrifugation à 11 000 fois g pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et congelez la pastille à moins 20 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à lyser les cellules, remplacez la pastille en suspension dans 20 millilitres de tampon de lyse paraplasmique dans un tube de centrifugation frais. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 18 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un tube frais et jetez la pastille. Ajoutez ensuite 400 microlitres d’une suspension de résine Ni-NTA.

À l’aide d’un rotateur, agitez doucement le tube pendant une heure à quatre degrés Celsius. Une fois le mélange terminé, versez la suspension dans une colonne de polypropylène. Lavez la résine trois fois avec cinq millilitres de tampon de lavage.

Éluer l’anticorps cible avec 300 microlitres de tampon d’élution. Après cela, déterminez la concentration de la protéine mutante comme indiqué dans le protocole textuel. Commencez par ajouter 10 microlitres d’une solution de 10 micromolaires de HerFab-L177AF dans un tampon de phosphate contenant 10 millimolaires de phosphate de sodium dibasique et 100 millimolaires de chlorure de sodium dans un tube de centrifugation frais.

Ajoutez ensuite 20 microlitres d’une solution de 200 micromolaires d’azadibenzocyclooctyne Cy 5.5 dans de l’eau. Après cela, couvrez le récipient de réaction avec du papier d’aluminium. Laissez la réaction de cyclo-édition favorisée par la coloration se dérouler pendant six heures à 37 degrés Celsius.

Une fois la réaction terminée, ajoutez 30 microlitres d’échantillon et 450 microlitres de tampon phosphate pour laver le colorant Cy 5.5 libre dans une colonne de centrifugation de filtre. Centrifuger la colonne de centrifugation à 14 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le flux, puis transférez l’échantillon purifié dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Conservez l’HerFab purifié étiqueté à quatre degrés Celsius, à moins qu’il ne soit prêt pour l’analyse. Commencez par ajouter 13 microlitres de HerFab purifié à 7,8 micromolaires dans un tube frais. Ajoutez ensuite cinq microlitres de tampon d’échantillon de protéine LDS.

Incuber le mélange à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, fixez la cassette de gel Bis-Tris SDS-PAGE à 12 % à la cellule d’électrophorèse. Ajouter un tampon de fonctionnement.

Ensuite, chargez les échantillons de protéines conjuguées dans le calibreur de poids moléculaire pré-coloré. Effectuez une électrophorèse sur gel pendant 35 minutes à 200 volts. Une fois l’électrophorèse terminée, transférez le gel dans un système de documentation et d’analyse du gel.

Recherchez Cy 5,5, puis colorez le gel avec une coloration protéique commerciale. Dans cette étude, le fragment d’anticorps Her-Fab est conjugué à un site spécifique avec un Ce qui est accompli en incorporant un acide aminé contenant de l’azoture dans le fragment, puis en faisant réagir le fragment d’anticorps mutant avec un cyclooctyne déformé. L’analyse SDS-PAGE est effectuée pour les protéines mutantes exprimées avec et sans l’acide aminé contenant de l’azoture.

Comme on peut le voir, le fragment d’anticorps complet n’a été obtenu qu’en présence de l’acide aminé. La conjugaison de l’anticorps contenant l’acide aminé est évaluée par réaction avec un dérivé de l’azadibenzocyclooctyne lié à Cy 5.5, Cy 5.5, et analysée par SDS-PAGE. Les images de fluorescence montrent une conjugaison du fragment d’anticorps mutant avec Cy 5.5 alors qu’aucune conjugaison n’a été observée chez le témoin.

Une fois que vous avez correctement exprimé et purifié votre protéine avec de l’acétylphénylalanine, la protéine peut être efficacement marquée avec une sonde avec la souche. Parce que la réaction de marquage ne nécessite aucun réactif supplémentaire, vous pouvez introduire la sonde dans votre protéine cible en mélangeant simplement la sonde avec votre protéine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’introduire une sonde chimique spécifique au site dans un fragment d’anticorps en incorporant génétiquement un acide aminé contenant de l’azoture.