Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

L’objectif global de cette procédure est d’induire une différenciation chondrogénique des ASC pour la réparation défectueuse du cartilage. Cette méthode consiste à induire la différenciation préchondrogénique des ASC en utilisant la force de gravité centrifuge. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la différenciation chondrogénique des ASC, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la différenciation ostéogénique et fibrogénique.

Le principal avantage de cette technique est que la différenciation chondrogénique peut être facilement induite à partir de cellules souches sans traiter de cytokines. Yeri Alice Rim et Yoojun Nam de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure. Commencez par récolter 80 % de cellules souches confluentes dérivées du tissu adipeux dans une boîte de culture de 100 millilitres en jetant le milieu et en le lavant avec cinq millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS contenant un millimolaire d’EDTA et incubez pendant deux minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après deux minutes, tapotez doucement la plaque de culture, puis ajoutez quatre millilitres de milieu frais et transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 250 fois g pendant deux minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, retirer le surnageant sans déranger la pastille. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Pour le chargement par gravité centrifuge, transférez 2,5 fois dix à la cinquième cellule dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et centrifugez à 2400 fois g pendant 15 minutes. Après la centrifugation, passez à la culture en granulés ou en micromasse. Immédiatement après la centrifugation, aspirer le surnageant et à 500 microlitres de milieu de différenciation chondrogénique, ou CDM, et 50 microgrammes par millilitre d’acide L-ascorbique 2-phosphate fraîchement préparé dans la pastille.

Un contrôle positif, induit une différenciation chondrogénique et collecte ses cellules en ajoutant du CDM contenant 10 nanogrammes par millilitre de TGF-bêta-1. Fermez les tubes sans serrer et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant trois semaines. Immédiatement après la centrifugation par gravité, aspirer le surnageant et remettre le granulé en suspension dans 10 microlitres de CDM.

Pour former une micromasse, pipetez les cellules remises en suspension au centre d’un puits d’une plaque de 24 puits, puis placez la plaque dans l’incubateur. Après deux heures, ajoutez soigneusement 500 microlitres de CDM dans le puits, en pipetant contre la paroi de la plaque pour éviter de perturber la micromasse. En tant que contrôle positif, effectuez une culture de micromasse avec des cellules non centrifugées en ajoutant du CDM contenant 10 nanogrammes par millilitre de TGF-bêta-1.

Incuber la micromasse pendant trois semaines. Le 21e jour après la formation de la micromasse, utilisez une pipette pour récolter les granules sphéroïdes, puis lavez-les avec 1X PBS. Fixez les pastilles sphéroïdes par immersion dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 24 heures.

Le lendemain, jetez le fixateur et rincez les granules cellulaires avec de l’eau déminéralisée. Placez une couche de gaze sur la cassette de tissu et transférez les pastilles de sphéroïde fixées à l’aide d’une pipette. Couvrez le granulé en pliant la gaze et fermez le couvercle de la cassette.

Ensuite, déshydratez les pastilles sphéroïdes par immersion dans de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, continuez à travers une série de concentrations d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Plongez ensuite les granulés dans du xylène à 100 % pendant 15 minutes.

Plongez les pastilles sphéroïdes dans de la paraffine à 56 degrés Celsius pour l’enrobage. Ensuite, coupez des sections de cinq microns d’épaisseur dans la pastille de cellule enrobée de paraffine à l’aide d’un microtome rotatif. Faites flotter les sections dans de l’éthanol à 50 %, puis transférez-les dans un bain-marie à 50 degrés Celsius.

Montez les sections flottantes sur des lames, puis passez à la safranine o et au bleu alcian pour la coloration immuno-fluorescente. Pour déterminer une force de gravité centrifuge appropriée, les ASC ont été lancés à une gravité centrifuge de zéro, 300, 600, 1, 200 et 2, 400 fois g pendant quinze minutes. L’expression de l’ARNm de SOX9 a été évaluée 24 heures après la stimulation CG.

Une CG de 2 400 fois g a induit de manière significative l’expression de l’ARNm SOX9. Pour évaluer l’expression des gènes liés à la chondrogenèse, l’ARN total a été extrait d’ASC non stimulés, d’ASC qui avaient été centrifugés ou traités avec du TGF-bêta-one. Comme on le voit ici, la stimulation CG induit l’expression du collagène de type 2 et de l’agrégat.

la surexpression du collagène de type 2 dans les ASC traités par CG a été confirmée par immunofluorescence à l’aide d’un anticorps contre le collagène de type 2 dans un anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 594. Pour déterminer l’effet de la CG sur la surexpression de la MEC liée à la chondrogenèse, les ASC ont été traitées avec du TGF-bêta-one comme contrôle positif. Le témoin négatif était une culture de granulés non soumise à une charge CG ou à un traitement au TGF-bêta-one.

La surexpression de la MEC liée à la chondrogenèse a été évaluée dans des pastilles sphéroïdes constituées d’ASC centrifugés par l’utilisation de la safranine o et de la coloration au bleu d’alcian. Le glycosaminoglycane, un composant majeur du cartilage articulaire, a été coloré en bleu par le bleu alcian ou en orange par la safranine o. Après 14 jours de culture de micromasse, la condensation des chondrocytes a été évaluée par la taille des agrégats.

La taille de chaque agrégat, générée par CG, était d’environ 0,5 millimètre. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 minutes, si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire la différenciation chondogénique des cellules souches en utilisant la force de gravité centrifuge.