Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal In vitro

L’objectif global de cette technique est de capturer les interactions protéine-protéine lipidique-proximale in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine de la dynamique mitochondriale, telles que la façon dont les interactions protéine-protéine au niveau de la membrane externe mitochondriale peuvent être affectées par les lipides accessoires. Le principal avantage de cette technique est que le fait d’attacher des domaines protéiques solubles à des matrices lipidiques garantit qu’une confirmation plus native peut être obtenue.

De plus, les interactions complexes entre les protéines solubles et leurs partenaires attachés peuvent être évaluées en présence de cofacteurs lipidiques définis. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier les interactions protéiques dans la machinerie de fission mitochondriale, elle peut également être appliquée à d’autres complexes protéiques qui se localisent dans divers compartiments membranaires. Ryan, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure.

Tout d’abord, combinez les solutions de chloroforme des lipides souhaités dans un tube à essai en verre propre. Évaporez le solvant avec de l’azote gazeux sec tout en tournant le tube pour former une fine pellicule lipidique. Ensuite, éliminez le solvant résiduel avec l’évaporateur centrifuge pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez le tampon A préchauffé pour obtenir une concentration lipidique finale d’un à deux millimolaires. Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec un vortex occasionnel pour remettre complètement en suspension le mélange de lipides. Après l’incubation, transférez le mélange de lipides dans un tube à essai en plastique et placez le tube dans de l’azote liquide pendant environ 30 secondes jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé.

Placez ensuite le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement décongelé. Ensuite, préparez une extrudeuse de lipides en trempant quatre supports de filtre et un filtre en polycarbonate dans le tampon A et en assemblant l’extrudeuse selon les instructions du fabricant. Extrudez la solution lipidique à travers le filtre 21 fois en utilisant une pression douce et constante pour assurer une distribution granulométrique homogène.

Pendant l’extrusion, utilisez une pression lente et constante pour assurer l’homogénéité de la taille des liposomes. Avec un filtre d’un micron, c’est moins important. Mais avec des filtres de taille plus petite, cela peut introduire une hétérogénéité plus apparente.

Stockez les liposomes extrudés à quatre degrés Celsius. Incuber le facteur de fission mitochondriale ou Mff marqué par His avec des liposomes d’échafaudage pendant au moins 15 minutes à température ambiante dans le tampon A et le BME. Pour un contrôle sans Mff, incubez les liposomes avec une protéine de contrôle marquée His, telle que la GFP, pour lier et protéger le nickel-NTA exposé.

Ajoutez la protéine 1 ou Drp1 liée à la dynamine au mélange de liposomes et incubez pendant une heure à température ambiante. Ensuite, transférez cinq microlitres de l’échantillon sur une feuille de film de laboratoire et posez une grille de cuivre-rhodium recouverte de carbone sur l’échantillon. Après une minute d’incubation, retirez l’excès de liquide avec du papier filtre et ajoutez une goutte d’acétate d’uranyle à 2 %.

Après avoir incubé pendant une minute supplémentaire, retirez l’excès de tache avec du papier filtre et transférez l’échantillon dans une boîte grillagée. Le lendemain, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope électronique à transmission à un grossissement de 18, 500 à 30 000X pour observer les changements ultrastructuraux dans les morphologies des protéines et des liposomes. Incuber Mff et Fis1 avec les liposomes d’échafaudage pendant 15 minutes à température ambiante dans les tampons A et BME.

Ajouter Drp1 et incuber chaque mélange pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante. Transférez les tubes dans le thermocycleur réglé à 37 degrés Celsius et déclenchez les réactions en ajoutant du GTP et du chlorure de magnésium. Aux points de temps souhaités, transférez 20 microlitres de chaque mélange réactionnel dans les puits d’une plaque de microtitration contenant cinq microlitres d’EDTA de 0,5 molaire pour chélater le magnésium et arrêter la réaction.

Ensuite, préparez un ensemble d’étalons de phosphate en diluant le phosphate de potassium dans le tampon A et le BME pour calibrer les résultats. Ajoutez 20 microlitres de chaque étalon dans les puits contenant cinq microlitres d’EDTA 0,5 molaire. Ajoutez 150 microlitres de réactif vert de malachite dans chaque puits.

Enfin, lisez l’OD 650 cinq minutes après chaque ajout. Le GTP s’hydrolysera lentement en présence du réactif vert de malachite acide. Ce réactif doit donc être ajouté à tous les puits de l’échantillon dans les 10 minutes suivant la mesure de l’absorbance afin de maximiser le rapport signal/bruit.

En l’absence dans Drp1, ni le Mff ni le GFP n’ont entraîné de déformation de la membrane. Et seuls des liposomes sans caractéristiques ont été observés pour les liposomes d’échafaudage enrichis décorés de GFP ou ESL. Cependant, lorsque Drp1 a été ajouté aux modèles ESL décorés de Mff, le remodelage des liposomes était évident.

Décoration de la SL avec l’activité GTPase renforcée de Mff. Inversement, lorsque les groupes de tête NTA exposés ont été bloqués avec de la GFP marquée par His, cette activité GTPase accrue a été ablatée. L’attachement de Fis1 dépourvu de son domaine transmembranaire au SL n’a pas non plus réussi à provoquer une stimulation de l’activité GTPase de Drp1.

Semblable à la SL, l’ajout de SL/Cl à Drp1 a entraîné une légère stimulation de l’activité de la GTPase qui a été inversée en attachant Fis1 ou GFP marqué par His aux liposomes. Une synergie entre Mff et la cardiolipine a été observée lorsque l’activité GTPase de Drp1 a été stimulée 2,6 fois lorsqu’il a été incubé avec des SL/CL décorés de Mff. Lorsque les modèles SL/PE/CL ont été décorés avec Mff, l’activité Drp1 a été améliorée.

La capacité de Drp1 à remodeler les liposomes en tubules lipidiques a été améliorée par l’ajout de PE aux liposomes d’échafaudage. Une fois maîtrisés, ces échafaudages peuvent être préparés et utilisés en quelques heures si la procédure est effectuée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes d’interaction protéique et lipidique comme la sédimentation et les tests de diffusion de la lumière peuvent être effectuées afin de caractériser les interactions fonctionnelles.

L’application de cette technique permet aux personnes qui examinent la translocation de protéines vers une membrane biologique définie d’explorer les interactions protéiques transitoires et l’impact de cofacteurs lipidiques spécifiques dans la formation et la stabilisation d’assemblages cellulaires essentiels.