3D entier coeur Myocardial analyse des tissus

Narrateur}L’objectif global de ce protocole est de faciliter l’élaboration d’une méthode structurée et reproductible pour le traitement 3D des tissus du cœur entier qui peut être utilisée pour évaluer la précision du ciblage des injections intramyocardiques dans la zone frontalière de l’infarctus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine cardiorégénérative, telles que le développement de la pratique et l’optimisation des techniques d’injection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une méthode standardisée et reproductible pour le traitement 3D des tissus du cœur entier.

Les implications de cette technique s’étendent au développement de thérapies régénératives cardiaques et à la validation de la précision de l’injection des techniques d’administration normales. L’objectif de cette thérapie par cellules souches cardiaques est d’injecter des cellules dans la zone frontalière de l’infarctus pour stimuler la vasculogenèse locale et la protection des cardiomyocytes. La capture du cœur en phase diastolique finale demande de la pratique et de la patience.

Une démonstration visuelle de ces étapes est essentielle. Commencez par séparer le péricarde du cœur injecté de microbilles, en gardant les oreillettes et les ventricules intacts. Lorsque tout le tissu a été enlevé, utilisez des ciseaux de Klinkenberg pour disséquer l’aorte ascendante à environ un centimètre au-dessus de la valve aortique, et coupez les veines cavales et pulmonaires inférieures à environ un centimètre de l’oreillette.

Après avoir fixé l’apex du cœur au fond du récipient d’enrobage en plastique pour éviter la flottaison, placez des sutures 2-0 à travers la partie restante de l’aorte jusqu’aux bords du récipient et fixez le cœur. Veillez à ce que le cœur soit centré et ne touche pas les parois du récipient. Lorsque l’organe a été fixé dans une géométrie diastolique terminale, utilisez des pinces anti-moustiques pour saisir la veine cave inférieure et utilisez une seringue de 50 millilitres pour injecter lentement de la gélose fraîchement préparée à 50 à 60 degrés Celsius dans l’oreillette droite via la veine cave supérieure jusqu’à ce que l’oreillette et le ventricule droits soient complètement remplis.

Pour obtenir un cœur encastré ressemblant le plus possible à la géométrie diastolique terminale, fixez l’apex du ventricule gauche au fond du récipient et remplissez le ventricule droit d’agar pendant que les veines pulmonaires sont clampées. Ensuite, placez un pince-moustique sur les veines pulmonaires et passez doucement une nouvelle seringue de 50 millilitres remplie d’agar dans le sens rétrograde à travers les valves aortiques. Injectez lentement la solution dans le ventricule gauche jusqu’à ce que le ventricule et l’oreillette gauche soient complètement pleins, en serrant l’aorte une fois que le ventricule gauche a été rempli.

Maintenant, versez la gélose restante dans le récipient jusqu’à ce que le cœur soit entièrement recouvert et placez deux tubes en plastique rigide dans le récipient d’enrobage pour servir de structures de référence lors de l’enregistrement de l’image. Placez ensuite le cœur à deux à sept degrés Celsius pendant au moins quatre heures pour solidifier l’agar. Après l’imagerie par résonance magnétique, retournez le récipient et laissez l’air entre la gélose et les côtés du récipient pour retirer la solution solide de gélose et le cœur du récipient.

Retirez les tiges en plastique. Ensuite, utilisez une trancheuse à viande pour sectionner le bloc de gélose et le cœur en tranches de cinq millimètres de l’apex à la base du cœur, en coupant parallèlement au bas du bloc de gélose pour maintenir l’angulation des tranches la même que dans les images de résonance magnétique acquises. Lorsque toutes les tranches ont été obtenues, colorer les échantillons de tissus dans le TTC.

Après 15 minutes, photographiez les tranches des deux côtés à un angle perpendiculaire, puis rincez soigneusement les sections avec une solution saline à 0,9 %. Pour imager les échantillons par microscopie à fluorescence, sélectionnez l’imagerie en mode fluorescence sur le scanner à mode variable et réglez la taille des pixels sur 100 x 100 microns. Pour le premier bloc de filtre, sélectionnez un filtre passe-bande qui chevauche la longueur d’onde d’émission de la fluorescence de la bille dans le canal un, puis un filtre passe-bande pour le deuxième bloc de filtre en dehors de la longueur d’onde d’émission dans le canal deux.

Ensuite, sélectionnez le bloc de filtre approprié, réglez le tube photomultiplicateur sur la tension appropriée et le laser d’excitation sur la longueur d’onde d’excitation la plus proche de celle des microbilles injectées. Une fois que toutes les images ont été obtenues, dans le logiciel de post-traitement approprié, segmentez le myocarde et les bords du ventricule gauche endo- et épicardique dans les images de résonance magnétique, suivi d’une segmentation similaire du myocarde et des sites d’injection dans les images de fluorescence. Ensuite, interpolez linéairement les segments enregistrés de l’image des deux côtés des tranches pour reconstruire l’épaisseur de l’échantillon d’origine et créer un modèle 3D des données.

Avec le cœur fixé dans une géométrie diastolique terminale comme nous venons de le démontrer, dans cette expérience représentative, la gélose a adhéré avec succès au tissu cardiaque, ce qui a permis de trancher le tissu à l’angulation souhaitée avec des épaisseurs de tranche égales. Sur les images de fluorescence 2D et par résonance magnétique, la cicatrice et les sites d’injection sont clairement distincts. Les tissus colorés par TTC et les images par résonance magnétique améliorées au gadolinium tardif fournissent un contrôle pour l’évaluation des cicatrices en imagerie de fluorescence.

L’imagerie post-traitement permet de reconstruire la géométrie 3D du cœur ex vivo sur la base des segmentations et des images de fluorescence, permettant d’évaluer la précision de l’injection 3D. Dans cette étude, les dépôts d’injection et la zone frontale de l’infarctus ont été protégés sur la paroi endocardique, et les distances entre les projections sur la surface endocardique ont été mesurées. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles qu’une évaluation chirurgicale, la quantification de la taille de l’infarctus ou la validation d’autres modalités d’imagerie tridimensionnelle peuvent être effectuées.

Nous avons utilisé cette technique pour évaluer la précision de l’injection dans la zone frontalière de l’infarctus. Cette recherche a été menée pour améliorer la thérapie cardiorégénérative de l’insuffisance cardiaque. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation du cœur, de l’intégration et du traitement du tissu cardiaque et de la réalisation de l’imagerie par fluorescence d’échantillons de tissu cardiaque.