Name: Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez l'isolation de monocytes CD14+ par séparation magnétique à partir de sang humain total. Cette méthode permet d'obtenir une pureté de 98-99% pour la différenciation en cellules dendritiques immatures, essentielle pour l'étude de la présentation d'antigènes en immunologie.

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Nous tenons à remercier notre technicienne Karolin Thurnes, Division de l’hygiène et de la microbiologie médicale, ainsi que le Dr Annelies Mühlbacher et le Dr Paul Hörtnagl, de l’Institut central de transfusion sanguine et du département d’immunologie, pour leur aide et leur soutien précieux concernant ce manuscrit. Nous remercions le Fonds autrichien pour la science de soutenir ce travail (P24598 à DW, P25389 à WP).

déclaration éthique: le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants donneurs de sang par l&#39;Institut central de transfusion sanguine et Département Immunological, Innsbruck, Autriche. L&#39;utilisation d&#39;échantillons de restes anonymes à des fins scientifiques a été approuvé par le Comité d&#39;éthique de l&#39;Université médicale d&#39;Innsbruck. 1. Enrichissement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) <ol><li> La concentration des PBMC par centrifugation. <ol><li> Ouvrez la poche de sang et le sang fendu dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles selon la quantité de sang reçu. </li><li> Si nécessaire, ajuster le volume à 50 ml pour chaque tube avec tampon phosphate salin stérile de Dulbecco (D-PBS). </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les à 400 xg pendant 15 min à température ambiante (RT) sans frein. </li><li> Soutirer la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant le boundarcouche y undisturbed. NOTE: Si le plasma autologue au lieu de FCS est utilisé pour compléter le milieu de culture, le plasma doit être recueilli et inactivé par la chaleur dans cette étape. </li><li> Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) de deux tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans un tube stérile de 50 ml en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube en utilisant stérile D-PBS. </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les 400 g pendant 15 min à température ambiante sans frein. </li><li> Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche limite non perturbée. </li><li> Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) des tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans deux tubes de 50 ml de collecte stériles en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. </li></ol></li><li> Séparationdes PBMC par centrifugation à gradient de densité (figure 1). <ol><li> Préparer quatre tubes de 50 ml et la pipette 15 ml de milieu de gradient de densité dans chaque tube. </li><li> Prélever 25 ml de cellules / sang commun du tube de collecte (étape 1.1.10) et recouvrir soigneusement le milieu de gradient de densité. </li><li> Placer les tubes dans une centrifugeuse et de spin eux à 700 xg pendant 30 min à température ambiante sans frein. </li></ol></li><li> Collecte et purification de CMSP. <ol><li> Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche PBMC intacte. </li><li> Collecter l&#39;interphase PBMC de tous les tubes et mettre en commun les cellules dans deux stériles tubes de 50 ml en utilisant une pipette de 25 ml sérologique stérile. </li><li> Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 400 g eux pendant 15 min à 4 ° C avec le frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans du PBS stérile D. Réunir les cellules des deux tubes et ajuster le volume à 50 ml avec stérile D-PBS. </li><li> Placer les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du D-PBS stérile. Ajuster le volume à 50 ml avec du PBS stérile et D-pipette 50 ul d&#39;un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. </li><li> Vortex du tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre Neubauer ou tout autre instrument de comptage cellulaire. </li><li> Placer les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li></ol></li></ol> 2. Isolement des monocytes par particules magnétiques CD14 anti-humain <ol><li> Étiquetage des CMSP avec des particules magnétiques. <ol><li> Ajuster la concentration des PBMC à 8 x 10 7 cellules / ml en utilisant un tampon d&#39;isolement. </li><li> Vortex les particules magnétiques CD14 anti-humain thoroughly et ajouter 50 ul de particules pour chaque 1 x 10 7 PBMC. </li><li> Mélanger la suspension cellulaire de particules à fond et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li></ol></li><li> Séparation des fractions positives et négatives. <ol><li> Réglez le volume jusqu&#39;à 12 ml en utilisant un tampon d&#39;isolement. </li><li> Préparer six tubes à fond rond stériles et pipette 2 ml de la suspension cellulaire particules dans chaque tube. </li><li> Placer immédiatement les tubes sur l&#39;aimant. Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Gardez les tubes sur l&#39;aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative. </li><li> Retirer le tube de l&#39;aimant et ajouter 2 ml de tampon d&#39;isolement. </li><li> Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. </li><li> Placer les tubes de retour sur l&#39;aimant. Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Gardez les tubes sur l&#39;aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative. </li><li>Retirer les tubes de l&#39;aimant et ajouter 2 ml de tampon d&#39;isolement à chaque tube. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. </li><li> Transférer la fraction positive à un tube stérile de 50 ml et ajuster le volume à 50 ml en utilisant stérile D-PBS. </li></ol></li></ol> 3. La stimulation des monocytes isolés avec l&#39;IL-4 et GM-CSF <ol><li> Placer le tube dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ml de D-PBS. </li><li> Introduire à la pipette 50 ul dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. Vortexer le tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre de Neubauer ou d&#39;un autre instrument de comptage de cellules. </li><li> Placer le tube de 50 ml dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein. NOTE: Si la fraction négative, contenant des lymphocytes du sang périphérique (PBL), est également nécessaire, effectuer le lavage et le comptage des étapes similaires à ttuyau de la fraction positive (étapes 3.1-3.5). </li><li> Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 / ml avec un milieu de culture préchauffé (milieu RPMI 1640 complété avec une solution à 10% de L-Glutamine inactivé à la chaleur et SBF à 1%) et de la pipette 3 ml / puits dans des plaques à 6 puits. NOTE: Si vous utilisez du plasma autologue inactivé à la chaleur, remplacer le FCS avec 1-5% de plasma autologue à 10%, selon le montage expérimental. </li><li> Stimuler les monocytes avec IL-4 humaine recombinante (250 U / ml) et GM-CSF humain recombinant (1000 U / ml) par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Re-stimuler les cellules avec l&#39;IL-4 (250 U / ml) et GM-CSF (1000 U / ml) après 48 heures par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. NOTE: S&#39;il y a des signes d&#39;acidification indiqués par l&#39;indicateur de pH dans le milieu, remplacer la moitié du milieu avec un milieu de culture préchauffé. </li><li> Récolte des cellules dendritiques immatures au jour 5 pouren aval des expériences de pipetage des cellules cultivées sur la plaque de 6 puits et dans un tube centrifuge de 50 ml après pipetage le milieu de culture et à quelques reprises. </li><li> Compter les cellules et colorer un échantillon de monocytes isolés avec des anticorps anti-CD11b humain contre, CD11c et DC-SIGN / CD209, conjointement avec un colorant de viabilité cellulaire. Afin d&#39;éviter une liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration de surface, l&#39;utilisation du récepteur Fc de réactifs de blocage ou d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) tampons est fortement recommandée. </li><li> Analyser l&#39;échantillon en utilisant le colorant de viabilité des cellules, selon le protocole du fabricant, en effectuant une cytométrie de flux pour évaluer la pureté et la viabilité des iDC générés. </li></ol>

<ol><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Steinman, R. M., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+translating+innate+to+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).</li>
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<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-independent+interaction+of+complement+opsonized+HIV+with+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells.</a> Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+opsonization+of+HIV+impedes+provirus+formation+in+and+infection+of+dendritic+cells+and+subsequent+long-term+transfer+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells.</a> J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).</li>
<li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li>
<li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li>
<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes (MDDC) l&#39;isolement des monocytes humains du sang anticoagulé à l&#39;aide d&#39;un dosage à base de nanoparticules magnétiques. Dans ce protocole, les étapes de centrifugation sont effectuées en amont de la procédure d&#39;isolement des cellules, ce qui conduit à un enrichissement de la fraction des CMSP. Bien que les cellules sont perdues au cours de la centrifugation, pour recouvrir le contenu de tout un paquet de sang sur un milieu à...

Les cellules dendritiques (CD) sont les plus importantes cellules présentant des antigènes les spécialisés de notre système immunitaire. Immature PED (iDC) réside dans la peau ou dans les tissus des muqueuses et sont donc parmi les premières cellules immunitaires d&#39;interagir avec les agents pathogènes envahisseurs. PED représentent le pont entre l&#39;inné et le système immunitaire adaptatif 1, car ils peuvent activer des réponses T et des cellules B suite à la détection d&#39;agents pathogènes. En outre, elles contribuent à la réponse immunitaire pro-inflammatoires en raison de la sécrétion de grandes quantités de cytokines, comme l&#39;IL-1β, IL-6 et IL-12. DC activer également les cellules NK et d&#39;attirer d&#39;autres cellules immunitaires vers le site de l&#39;infection par le chimiotactisme. Les CD peuvent être divisés en cellules dendritiques immatures (iDC) et des cellules dendritiques matures (MDC) 2 en fonction de leur morphologie et de la fonction. Après la reconnaissance d&#39;antigènes étrangers par l&#39; un des nombreux récepteurs de reconnaissance des formes (par exemple, des récepteurs de type Toll, du type Cdes lectines, des récepteurs ou complément) abondamment exprimé sur la surface cellulaire, iDC subissent des changements importants et commencent à arriver à maturité. Au cours de ce processus de maturation, des récepteurs pour l&#39; antigène de capture sont régulés à la baisse, tandis que les molécules essentielles à la présentation de l&#39; antigène sont régulés à la hausse 3. Les DC matures réguler à la hausse les complexes majeurs d&#39;histocompatibilité I et II (CMH I et II), les molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86, qui sont essentiels pour la présentation des antigènes et l&#39;activation des lymphocytes T. En outre, l&#39;expression de CCR7 des récepteurs de chimiokines sur la surface cellulaire est induite, ce qui permet la migration des CD à partir des tissus périphériques vers les ganglions lymphatiques. La migration est favorisée par le &quot;rolling&quot; des DC le long d&#39; un ligand de chimiokine 19 (CCL19 / MIP-3b) et un ligand de chimiokine 21 (CCL21 / SLC) Gradient aux ganglions lymphatiques 4-6. Après la migration, mDCs présentent l&#39;antigène traité pour naïfs cellules CD4 + et CD8 + T, ainsi ininégo- une réponse immunitaire adaptative contre l&#39;envahisseur pathogène 7. Cette interaction avec des cellules dans les ganglions lymphatiques T est également associé à la propagation du virus 8. D&#39; autres études in vitro ont révélé que les PED efficacement la capture et le transfert du VIH aux lymphocytes T et que cette transmission se traduit par une infection vigoureuse 9-12. Ces expériences mettent en évidence que in vivo du VIH exploite les PED comme des navettes de la périphérie vers les ganglions lymphatiques. Lors de la présentation de l&#39;antigène, les CD sécrètent des interleukines clés qui façonnent la différenciation des cellules T auxiliaires effectrices, et par conséquent, les résultats de l&#39;ensemble de la réponse immunitaire contre le microbe est déterminé à cette interaction très. En plus de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2) effectrices des cellules T, d&#39; autres sous - ensembles de cellules CD4 + T auxiliaires (par exemple, le type 17 (Th17) et le type 22 (cellules TH22) T) ont été décrits, et leur induction et fonction ont été étudiés à fond. DC sont en outre impliqués dansla génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) 13,14. Ces cellules sont immunosuppresseur et peuvent arrêter ou réguler négativement l&#39;induction ou la prolifération des cellules T effectrices et sont donc essentiels pour le développement de l&#39;immunité et la tolérance. DC classiques humaines (CDCS) comprennent plusieurs sous - ensembles de cellules ayant une origine myéloïde (ie, les cellules de Langerhans (LCS) et cutanée et DC interstitiels) ou une origine lymphoïde (ie, les DC plasmacytoïdes (pDC)). Pour les expériences in vitro ou des stratégies de vaccination DC, les DC dérivées de monocytes sont couramment utilisés comme modèle pour les PED dermiques. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction de cellules dendritiques myéloïdes classiques. Elles sont produites par l&#39;addition d&#39;interleukine 4 (IL-4) et granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , les monocytes isolés à partir de donneurs sains 12,15-18. Les cellules dendritiques peuvent également être directement isolés à partir de biopsies cutanées ou des muqueuses, ou peut même be développé à partir de cellules CD34 + progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d&#39; échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero. Ici, nous montrons comment les monocytes sont isolés et stimulés du sang humain anticoagulé après que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) enrichissement par centrifugation en gradient de densité. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains dans des conditions spécifiques sont différenciées en iDC et sont prêts pour les procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

<table><tbody><tr><td>Souris APC Clone CD19 Anti-Humain HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Souris APC Clone CD83 Anti-Humain HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Particules magnétiques CD14 Anti-Humain</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumine Fraction V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Multiple Well Treated TC-Treated</td><td>Multiple Well Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient media : Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp ; ml Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp ; ml Pipette sérologique</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp ; ml Tube à centrifuger PP haute clarté</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes à fond rond</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris Anti-Humain CD3 Clone HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (Réactif de viabilité cellulaire)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur, origine approuvée par l’UE (Amérique du Sud)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>CC PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’isolement : BD IMag Buffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 1,5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>Souris PE Anti-Humain CD14 Clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris Anti-Humaine CD209 Clone DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 moyen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Les cellules dendritiques (DC) reconnaissent les structures étrangères de différents agents pathogènes, tels que les virus, les bactéries et les champignons, via une variété de récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) exprimés à leur surface cellulaire et activent et régulent ainsi l’immunité. 
La fonction principale des DC est l’induction de l’immunité adaptative dans les ganglions lymphatiques en présentant des antigènes via les molécules du CMH I et du CMH II aux lymphocytes T naïfs. Par conséquent, les DC doivent migrer de la périphérie vers les ganglions lymphatiques après la reconnaissance des agents pathogènes sur les sites d’infection. Pour les expériences in vitro ou les stratégies de vaccination des DC, les CD dérivés des monocytes sont couramment utilisés. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction avec les cellules dendritiques myéloïdes conventionnelles. Ils sont générés par la stimulation de l’interleukine 4 (IL-4) et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) de monocytes isolés de donneurs sains. Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés et stimulés à partir de sang humain anticoagulant après enrichissement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par centrifugation à gradient de densité. Les monocytes humains sont différenciés en DC immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique après 5 jours d’incubation.

Après centrifugation du sang anticoagulé à l' aide d' un coussin de saccharose, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) sont enrichis en une interphase au - dessus du milieu de gradient de densité (figure 1). Une fois que les PBMC sont soutirés, l' analyse FACS est effectuée pour caractériser les différentes populations de cellules dans les PBMC en utilisant des marqueurs de la lignée (par exemple, CD3 pour les lymphocytes T, les monocytes CD14 p...

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

L’objectif global de cette technique de séparation des billes magnétiques CD14 est d’isoler les monocytes du sang pour leur différenciation ultérieure en cellules dendritiques ou macrophages in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie sur la reconnaissance, le traitement et la présentation d’agents pathogènes ou d’antigènes par les cellules dendritiques. Le principal avantage de cette procédure d’isolement est qu’il est possible d’obtenir une population de monocytes purs de 98 à 99 %.Karolin Thurnes, une technicienne de notre groupe de travail, fera la démonstration de la procédure. Commencez par répartir le volume de la poche de sang entre des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres en fonction de la quantité de sang reçue. Ajustez le volume final dans chaque tube à 50 millilitres avec du PBS Dulbecco stérile si nécessaire et centrifugez les échantillons.À l’aide d’une pipette sérologique stérile d’un millilitre reliée à une pompe à vide de laboratoire, retirez les couches de plasma et de plaquettes en laissant les couches limites intactes. Ensuite, utilisez une nouvelle pipette de 25 millilitres pour combiner les couc

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Cette vidéo décrit un protocole pour la génération de cellules dendritiques - des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les cellules T - à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte.

Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Cette vidéo montre la génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes, ou DC, à partir de monocytes humains. L’incubation des monocytes avec des facteurs de croissance et des cytokines conduit à la production de CD immatures. En réponse aux molécules régulatrices immunitaires, les CD immatures se différencient en CD tolérogènes et matures.

Génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes à partir de monocytes

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Cette étude compare deux méthodes différentes d’isolement de monocytes humains pour obtenir des cellules dendritiques (DC) in vitro. Les monocytes sont sélectionnés par adhérence ou enrichis négativement par séparation magnétique. Le rendement et la viabilité des monocytes ainsi que la viabilité, la prolifération et l’expression des marqueurs de surface CD11c/CD14 seront comparés entre les deux méthodes.

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Le dispositif de transimmunization (TI) ou la plaque et les protocoles connexes ont été élaborés pour reproduire les principales caractéristiques de la photochimiothérapie extracorporeuse (ECP), dans un contexte expérimental, permettant la production de cellules dendritiques activables physiologiquement activées et réglables cellules (DCs) pour l’immunothérapie du cancer.

Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

La méthodologie décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins (MoDC) et leur application pour l’évaluation in vitro de candidats antigéniques au cours du développement de vaccins vétérinaires potentiels chez les bovins.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Un protocole unique et complet pour générer des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains désialylés (mo-DCs) à partir de cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’un traitement à la sialidase est présenté. De plus, des méthodes permettant d’évaluer la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des mo-DC et d’évaluer comment le traitement à la sialidase améliore le niveau de maturation des mo-DC sont décrites.

Génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes avec différents phénotypes sialylés

Nous décrivons une procédure pour évaluer la capacité des agents pharmacologiques à générer des cellules dendritiques tolérogènes à partir de cellules dendritiques naïves dérivées de monocytes in vitro et à valider leur puissance par génération autologue de cellules T régulatrices.

Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

Découvrez l'isolation de monocytes CD14+ par séparation magnétique à partir de sang humain total. Cette méthode permet d'obtenir une pureté de 98-99% pour la différenciation en cellules dendritiques immatures, essentielle pour l'étude de la présentation d'antigènes en immunologie.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

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