L'élevage et d'ARN double brin médiée Gene Knockdown dans le Hide Beetle, Dermestes maculatus

L’objectif global de cette procédure est d’explorer la fonction des gènes chez Dermestes maculatus, un nouveau système modèle d’insecte, qui représente le clade diversifié des coléoptères, et facilite l’étude des questions de recherche fondamentale et appliquée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement, de la biologie évolutive et au-delà, en permettant de tester la fonction des gènes chez les embryons de Dermestes et les adultes. Le principal avantage de cette technique est que l’interférence ARN peut être utilisée pour cibler n’importe quel gène, en se basant uniquement sur les informations de séquence, même en l’absence d’une séquence génomique complète.

Les méthodes présentées ici ne fournissent pas seulement une approche pour étudier la fonction des gènes chez Dermestes. Ils peuvent également être utilisés pour développer de nouveaux systèmes de modèles d’insectes et, éventuellement, pour lutter contre les insectes nuisibles. Pour préparer une cage d’élevage pour un D. maculatus, étalez d’abord une fine couche de copeaux de bois dans une cage à insectes de taille moyenne.

Placez une section de polystyrène dans la cage pour permettre aux larves de se transformer en chrysalides. Ajoutez vingt à cinquante coléoptères adultes ou larves de stade tardif dans la cage. Placez la nourriture humide pour chats dans une boîte de Pétri ou un bateau de pesée, comme source de nourriture.

Couvrez la cage avec un chiffon en maille et placez-la dans un incubateur. Avant de commencer le prélèvement d’embryons, vérifiez d’abord soigneusement la cage pour détecter la présence d’embryons et retirez-les. Une fois la cage dégagée, placez une boule de coton étirée dans la cage et incubez la colonie à 30 degrés Celsius.

Après la fenêtre de temps appropriée, récupérez la boule de coton, retirez tous les adultes présents et remettez-les dans la cage. Sur un morceau de papier de construction noir, pincez doucement la boule de coton et déchirez-la lentement en filament fin, de sorte que les œufs présents tombent sur le papier noir. Prenez un couvercle de boîte de Pétri standard et utilisez un morceau de papier filtre noir pour couvrir l’intérieur.

Collez un morceau de ruban adhésif double face le long du bord d’une lame de microscope standard. Placez la lame du microscope sur le papier filtre noir dans le couvercle de la boîte de Pétri. En prenant le papier contenant les embryons collectés, tapotez doucement pour transférer les embryons sur le couvercle de la boîte de Pétri.

À l’aide d’un pinceau, alignez les embryons sur le ruban perpendiculairement à la lame, avec l’extrémité antérieure ou postérieure vers le bord. Pour commencer l’ARNi, prélevez d’abord 2 à 4 microlitres d’ARNdb dans une pointe de pipette de 20 microlitres. Insérez l’embout dans un capillaire en verre pré-tiré, appelé aiguille, et pipetez doucement la solution dans l’aiguille.

Fixez l’aiguille dans un support capillaire en verre, puis assemblez le support capillaire dans le micromanipulateur. Ensuite, transférez soigneusement la lame avec les embryons attachés sur la platine du microscope de dissection. Déplacez la lame pour placer un embryon au centre du champ et faites la mise au point du microscope.

Tout en regardant dans la lunette de dissection, positionnez l’extrémité du capillaire à l’aide du micromanipulateur. Amenez l’extrémité près de l’extrémité du premier embryon de la rangée. Allumez l’alimentation en azote ou en air, puis réglez le sélecteur d’entrée du solénoïde sur le vide.

Ajustez le régulateur de pression d’éjection à 10-15 psi, selon l’appareil. Ouvrez le capillaire et la solution colorée d’ARNdb remplira l’embout, prêt à être injecté. Déplacez l’extrémité capillaire vers l’avant et percez doucement l’embryon.

Sous des réglages de pression idéaux, aucun liquide embryonnaire ne s’écoulera dans le capillaire. Appuyez sur l’interrupteur au pied pour éjecter l’ARNdb dans l’embryon, jusqu’à ce que la quantité appropriée soit distribuée. Laissez l’embout à l’intérieur de l’embryon pendant environ deux secondes, puis retirez-le soigneusement.

Une fois que tous les embryons ont été injectés, placez la lame dans une boîte de Pétri. Ajoutez une boule de coton humide dans le plat en prenant soin de ne pas la laisser entrer en contact avec la lame. Couvrez la boîte de Pétri et enveloppez-la d’un film d’étanchéité.

Étiquetez-le avec le type d’ARNdb, la concentration, la date, l’heure et le nombre d’embryons injectés. Enfin, placez la boîte dans un incubateur à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons éclosent. Pour effectuer des pARNi, prélevez d’abord des pupes de la colonie.

Triez les pupes mâles et femelles dans deux plats séparés et placez-les dans un incubateur à 30 degrés Celsius. Vérifiez quotidiennement les plaques pour les coléoptères fermés et transférez ces individus dans deux boîtes de Pétri distinctes pour les adultes mâles et femelles. Nourrissez ces adultes et maintenez les plaques tous les deux jours, jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’adultes soient fermés pour commencer l’injection.

Une fois que le bassin d’adultes est terminé, anesthésie un coléoptère femelle et tenez le côté ventral individuel vers le haut d’une main, en tenant la seringue dans l’autre. Pénétrer doucement la membrane de ségagorie entre les sternites 2 et 3. Vérifiez la balance de la seringue et distribuez lentement environ deux microlitres par femme.

Après l’injection, maintenez l’aiguille stable pendant au moins 5 secondes, puis retirez-la soigneusement. Transférez les femelles injectées dans une boîte de Pétri avec de la nourriture pour chats. Étiquetez le plat de manière appropriée.

Placez le plat dans un incubateur à 30 degrés Celsius. Après 24 heures, transférez les femelles injectées dans une mini-cage et ajoutez un nombre égal de jeunes mâles non injectés. Étiquetez la cage et ajoutez de la nourriture pour chats.

Placez la cage dans un incubateur à 30 degrés Celsius, pour permettre l’accouplement. La progéniture résultante peut ensuite être examinée pour déterminer les effets de l’ARNp i. Cette image montre la progéniture d’un individu pRNAi injecté avec la DS GFP, protéine fluorescente verte, comme contrôle.

Ici, comme chez les individus de type sauvage, la progéniture a éclos avec une bande pigmentée par segment. Les bandes pigmentées voisines étaient séparées par un espace non pigmenté. Après l’appariement des ARNi, la progéniture affectée a éclos avec des bandes pigmentées voisines fusionnées, indiquant des limites segmentaires défectueuses.

La sévérité phénotypique était variable, mais des fusions apparaissaient systématiquement dans certaines régions limites, indiquant des défauts semblables à des règles de paire. De même, les phénotypes cuticulaires d’embryons non éclos après knockdown apparié ont montré une perte de segments abdominaux, ainsi qu’une longueur du corps raccourcie. La coloration d’embryons précoces avec des anticorps engrêlés pour examiner les défauts moléculaires a montré des bandes d’expression d’intensité égale dans chaque segment chez les individus témoins.

En revanche, une expression réduite a été détectée dans des bandes alternées chez la progéniture de femelles injectées d’ARNdb appariés Dmac. Ce profil d’expression réduite est compatible avec le profil cutanéiculaire défectueux observé chez les larves écloses affectées. Ici, pour la première fois, nous présentons notre protocole pour l’élimination d’un gène d’intérêt, au cours du développement embryonnaire précoce chez Dermestes maculatus, en utilisant l’interférence ARN.

Lors de la tentative de ces procédures, il est important de se rappeler d’utiliser des embryons ou des adultes féminins au stade approprié. Une fois maîtrisé, l’injection d’environ 100 embryons ou 10 adultes femelles peut se faire en une demi-heure. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la coloration embryonnaire ou la PCR quantitative, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les mécanismes de régulation des gènes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place une colonie de laboratoire de Dermestes et d’effectuer une interférence ARN embryonnaire et parentale chez ce coléoptère. À l’heure actuelle, seul un petit nombre de modèles d’insectes sont disponibles pour les études fonctionnelles. Les techniques présentées ici ouvrent la voie aux chercheurs pour utiliser Dermestes comme système modèle, élargissant ainsi le champ des insectes susceptibles d’être analysés en génétique moléculaire.