Name: Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez l'induction de la différenciation chondrogène des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge. Cette méthode sans cytokines favorise l'expression de SOX9 pour la réparation cartilagineuse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par une subvention du Projet coréen de R&D sur la technologie de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financée par le ministère de la Santé et du Bien-être social de la République de Corée (numéro de subvention : HI14C2116) et par le Fonds de recherche de l’hôpital St. Mary de Séoul, Université catholique de Corée.

Ce protocole d&#39;étude a été approuvé par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit. Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture <ol><li> La culture cellulaire et la récolte <ol><li> ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, éliminer le milieu et laver les cellules avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Ajouter 1 ml de PBS contenant de l&#39; EDTA 1 mM et on incube pendant 2 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Appuyez sur la plaque de culture doucement, ajouter 4 ml de milieu frais, transférer les cellules àun tube conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 250 xg pendant 2 minutes à la température ambiante (TA). </li></ol></li><li> Centrifuge chargement gravitaire <ol><li> Après centrifugation (étape 1.1.4), retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-LG avec 10% de FBS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> CG pour le chargement, transférer 2,5 x 10 5 cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml et on centrifuge à 2400 x g pendant 15 min. </li></ol></li><li> culture Pellet <ol><li> Immédiatement après la centrifugation, Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de différenciation chondrogénique définie (MDP-DMEM riche en glucose supplémenté avec 1% de FBS, 1% de ITS + Prémix, 100 nM de dexaméthasone, d&#39;une solution d&#39;acides aminés 1 x MEM non essentiels, 50 pg / ml de L-proline, et 1% de pénicilline / streptomycine). Ajouter 50 pg / ml fraîchement préparée de l&#39;acide L-ascorbique 2-phosphate, à chaque changement de milieu. En tant que contrôle positif, induisent differentiati chondrogéniquesdans les cellules non centrifugé en ajoutant MCD contenant 10 ng / ml de TGF-β1. </li><li> Placer les tubes coiffés de manière lâche contenant les pastilles dans une position debout et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Changer le milieu tous les jours pendant 3 semaines. </li></ol></li><li> culture Micromass <ol><li> Immédiatement après centrifugation (étape 1.2.2; 2400 × g pendant 15 min), aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 pi de MDP. </li><li> Pour former un Micromass, placer les cellules remises en suspension au centre d&#39;un puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li><li> Après 2 h, ajouter avec précaution 1 ml de MDP au bien, pipetage contre le mur de la plaque pour éviter de perturber l&#39;micromasse. En tant que contrôle positif, effectuer une culture de micromasse avec des cellules non centrifugés en ajoutant CDM contenant 10 ng / ml de TGF-β1. </li><li> Incuber la micromasse à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2. </li><li> Changez le ev moyenEry autre jour pendant 3 semaines. </li></ol></li></ol> 2. transcriptase inverse-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour détecter transcriptionnelle de régulation positive Chondrogène Différenciation Marqueurs <ol><li> Au jour 14, utiliser une pipette pour transférer les pastilles de sphéroïdes dans un nouveau tube de 1,5 ml et les laver dans PBS 1x. </li><li> Extraire l&#39;ARN total à partir des pastilles en utilisant le thiocyanate-phénol-chloroforme méthode 9 d&#39;extraction de guanidinium. </li><li> Synthétiser un ADNc à partir de 2 pg d&#39;ARN total en utilisant une transcriptase inverse selon le protocole du fabricant (incuber à 42 ° C pendant 1 h et ensuite inactiver l&#39;enzyme à 70 ° C pendant 5 min). </li><li> Effectuer une PCR avec des amorces spécifiques pour les marqueurs de 10 différenciation chondrocytaire. </li></ol> 3. Coloration pour détecter la surexpression de chondrogéniques Différenciation Marqueur Protéines <ol><li> culots cellulaires Paraffin-enrobage <ol><li> Au jour 21,utiliser une pipette pour récolter les granulés sphéroïdes et les laver avec PBS 1x. </li><li> Fixer les granules sphéroïdaux par immersion dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h. Attention: paraformaldéhyde est hautement toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l&#39;exposition et éviter l&#39;inhalation lors de la préparation. Porter un équipement de protection individuelle approprié. </li><li> Jeter le fixateur et rincer les pastilles de cellules avec de l&#39;eau déminéralisée (DW). </li><li> Placer une couche de gaze sur la cassette et transférer les pastilles fixes à l&#39;aide d&#39;une pipette. Couvrir le culot par pliage de la gaze et fermer le couvercle de la cassette. </li><li> Déshydrater les pellets. <ol><li> Immerger les pastilles dans 70% d&#39;éthanol (EtOH) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Immerger les pastilles dans 80% de EtOH pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Immerger les pastilles dans EtOH à 95% pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Immerger les pastilles dans EtOH à 100% pendant 5 min à température ambiante. Répéter deux fois. </li><li> Immerger les pastilles dans 100% de xylène pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez twice. </li></ol></li><li> Incorporer les culots de cellules fixes dans la paraffine à 56 ° C dans un moule; les pastilles peuvent être incorporées dans de la paraffine en utilisant des systèmes de traitement de tissu automatisé spécialisés. </li><li> Couper les sections 5 um d&#39;épaisseur à partir du culot cellulaire inclus dans la paraffine en utilisant un microtome rotatif. </li><li> Float les sections dans 50% EtOH puis les transférer à un bain à 50 ° de l&#39;eau en utilisant une diapositive. </li><li> Placez les sections flottantes sur des lames. </li></ol></li><li> Safranine O et coloration au bleu Alcian <ol><li> Réhydrater les sections de paraffine. <ol><li> Immerger les lames dans du xylène pendant 15 min. Répéter deux fois. </li><li> Immerger les lames dans EtOH à 100% pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Immerger les lames dans 90% de EtOH pendant 5 min. </li><li> Immerger les lames dans 80% EtOH pendant 5 min. </li><li> Immerger les lames dans 70% EtOH pendant 5 min, puis lavez-les dans PBS 1x. </li></ol></li><li> Colorer les sections réhydratés avec 1% solution safranine O et 3% de bleu Alcian pour30 minutes. </li><li> Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW. </li><li> Colorer les sections avec une solution hématoxyline / éosine (colorante de) pendant 1 min. </li><li> Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW. </li><li> Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l&#39;eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur la lamelle contenant le milieu de montage. </li><li> Laisser les lames sécher pendant 2-3 h à température ambiante. </li><li> Capture d&#39;images en utilisant un microscope à champ lumineux (microscope droit automatisé, 50X et 200X). </li></ol></li><li> immunofluorescence <ol><li> Réhydrater les sections comme décrit dans la section 3.2.1. </li><li> Immerger les lames dans du tampon citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), puis de les maintenir à une température sub-bouillante pendant 10 minutes en utilisant un four micro-ondes. </li><li> Refroidir les lames pendant 20 min à température ambiante, puis les laver avec de l&#39;eau du robinet. </li><li> Incuber les lames dans 3%H 2 O 2 (1x PBS) pendant 15 min, puis les laver avec de l&#39; eau du robinet pendant 15 min 11. </li><li> Bloquer les lames avec un tampon de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du PBS) pendant 1 h. </li><li> Aspirer la solution de blocage, et ensuite appliquer un anticorps primaire dilué avec 5% de sérum de chèvre normal sur les lames. </li><li> Incuber les lames pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les lames trois fois en 1x PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber les lames dans un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome dilué avec 5% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les lames trois fois dans du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois dans l&#39;obscurité. </li><li> Incuber les lames avec DAPI (1 pg / ml) pendant 10 min, puis lavez-les deux fois en 1x PBS pendant 5 minutes chacun. </li><li> Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l&#39;eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur le support de montage. </li><li> Laisser les lames sécher pendant 2-3h dans l&#39;obscurité à la température ambiante. </li><li> Visualisez les diapositives en utilisant la microscopie à fluorescence (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X et 200X) 12. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li>
<li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li>
<li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li>
<li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li>
<li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li>
<li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+%28hTERT%29+re-appraised%3A+nucleolin+and+telomerase+cross+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).</li>
<li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li>
<li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li>
<li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1%28II%29+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
<li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).</li>
</ol>

Nous déclarons que nous n’avons aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.

L&#39;état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l&#39;expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu&#39;à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l&#39;expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG. <p class="jove_content"...

Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d&#39;altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l&#39;acquisition d&#39;un nombre suffisant de cellules souches et l&#39;induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l&#39;isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d&#39;acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d&#39;isoler des cellules souches du tissu adipeux et d&#39; induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 1, 2. Ces méthodes sont efficaces mais coûteux. Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire 3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK 4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes 5 chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l&#39;expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines 6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l&#39; expression différentielle des gènes dans les cellules 7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l&#39; épithélium du poumon, l&#39;expression de l&#39; interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation 8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l&#39;expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches. Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Plat</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plat</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Milieux de culture Matériaux</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084</td><td>milieu de base</td></tr><tr><td>de croissance Pénicilline Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1 %</td></tr> <tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10 %</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Matériaux de différenciation chondrogénique</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>Milieu de base de différenciation chondrogénique</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine Life</td><td>Technologies</td><td>P4333</td><td>1 %</td></tr> <tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1 %</td></tr><tr><td>Ascorbate-2-phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956 ; g/mL</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956 ; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1 %</td></tr> <tr><td>TGF&bêta humain ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Vecteur Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagène II</td><td>anticorps abcam&nbsp ;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 594</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonde moléculaire</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold anti-fade</td><td>réactif Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass, Coated</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>Chargement étoile</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) Marqueur d’échelle d’ADN</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux (ASCs)</td><td>Cellules MASTER catholiques</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chondrogène différenciation induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Le cartilage altéré ne peut pas guérir naturellement. Actuellement, la thérapie la plus avancée pour les défauts du cartilage est la transplantation de chondrocytes différenciés des cellules souches à l’aide de cytokines. Malheureusement, la différenciation chondrogénique induite par les cytokines est coûteuse, prend du temps et est associée à un risque élevé de contamination lors de la différenciation in vitro. Cependant, les stimuli biomécaniques servent également de facteurs régulateurs cruciaux pour la chondrogenèse. Par exemple, le stress mécanique peut induire une différenciation chondrogénique des cellules souches, suggérant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Dans cette étude, nous avons démontré que la gravité centrifuge (CG, 2 400 × g), une contrainte mécanique facilement appliquée par centrifugation, induisait la régulation positive de la région déterminante du sexe Y (SRY)-box 9 (SOX9) dans les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC), les amenant à exprimer des phénotypes chondrogéniques. Les ASC centrifugés ont exprimé des niveaux plus élevés de marqueurs de différenciation chondrogéniques, tels que l’aggrécan (ACAN), le collagène de type 2 alpha 1 (COL2A1) et le collagène de type 1 (COL1), mais des niveaux plus faibles de collagène de type 10 (COL10), un marqueur des chondrocytes hypertrophiques. De plus, la formation d’agrégats chondrogéniques, condition préalable à la chondrogenèse, a été observée dans les ASC centrifugés.

gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux. Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur des plaques de cul...

Le stress mécanique peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches, fournissant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Nous présentons un protocole pour induire la différenciation chondrogénique des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) en utilisant la gravité centrifuge (CG). La régulation positive de SOX9 induite par CG entraîne le développement de phénotypes chondrogéniques.

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

L’objectif global de cette procédure est d’induire une différenciation chondrogénique des ASC pour la réparation défectueuse du cartilage. Cette méthode consiste à induire la différenciation préchondrogénique des ASC en utilisant la force de gravité centrifuge. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la différenciation chondrogénique des ASC, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la différenciation ostéogénique et fibrogénique.Le principal avantage de cette technique est que la différenciation chondrogénique peut être facilement induite à partir de cellules souches sans traiter de cytokines. Yeri Alice Rim et Yoojun Nam de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure. Commencez par récolter 80 % de cellules souches confluentes dérivées du tissu adipeux dans une boîte de culture de 100 millilitres en jetant le milieu et en le lavant avec cinq millilitres de PBS.Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS contenant un millimolaire d’EDTA et incubez pendant deux minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après deux minutes, tapotez doucement la plaque de culture, puis ajoutez quatre millilitre

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit l’isolement de cellules souches dérivées du tissu adipeux de porc (pADSC) dans des tissus adipeux sous-cutanés avec examen de la multipotence. Les pADSC multipotents sont utilisés pour délimiter les processus de différenciation des adipocytes et étudier la transdifférenciation en plusieurs lignées cellulaires de mésenchyme mésodermique ou d’autres lignées d’ectoderme et d’endoderme pour des études régénératives.

Isolement et différenciation des cellules souches adipeuses de porcines sous-cutanée des tissus adipeux

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Nous présentons un protocole pour générer une lignée chondrogénique à partir de sang périphérique humain (PB) via des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en utilisant une méthode sans intégration, qui comprend la formation de corps embryoïde (EB), l'expansion des cellules fibroblastiques et l'induction chondrogénique.

Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Une méthode pour obtenir nanopatterns inégale dendrimère-basé qui permettent le contrôle de l’échelle nanométrique d’arginine-glycine-aspartique acide (RGD) surface densité locale est décrite et appliquée pour l’étude de la différenciation cellulaire adhésion et chondrogéniques.

Nanopatterns inégale dendrimère-basé à localement gouvernes adhésivité : une méthode pour diriger la différenciation chondrogéniques

Ce protocole vise à tester la capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain périvasculaire se différencier en plusieurs lignées cellulaires. La différenciation a été comparée à des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine, qui est appelée à se différencier en adipocytes et ostéocytaires chondrocyte lignées.

Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux

Nous présentons un protocole pour l’isolement, la culture, et l’induction adipogenic des cellules souches adipeuses dérivées de crête neurale (NCADSCs) du tissu adipeux périortique de Wnt-1 Cre-/-; Rosa26RFP / souris. Les NCADSC peuvent être une source facilement accessible d’ADSCs pour la modélisation de l’adipogénèse ou de la lipogenèse in vitro.

Isolement, culture et induction adipogénique des cellules souches adipeuses originales dérivées de l’adipose de l’adipose de l’adiacisation périortique

Ce protocole décrit une méthodologie pour isoler et identifier les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSM) de rats Sprague Dawley.

Isolement et identification de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de rats Sprague Dawley

Le tissu adipeux est une excellente source de cellules souches mésenchymateuses. Ici, nous apportons étape par étape l’extraction, la culture et la caractérisation de cellules souches dérivées du tissu adipeux adipeux (ADSC) à partir de tissu adipeux épididymaire de souris suisses.

Isolement, expansion in vitro et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux épididymaire de souris

Cette étude décrit une méthode de production de sphéroïdes chondrocytaires en agrégeant des cellules en sphéroïdes dans des conditions de faible adhésion à l’aide de la gravité, suivie de la culture des sphéroïdes résultants dans des mini-bioréacteurs.

Génération de sphéroïdes à partir de divers chondrocytes à l’aide de conditions à faible adhérence sous gravité et de mini-bioréacteurs faits maison

Découvrez l'induction de la différenciation chondrogène des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge. Cette méthode sans cytokines favorise l'expression de SOX9 pour la réparation cartilagineuse.

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Explorer plus de vidéos