Name: Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez l'isolation de monocytes CD14+ par séparation magnétique à partir de sang humain total. Cette méthode permet d'obtenir une pureté de 98-99% pour la différenciation en cellules dendritiques immatures, essentielle pour l'étude de la présentation d'antigènes en immunologie.

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Nous tenons à remercier notre technicienne Karolin Thurnes, Division de l’hygiène et de la microbiologie médicale, ainsi que le Dr Annelies Mühlbacher et le Dr Paul Hörtnagl, de l’Institut central de transfusion sanguine et du département d’immunologie, pour leur aide et leur soutien précieux concernant ce manuscrit. Nous remercions le Fonds autrichien pour la science de soutenir ce travail (P24598 à DW, P25389 à WP).

déclaration éthique: le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants donneurs de sang par l&#39;Institut central de transfusion sanguine et Département Immunological, Innsbruck, Autriche. L&#39;utilisation d&#39;échantillons de restes anonymes à des fins scientifiques a été approuvé par le Comité d&#39;éthique de l&#39;Université médicale d&#39;Innsbruck. 1. Enrichissement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) <ol><li> La concentration des PBMC par centrifugation. <ol><li> Ouvrez la poche de sang et le sang fendu dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles selon la quantité de sang reçu. </li><li> Si nécessaire, ajuster le volume à 50 ml pour chaque tube avec tampon phosphate salin stérile de Dulbecco (D-PBS). </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les à 400 xg pendant 15 min à température ambiante (RT) sans frein. </li><li> Soutirer la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant le boundarcouche y undisturbed. NOTE: Si le plasma autologue au lieu de FCS est utilisé pour compléter le milieu de culture, le plasma doit être recueilli et inactivé par la chaleur dans cette étape. </li><li> Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) de deux tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans un tube stérile de 50 ml en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube en utilisant stérile D-PBS. </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les 400 g pendant 15 min à température ambiante sans frein. </li><li> Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche limite non perturbée. </li><li> Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) des tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans deux tubes de 50 ml de collecte stériles en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. </li></ol></li><li> Séparationdes PBMC par centrifugation à gradient de densité (figure 1). <ol><li> Préparer quatre tubes de 50 ml et la pipette 15 ml de milieu de gradient de densité dans chaque tube. </li><li> Prélever 25 ml de cellules / sang commun du tube de collecte (étape 1.1.10) et recouvrir soigneusement le milieu de gradient de densité. </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et de spin eux à 700 xg pendant 30 min à température ambiante sans frein. </li></ol></li><li> Collecte et purification de CMSP. <ol><li> Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche PBMC intacte. </li><li> Collecter l&#39;interphase PBMC de tous les tubes et mettre en commun les cellules dans deux stériles tubes de 50 ml en utilisant une pipette de 25 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 400 g eux pendant 15 min à 4 ° C avec le frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans du PBS stérile D. Réunir les cellules des deux tubes et ajuster le volume à 50 ml avec stérile D-PBS. </li><li> Placer les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du D-PBS stérile. Ajuster le volume à 50 ml avec du PBS stérile et D-pipette 50 ul d&#39;un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. </li><li> Vortex du tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre Neubauer ou tout autre instrument de comptage cellulaire. </li><li> Placer les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li></ol></li></ol> 2. Isolement des monocytes par particules magnétiques CD14 anti-humain <ol><li> Étiquetage des CMSP avec des particules magnétiques. <ol><li> Ajuster la concentration des PBMC à 8 x 10 7 cellules / ml en utilisant un tampon d&#39;isolement. </li><li> Vortex les particules magnétiques CD14 anti-humain thoroughly et ajouter 50 ul de particules pour chaque 1 x 10 7 PBMC. </li><li> Mélanger la suspension cellulaire de particules à fond et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li></ol></li><li> Séparation des fractions positives et négatives. <ol><li> Réglez le volume jusqu&#39;à 12 ml en utilisant un tampon d&#39;isolement. </li><li> Préparer six tubes à fond rond stériles et pipette 2 ml de la suspension cellulaire particules dans chaque tube. </li><li> Placer immédiatement les tubes sur l&#39;aimant. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Gardez les tubes sur l&#39;aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative. </li><li> Retirer le tube de l&#39;aimant et ajouter 2 ml de tampon d&#39;isolement. </li><li> Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. </li><li> Placer les tubes de retour sur l&#39;aimant. Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Gardez les tubes sur l&#39;aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative. </li><li>Retirer les tubes de l&#39;aimant et ajouter 2 ml de tampon d&#39;isolement à chaque tube. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. </li><li> Transférer la fraction positive à un tube stérile de 50 ml et ajuster le volume à 50 ml en utilisant stérile D-PBS. </li></ol></li></ol> 3. La stimulation des monocytes isolés avec l&#39;IL-4 et GM-CSF <ol><li> Placer le tube dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ml de D-PBS. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. Vortexer le tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre de Neubauer ou d&#39;un autre instrument de comptage de cellules. </li><li> Placer le tube de 50 ml dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein. NOTE: Si la fraction négative, contenant des lymphocytes du sang périphérique (PBL), est également nécessaire, effectuer le lavage et le comptage des étapes similaires à ttuyau de la fraction positive (étapes 3.1-3.5). </li><li> Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 / ml avec un milieu de culture préchauffé (milieu RPMI 1640 complété avec une solution à 10% de L-Glutamine inactivé à la chaleur et SBF à 1%) et de la pipette 3 ml / puits dans des plaques à 6 puits. NOTE: Si vous utilisez du plasma autologue inactivé à la chaleur, remplacer le FCS avec 1-5% de plasma autologue à 10%, selon le montage expérimental. </li><li> Stimuler les monocytes avec IL-4 humaine recombinante (250 U / ml) et GM-CSF humain recombinant (1000 U / ml) par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Re-stimuler les cellules avec l&#39;IL-4 (250 U / ml) et GM-CSF (1000 U / ml) après 48 heures par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. NOTE: S&#39;il y a des signes d&#39;acidification indiqués par l&#39;indicateur de pH dans le milieu, remplacer la moitié du milieu avec un milieu de culture préchauffé. </li><li> Récolte des cellules dendritiques immatures au jour 5 pouren aval des expériences de pipetage des cellules cultivées sur la plaque de 6 puits et dans un tube centrifuge de 50 ml après pipetage le milieu de culture et à quelques reprises. </li><li> Compter les cellules et colorer un échantillon de monocytes isolés avec des anticorps anti-CD11b humain contre, CD11c et DC-SIGN / CD209, conjointement avec un colorant de viabilité cellulaire. Afin d&#39;éviter une liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration de surface, l&#39;utilisation du récepteur Fc de réactifs de blocage ou d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) tampons est fortement recommandée. </li><li> Analyser l&#39;échantillon en utilisant le colorant de viabilité des cellules, selon le protocole du fabricant, en effectuant une cytométrie de flux pour évaluer la pureté et la viabilité des iDC générés. </li></ol>

<ol><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Steinman, R. M., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+translating+innate+to+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).</li>
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<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-independent+interaction+of+complement+opsonized+HIV+with+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells.</a> Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+opsonization+of+HIV+impedes+provirus+formation+in+and+infection+of+dendritic+cells+and+subsequent+long-term+transfer+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells.</a> J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).</li>
<li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li>
<li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li>
<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes (MDDC) l&#39;isolement des monocytes humains du sang anticoagulé à l&#39;aide d&#39;un dosage à base de nanoparticules magnétiques. Dans ce protocole, les étapes de centrifugation sont effectuées en amont de la procédure d&#39;isolement des cellules, ce qui conduit à un enrichissement de la fraction des CMSP. Bien que les cellules sont perdues au cours de la centrifugation, pour recouvrir le contenu de tout un paquet de sang sur un milieu à...

Les cellules dendritiques (CD) sont les plus importantes cellules présentant des antigènes les spécialisés de notre système immunitaire. Immature PED (iDC) réside dans la peau ou dans les tissus des muqueuses et sont donc parmi les premières cellules immunitaires d&#39;interagir avec les agents pathogènes envahisseurs. PED représentent le pont entre l&#39;inné et le système immunitaire adaptatif 1, car ils peuvent activer des réponses T et des cellules B suite à la détection d&#39;agents pathogènes. En outre, elles contribuent à la réponse immunitaire pro-inflammatoires en raison de la sécrétion de grandes quantités de cytokines, comme l&#39;IL-1β, IL-6 et IL-12. DC activer également les cellules NK et d&#39;attirer d&#39;autres cellules immunitaires vers le site de l&#39;infection par le chimiotactisme. Les CD peuvent être divisés en cellules dendritiques immatures (iDC) et des cellules dendritiques matures (MDC) 2 en fonction de leur morphologie et de la fonction. Après la reconnaissance d&#39;antigènes étrangers par l&#39; un des nombreux récepteurs de reconnaissance des formes (par exemple, des récepteurs de type Toll, du type Cdes lectines, des récepteurs ou complément) abondamment exprimé sur la surface cellulaire, iDC subissent des changements importants et commencent à arriver à maturité. Au cours de ce processus de maturation, des récepteurs pour l&#39; antigène de capture sont régulés à la baisse, tandis que les molécules essentielles à la présentation de l&#39; antigène sont régulés à la hausse 3. Les DC matures réguler à la hausse les complexes majeurs d&#39;histocompatibilité I et II (CMH I et II), les molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86, qui sont essentiels pour la présentation des antigènes et l&#39;activation des lymphocytes T. En outre, l&#39;expression de CCR7 des récepteurs de chimiokines sur la surface cellulaire est induite, ce qui permet la migration des CD à partir des tissus périphériques vers les ganglions lymphatiques. La migration est favorisée par le &quot;rolling&quot; des DC le long d&#39; un ligand de chimiokine 19 (CCL19 / MIP-3b) et un ligand de chimiokine 21 (CCL21 / SLC) Gradient aux ganglions lymphatiques 4-6. Après la migration, mDCs présentent l&#39;antigène traité pour naïfs cellules CD4 + et CD8 + T, ainsi ininégo- une réponse immunitaire adaptative contre l&#39;envahisseur pathogène 7. Cette interaction avec des cellules dans les ganglions lymphatiques T est également associé à la propagation du virus 8. D&#39; autres études in vitro ont révélé que les PED efficacement la capture et le transfert du VIH aux lymphocytes T et que cette transmission se traduit par une infection vigoureuse 9-12. Ces expériences mettent en évidence que in vivo du VIH exploite les PED comme des navettes de la périphérie vers les ganglions lymphatiques. Lors de la présentation de l&#39;antigène, les CD sécrètent des interleukines clés qui façonnent la différenciation des cellules T auxiliaires effectrices, et par conséquent, les résultats de l&#39;ensemble de la réponse immunitaire contre le microbe est déterminé à cette interaction très. En plus de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2) effectrices des cellules T, d&#39; autres sous - ensembles de cellules CD4 + T auxiliaires (par exemple, le type 17 (Th17) et le type 22 (cellules TH22) T) ont été décrits, et leur induction et fonction ont été étudiés à fond. DC sont en outre impliqués dansla génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) 13,14. Ces cellules sont immunosuppresseur et peuvent arrêter ou réguler négativement l&#39;induction ou la prolifération des cellules T effectrices et sont donc essentiels pour le développement de l&#39;immunité et la tolérance. DC classiques humaines (CDCS) comprennent plusieurs sous - ensembles de cellules ayant une origine myéloïde (ie, les cellules de Langerhans (LCS) et cutanée et DC interstitiels) ou une origine lymphoïde (ie, les DC plasmacytoïdes (pDC)). Pour les expériences in vitro ou des stratégies de vaccination DC, les DC dérivées de monocytes sont couramment utilisés comme modèle pour les PED dermiques. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction de cellules dendritiques myéloïdes classiques. Elles sont produites par l&#39;addition d&#39;interleukine 4 (IL-4) et granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , les monocytes isolés à partir de donneurs sains 12,15-18. Les cellules dendritiques peuvent également être directement isolés à partir de biopsies cutanées ou des muqueuses, ou peut même be développé à partir de cellules CD34 + progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d&#39; échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero. Ici, nous montrons comment les monocytes sont isolés et stimulés du sang humain anticoagulé après que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) enrichissement par centrifugation en gradient de densité. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains dans des conditions spécifiques sont différenciées en iDC et sont prêts pour les procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

<table><tbody><tr><td>Souris APC Clone CD19 Anti-Humain HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Souris APC Clone CD83 Anti-Humain HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Particules magnétiques CD14 Anti-Humain</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumine Fraction V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Multiple Well Treated TC-Treated</td><td>Multiple Well Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient media : Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp ; ml Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp ; ml Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp ; ml Tube à centrifuger PP haute clarté</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes à fond rond</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris Anti-Humain CD3 Clone HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (Réactif de viabilité cellulaire)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur, origine approuvée par l’UE (Amérique du Sud)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>CC PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’isolement : BD IMag Buffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 1,5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>Souris PE Anti-Humain CD14 Clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris Anti-Humaine CD209 Clone DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 moyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Les cellules dendritiques (DC) reconnaissent les structures étrangères de différents agents pathogènes, tels que les virus, les bactéries et les champignons, via une variété de récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) exprimés à leur surface cellulaire et activent et régulent ainsi l’immunité. 
La fonction principale des DC est l’induction de l’immunité adaptative dans les ganglions lymphatiques en présentant des antigènes via les molécules du CMH I et du CMH II aux lymphocytes T naïfs. Par conséquent, les DC doivent migrer de la périphérie vers les ganglions lymphatiques après la reconnaissance des agents pathogènes sur les sites d’infection. Pour les expériences in vitro ou les stratégies de vaccination des DC, les CD dérivés des monocytes sont couramment utilisés. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction avec les cellules dendritiques myéloïdes conventionnelles. Ils sont générés par la stimulation de l’interleukine 4 (IL-4) et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) de monocytes isolés de donneurs sains. Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés et stimulés à partir de sang humain anticoagulant après enrichissement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par centrifugation à gradient de densité. Les monocytes humains sont différenciés en DC immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique après 5 jours d’incubation.

Après centrifugation du sang anticoagulé à l' aide d' un coussin de saccharose, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) sont enrichis en une interphase au - dessus du milieu de gradient de densité (figure 1). Une fois que les PBMC sont soutirés, l' analyse FACS est effectuée pour caractériser les différentes populations de cellules dans les PBMC en utilisant des marqueurs de la lignée (par exemple, CD3 pour les lymphocytes T, les monocytes CD14 p...

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

L’objectif global de cette technique de séparation des billes magnétiques CD14 est d’isoler les monocytes du sang pour leur différenciation ultérieure en cellules dendritiques ou macrophages in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur la reconnaissance, le traitement et la présentation d’agents pathogènes ou d’antigènes par les cellules dendritiques. Le principal avantage de cette procédure d’isolement est qu’il est possible d’obtenir une population de monocytes purs de 98 à 99 %.Karolin Thurnes, une technicienne de notre groupe de travail, fera la démonstration de la procédure. Commencez par répartir le volume de la poche de sang entre des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres en fonction de la quantité de sang reçue. Ajustez le volume final dans chaque tube à 50 millilitres avec du PBS Dulbecco stérile si nécessaire et centrifugez les échantillons.À l’aide d’une pipette sérologique stérile d’un millilitre reliée à une pompe à vide de laboratoire, retirez les couches de plasma et de plaquettes en laissant les couches limites intactes. Ensuite, utilisez une nouvelle pipette de 25 millilitres pour combiner les couches limites de cellules mononucléées de deux des tubes dans le nouveau tube conique stérile de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de milieu à gradient de densité dans chacun des tubes coniques de 450 millilitres et, en pipetant lentement et soigneusement, superposez 25 millilitres de cellules sanguines regroupées sur le gradient de densité dans chaque tube.Séparez les cellules par centrifugation. Ensuite, aspirez les couches supérieures de plasma et de plaquettes et transférez les interphases PBMC dans de nouveaux tubes coniques individuels de 50 millilitres. Lavez les PBMC deux fois avec jusqu’à 50 millilitres de DPBS stériles, en tirant les cellules après la première centrifugation et en remettant en suspension la pastille dans 50 millilitres de DPBS frais après la seconde.Après le comptage, prélever les cellules par centrifugation pour l’isolement des particules magnétiques monocytaires. Pour purifier les monocytes par isolation par particules magnétiques, ajustez la concentration de PBMC à huit fois 10 à la 7e cellule par millilitre de tampon d’isolement. Ensuite, vortex soigneusement les particules magnétiques CD14 anti-humaines et mélangez 50 microlitres de particules pour chaque fois 10 à la 7ème PBMC dans les cellules, et transférez la solution de billes cellulaires dans un tube stérile de 15 millilitres.Après 30 minutes à température ambiante, ajustez le volume total à 12 millilitres de tampon d’isolement et transférez deux millilitres de suspension de particules cellulaires dans chacun des six tubes stériles à fond rond. Placez immédiatement les tubes sur l’aimant de séparation des cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez ensuite le surnageant contenant les lymphocytes du sang périphérique de chaque tube.Retirez les tubes de l’aimant et ajoutez deux millilitres de tampon d’isolement frais à chaque échantillon de cellule. Pipetez doucement de haut en bas pour remettre les cellules et les particules en suspension, puis remettez les tubes dans l’aimant pendant encore cinq minutes. À la fin de l’incubation, retirez à nouveau le surnageant et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de tampon d’isolement frais comme nous venons de le démontrer.Ensuite, tirez le monocyte CD14 positif contenant des fractions cellulaires dans un nouveau tube de 50 millilitres et portez le volume final du tube à 50 millilitres dans du DPBS stérile. Pour différencier les monocytes purifiés en cellules dendritiques, collectez les cellules par centrifugaiton et remettez en suspension la pastille dans 50 millilitres de DPBS. Après avoir compté, faites tourner à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension à une fois 10 à 6 cellules par millilitre de concentration et de milieu de culture préchauffé.Transférez trois millilitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à six puits et ajoutez de l’interleukine humaine recombinante quatre et du GMCSF dans chaque puits pour une incubation de 48 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le deuxième jour de culture, restimulez les cellules avec des cytokines fraîches et remettez la plaque dans l’incubateur. Le cinquième jour, tirez les surnageants et pipetez doucement le milieu frais dans les puits plusieurs fois pour récolter les cellules dendritiques immatures.Après séparation par gradient de densité, une fraction typique de PBMC est composée d’environ 4 % de lymphocytes B, 28 % de monocytes et 68 % d’autres cellules, dont 44 % sont des lymphocytes T. Après séparation magnétique des particules, l’analyse cytométrique en flux de la fraction négative révèle un pourcentage similaire de lymphocytes B, un pourcentage plus élevé des autres populations cellulaires et un pourcentage considérablement réduit de monocytes.La caractérisation de la fraction positive démontre l’efficacité élevée de la purification, plus de 99 % des cellules exprimant CD14. Après cinq jours de simulation d’Interleukine 4 et de GMCSF, les cellules CD14 positives se différencient en cellules dendritiques immatures dérivées de monocytes CD83 négatifs DC-SIGN qui sont comparables aux cellules dendritiques dermiques dans la morphologie, le comportement et l’expression des récepteurs. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures si elle est exécutée correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les monocytes du sang total et de les différencier en cellules dendritiques. Cette technique est très importante pour les chercheurs dans le domaine de l’immunologie afin d’explorer non seulement les cellules dendritiques, mais aussi la fonction des monocytes et des macrophages dans le système cellulaire humain primaire in vitro. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse microscopique, la cytométrie en flux, les essais de présentation d’infections ou d’antigènes peuvent être effectuées pour répondre à des questions sur la biologie des cellules dendritiques, la fonction et les interactions avec les antigènes.N’oubliez pas que le travail du sang peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants, d’une blouse de laboratoire ou d’un vaccin contre l’hépatite doivent toujours être prises avant de commencer cette procédure.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Cette vidéo décrit un protocole pour la génération de cellules dendritiques - des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les cellules T - à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte.

Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Cette vidéo montre la génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes, ou DC, à partir de monocytes humains. L’incubation des monocytes avec des facteurs de croissance et des cytokines conduit à la production de CD immatures. En réponse aux molécules régulatrices immunitaires, les CD immatures se différencient en CD tolérogènes et matures.

Génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes à partir de monocytes

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

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Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

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Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

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Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

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Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

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