Induire ischémie-reperfusion chez la souris Ear Skin pour Intravitale multiphotonique Imaging des réponses immunitaires

L’objectif global de cette expérience est de comprendre comment les cellules immunitaires réagissent à la reperfusion de l’ischémie par l’imagerie multiphotonique intravitale de la peau de l’oreille de souris. Cette méthode peut aider à répondre à certaines des questions très importantes dans le domaine de l’immunologie et de la dermatologie pour comprendre le comportement dynamique des cellules immunitaires. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un modèle d’imagerie robuste pour étudier les activités cellulaires de la peau sous état enflammé ou au repos.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des lésions de reperfusion ischémique, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les réactions d’hypersensibilité ainsi que les infections. Pour commencer cette procédure, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius tout au long de la procédure de préparation. Confirmer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pincement des orteils.

Ensuite, appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter la sécheresse sous anesthésie. Ensuite, appliquez soigneusement la crème dépilatoire sur les deux tiers supérieurs de l’oreille dorsale et attendez deux à trois minutes. Ensuite, retirez la crème à l’aide d’applicateurs en coton humide de manière minutieuse mais douce.

Maintenant, induisez une ischémie dans la peau de l’oreille de la souris à l’aide des aimants en néodyme. Pour ce faire, insérez d’abord les aimants dans leurs guides en plastique individuels. Positionnez un aimant de manière à ce que seul le bord entre en contact avec un deuxième aimant ventral, qui doit être placé sous la face ventrale de l’oreille, l’oreille reposant à plat sur l’aimant.

Une fois prêt, laissez soigneusement les aimants se rejoindre. Après 1,5 heure d’ischémie, retirez les aimants en les tournant les uns des autres à l’aide des guides en plastique, ce qui permet à la reperfusion d’avoir lieu. Immédiatement après le retrait de l’aimant, administrez Evans Blue ou un autre agent de marquage des vaisseaux sanguins de votre choix par voie intraveineuse.

Dans cette étape, coupez deux morceaux de ruban adhésif. Laissez les côtés adhésifs coller ensemble tout en laissant environ un millimètre d’adhésif sur sa largeur. Ensuite, coupez le ruban de masquage en deux pour permettre son placement dans la fente sur la plate-forme de l’oreille.

Insérez ce ruban de masquage à mi-chemin de la fente de sorte que le côté adhésif soit orienté vers le haut. Après cela, positionnez la souris sur le coussin chauffant de manière à ce que l’oreille à imager se trouve à côté de la bande de ruban de masquage. À l’aide de deux applicateurs en coton humidifié PBS, appuyez doucement l’oreille contre la bande adhésive.

En utilisant la bande comme guide, faites passer l’oreille de la souris à travers la fente tout en rapprochant la souris de la scène. La peau de l’oreille étant très fragile, cette étape doit être effectuée avec beaucoup de précaution pour éviter toute blessure induite par la préparation. Pour retirer le ruban adhésif, ajoutez d’abord une goutte de PBS pour réduire l’adhérence du ruban.

Ensuite, séparez l’oreille de la souris du ruban de masquage aussi doucement que possible à l’aide d’un pinceau fin. Aplatissez l’oreille contre la plate-forme auriculaire en faisant rouler doucement un applicateur à embout en coton humide sur l’oreille. Ensuite, placez une goutte de PBS sous la lamelle et placez-la doucement sur l’oreille.

Ensuite, insérez la sonde de température rectale et connectez les fils au système de chauffage selon les instructions du fabricant. Pour acquérir des images, placez l’animal sous le microscope multiphotonique. Commencez par une région d’imagerie qui se trouve à proximité du bord de l’ischémie caractérisée par une fuite massive de bleu d’Evans.

Le schéma montre ici le positionnement des aimants. Ces deux photos montrent une oreille pré-ischémique et une oreille post-ischémique après clampage par aimant. Dans ce schéma de l’oreille, il est indiqué la région imagée par rapport à l’endroit où l’aimant a été placé.

Cette séquence en accéléré de projection maximale, montre l’infiltration des neutrophiles en réponse à la reperfusion dans la peau de l’oreille de souris albinos LysM-eGFPM après 1,5 heure d’ischémie. À des moments antérieurs, l’absence de signal Evans Blue indique une occlusion temporaire du vaisseau après une ischémie. Une fois maîtrisée, la préparation de l’oreille ischémique reperfusée pour l’imagerie peut se faire en moins de 30 minutes si elle est réalisée correctement.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de vérifier constamment la profondeur de l’anesthésie et la température de la souris. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration complète de la peau de l’oreille de souris peuvent être effectuées pour avoir une vue globale des localisations cellulaires. Après les développements de ce protocole, il a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie et de la dermatologie pour explorer l’immunité innée dans la peau de l’oreille de souris.

Après avoir regardé ces vidéos, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un modèle d’imagerie de la peau de l’oreille de souris pour étudier les lésions de reperfusion ischémique. N’oubliez pas que travailler avec un microscope multiphoto peut être dangereux. Et des précautions telles qu’une formation à la sécurité laser doivent être prises.