Métagénomique Analyse des Ensilage

L’objectif général de cette expérience est de comprendre la communauté bactérienne présente dans un échantillon d’ensilage, bien que ces procédures puissent être appliquées à une gamme de différents types d’échantillons. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés lors de l’identification des communautés procaryotes présentes dans des systèmes microbiens complexes, comme dans le cas présenté ici, l’ensilage pour l’alimentation animale. Le principal avantage de cette technique est que le séquençage shotgun est utilisé plutôt que le séquençage d’amplicon 16S plus conventionnel, ce qui permet une bien plus grande précision lors de la classification du microbiome.

Cette méthode peut être appliquée à un large éventail d’autres échantillons où des microcosmes complexes peuvent se former, comme dans l’intestin humain, à la surface de la peau, dans des échantillons d’eau ou même autour de la machine à café du bureau. Un kit commercial est utilisé pour extraire l’ADN de l’échantillon d’ensilage. Commencez cette procédure en ajoutant 100 à 400 milligrammes de l’échantillon à 978 microlitres de tampon de phosphate de sodium et 122 microlitres de tampon de lyse du sol dans le tube de lyse fourni.

Inclure un témoin négatif qui n’a pas d’échantillon d’ensilage. Homogénéisez les échantillons en plaçant les tubes de lyse dans l’homogénéisateur pendant 40 secondes à une vitesse de 6,0 mètres par seconde. Centrifugez les lysats pendant 15 minutes.

Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre contenant 250 microlitres de solution de précipité de protéines et mélangez la solution en l’inversant 10 fois. Puis centrifuger pendant cinq minutes. Transférez le surnageant dans un tube à centrifuger propre de 15 millilitres contenant un millilitre de matrice de liaison à l’ADN.

Mélangez la solution en inversant constamment le tube pendant trois minutes. Laissez le mélange reposer pendant trois minutes, puis jetez 500 microlitres de surnageant et mélangez le surnageant restant par pipetage. Transférez 600 microlitres de suspension dans un filtre à essorage et centrifugez à 14 000 fois G pendant une minute.

Jetez le filtrat et répétez le processus avec la suspension restante. Après avoir jeté le filtrat, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage à la matrice de liaison à l’ADN dans le filtre de spin, mélangez par pipetage et centrifugez à 14 000 fois G pendant une minute. Jetez le filtrat et centrifugez le filtre d’essorage pendant deux minutes pour vous assurer que tout le tampon de lavage est retiré.

Séchez le filtre d’essorage à 23 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez 100 microlitres d’eau préchauffée sans DNase à la matrice de liaison à l’ADN et transférez le filtre de spin dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre. Centrifuger à 14 000 fois G pendant une minute pour éluer l’ADN.

Conservez l’ADN à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que vous ayez besoin d’une analyse plus approfondie. L’ADN extrait des échantillons d’ensilage sera purifié à l’aide de billes de purification de l’ADN. Sortez les perles du réfrigérateur et laissez-les à 23 degrés Celsius au moins 30 minutes avant de les utiliser.

Ajoutez deux volumes de billes à chaque échantillon d’ADN et incubez la solution à 23 degrés Celsius pendant cinq minutes. Placez les échantillons sur un aimant de séparation pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant. Lavez les perles deux fois avec 200 microlitres d’éthanol frais à 80 %.

Faites sécher les perles à l’air libre pendant 10 minutes Les perles doivent être suffisamment sèches, mais pas trop sèches, il est donc crucial d’inspecter visuellement les billes avant de continuer. Retirez les échantillons de l’aimant de séparation, ajoutez 50 microlitres de tampon d’élution et mélangez par pipetage. Incuber la suspension à 23 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis replacer les échantillons sur l’aimant de séparation pendant trois minutes.

Transférez le surnageant qui contient l’ADN dans un tube propre et jetez les billes. Pour commencer cette procédure, préparez une solution de travail en utilisant un rapport tampon/réactif de 199 pour un. Ajoutez 10 microlitres de chaque étalon d’ADN à 190 microlitres de solution de travail.

Ajoutez 10 microlitres d’ADN purifié à 190 microlitres de solution de travail. Incuber l’étalon et les échantillons d’ADN à 23 degrés Celsius pendant deux minutes. Par la suite, analysez les étalons avant les échantillons d’ADN sur le fluorimètre en suivant les instructions à l’écran.

Il est essentiel que l’ADN purifié soit de bonne qualité et quantifié avec précision, donc s’il y a un doute concernant la qualité et la concentration de l’ADN, l’extraction de l’ADN doit être répétée. La bibliothèque de séquençage shotgun est préparée à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque commerciale. Diluez les échantillons d’ADN à 0,2 nanogramme par microlitre à l’aide d’un tampon d’élution.

Mélangez cinq microlitres d’ADN purifié avec 10 microlitres de tampon de marquage et cinq microlitres de mélange d’enzymes de marquage. Incuber les échantillons à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez cinq microlitres de tampon neutralisant à chaque échantillon et incubez la solution à 23 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres de chacun des indices de séquençage spécifiques à l’échantillon et 15 microlitres du mastermix PCR. Placez les échantillons dans un thermocycleur et effectuez une PCR. Purifier l’ADN préparé à l’aide de la méthode de purification des billes comme démontré précédemment, mais avec une élution finale de 30 microlitres de tampon d’élution.

Par la suite, l’ADN est séquencé et une gamme d’outils bioinformatiques est utilisée pour analyser les données de séquençage comme décrit dans le protocole texte. La classification taxonomique du microbiome bactérien a été effectuée à l’aide du logiciel Kracken, puis visualisée à l’aide du logiciel CHROMA. La majorité des espèces bactériennes présentes dans le métagénome de l’ensilage se trouvent dans quatre filales procaryotes, les firmicutes à 34 %, les actinobactéries à 28 %, les protéobactéries à 27 % et les bactoroïtes à 7 %. La distribution des classes présentes dans ces filés est également indiquée.

L’annotation fonctionnelle effectuée sur des lectures assemblées a donné lieu à 6 357 protéines prédites annotées comme une enzyme active glucidique présumée et l’une des cinq classes d’enzymes qui composent la base de données d’enzymes actives glucidiques. Ce diagramme de Venn montre la distribution des annotations de protéines, y compris celles contenant plus d’une annotation de classe d’enzyme. Parmi ceux-ci, 3 591 ont été prédits pour avoir une activité glycoside hydrolase.

Une fois maîtrisée, la préparation des banques de séquençage de l’ADN peut être réalisée en une seule journée si elle est réalisée correctement. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer qu’il n’y a pas de contamination croisée entre les échantillons et de toujours utiliser des contrôles appropriés, tels qu’un blanc. Suite à cette procédure, d’autres analyses biofomatiques peuvent être effectuées afin de valider les classifications faites par Kracken.

Ces techniques métagénomiques permettent aux chercheurs d’explorer le microbiome dans de nombreux systèmes complexes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des banques de séquençage de l’ADN métagénomique et de la réalisation d’analyses bioinformatiques sur les lectures de séquences d’ADN obtenues. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs de liaison à l’ADN peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants et des blouses de laboratoire doivent toujours être portées lors de l’exécution de cette procédure.