Spectrométrie de fluorescence des rayons X

X-ray Fluorescence (XRF)

JoVE Science Education
Analytical Chemistry

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JoVE Science Education Analytical Chemistry

X-ray Fluorescence (XRF)

3.2: Internal Standards

3.15: Cyclic Voltammetry (CV)

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07:45 min

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August 24, 2015

Overview

Source : Laboratoire de Dr. Lydia Finney, Argonne National Laboratory

Fluorescence des rayons x est un induit, émis un rayonnement qui peut être utilisé pour générer l’information spectroscopique. Microscopie de fluorescence de rayons x est une technique d’imagerie non destructifs qui utilise l’émission de fluorescence induite des métaux d’identifier et de quantifier leur répartition spatiale.

Principles

Tout d’abord, les échantillons doivent être préparés qui sont minces, plate et sèche (sauf si un étage cryogénique spécial est disponible pour le microscope). Ensuite, un faisceau de rayons x monochromatique concentré est scannée raster dans l’ensemble de l’échantillon. Le faisceau de rayons x permet de surmonter l’énergie de liaison de certains des électrons aux atomes de métal coque intérieure, et quand les électrons coquille externe tombent dans les postes vacants, une deuxième radiographie est émise par l’échantillon. À chaque instant de ce raster-scan, un spectre d’émission de x-ray fluorescence sont recueilli par le détecteur.

Dans cette partie du spectre, la longueur d’onde et l’intensité de tous les rayons x émis par l’échantillon est enregistrée. Basé sur l’énergie caractéristique (en raison de l’espacement des orbitales de l’atome), de la fluorescence émise et de l’intensité relative caractéristique de K_α et_β K (par exemple, qui sont tous deux reconnus), le spectre d’émission permet de déterminer l’identité des métaux présents ainsi que la quantité.

Cette vidéo vous expliquera le processus de préparation d’un échantillon mince et sec des cellules adhérentes pour imagerie par fluorescence. Le processus d’analyse des échantillons sera expliqué brièvement, et décrit une image par exemple.

Procedure

1. préparer les fenêtres de nitrure de silicium

Utiliser des pinces inversées pour ramasser une fenêtre (nitrure de silicium windows seront brisera en cas de chute).
Placer la fenêtre sur une lame de verre, côté plat vers le haut.
Respecter les petits morceaux de Scotch sur les côtés de la fenêtre et utilisez-les pour respecter les fenêtres vers le bas de la boîte de Pétri.
Stériliser les fenêtres de Pétri avec les rayons UV. Ceci peut être accompli avec le paramètre auto-crosslink sur une armoire UV-réticulation, suivie par l’irradiation UV supplémentaire sous la lampe UV dans la hotte à flux laminaire pendant environ 1 h.

2. les cellules sur les vitres de nitrure de silicium stérilisé de placage

Tenir le plat avec elle inclinée à un angle de 45°.
Ajouter des éléments multimédias en pipettant également, du côté du plat et soulager lentement l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec les médias.
Ajouter des cellules à la boîte de Petri, de la même manière et incuber.
Observer les cellules occasionnellement à l’aide d’un microscope optique pour déterminer quand ils sont prêts à l’emploi.

3. la fixation et le séchage des cellules

Dans une hotte à flux laminaire, retirez le support en aspirant doucement tout en inclinant le plat tel que décrit ci-dessus.
Ajouter PBS, pipetage vers le côté du plat en le tenant à angle. Lentement, soulager l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec du PBS.
Supprimer les PBS avec aspirant doucement.
Pipetage vers le côté du plat et en tenant à un angle, ajoutent 4 % PFA/PBS, pH 7 pour couvrir les cellules. Garder dans cette solution pendant 20 min à température ambiante.
Retirer le mélange PFA/PBS et jeter comme des matières dangereuses.
Ajouter PBS, pipetage comme décrit ci-dessus.
Répétez les étapes 3.5 et 3.6 deux fois.
Supprimer les PBS en aspirant doucement.
Ajouter des tuyaux de 20 mM, saccharose de 200 mM, pH 7.
Enlever le tuyaux/saccharose en aspirant doucement.
Répétez les étapes 2.8 et 2.9 deux fois.
Rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe en arrière, puis définir la fenêtre sur une surface propre, comme un tapis de caoutchouc grille, sécher.

4. imagerie de Fluorescence des cellules de rayons x

Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur les fenêtres à l’aide d’un microscope optique.
Vernis à ongles permet de sécuriser les fenêtres à un titulaire en aluminium fournie par la source de rayonnement.
Insérez le support d’aluminium dans une monture cinématique et puis placez-le en position au point focal de l’optique dans le microscope à rayons x et à un angle d’environ 45° du faisceau de rayons x, monté sur les étapes de nanopositionnement échantillon.
Sortir de la zone d’instrument microscope à rayons x (habituellement une huche faite des murs de plomb) et ouvrir la trappe. Effectuer les étapes restantes à distance.
À l’aide d’une plaque de zone ou miroirs Kirkpatrick-Baez, concentrer le faisceau de rayons x monochromatique (habituellement 10 keV d’énergie) jusqu’à une taille de tache sub-micronique.
Utiliser les étapes d’échantillon de nanopositionnement et visualiser la position du faisceau de rayons x sur l’échantillon avec une caméra précalibré scintillateur en aval, déterminent la largeur appropriée et la hauteur du raster scan afin de capturer les données de l’échantillon.
Avec le détecteur de dérive de silicium dispersive en longueur d’onde à 90° pour le faisceau incident et environ 3 mm ou moins de l’échantillon, recueillir un spectre pour l’essai avec un temps de pause de 1 à 2 sec.
La visualisation du spectre pour l’essai, choisissez une durée appropriée pour l’analyse, pour fournir le signal sur bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
Choisissez une résolution appropriée pour l’analyse, ce qui n’est pas significativement plus petite que la taille de tache du faisceau sur l’échantillon, ni plus grand que les caractéristiques d’intérêt dans l’échantillon.
Programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.

Fluorescence des rayons x, ou XRF, la spectroscopie est une technique analytique non destructrice qui est utilisée pour effectuer l’analyse élémentaire des échantillons à la température ambiante.

XRF peut être appliqué à un éventail d’échantillons, y compris biologiques, médecine légale, environnementaux et même oeuvres d’art. Les échantillons peuvent aussi prendre une variété de formes, telles que les poudres et cristaux liquides. En XRF, un échantillon est bombardé par un faisceau de rayons x faisant émettre des rayons secondaires x à une énergie plus faible, que l’on appelle rayonnement fluorescent.

S’il est fait référence comme une technique de fluorescence, XRF diffère de la microscopie en fluorescence traditionnels car il n’utilise pas de lumière visible de plus faible énergie ou des molécules de lumière active.

Cette vidéo va introduire les bases de la XRF et montrent comment collecter des cartes élémentaires d’un échantillon biologique.

Quand un photon d’énergie suffisante entre en collision avec un atome, l’énergie est absorbée, excitant l’un des électrons coquille externe. Lorsque l’électron se détendra, il émet un photon secondaire, généralement d’énergie plus faible. Ce processus est connu comme la fluorescence. Contrairement aux photons de faible énergie, comme ceux utilisés dans la microscopie de fluorescence, les photons des rayons x sont assez énergiques pour expulser complètement électrons étroitement tenues d’une coque intérieure. Un électron d’une coquille d’énergie plus élevée puis tombera dans le poste vacant. Un photon proportionnel à la différence d’énergie entre les deux coques est libéré. Chaque élément émet un ensemble unique de photons, ou spectre, qui peut être utilisé pour identifier l’élément et déterminer la quantité présente. Ce phénomène est connu comme la fluorescence des rayons x.

Une fois un spectre élémentaire a été recueilli, les signaux des éléments d’intérêt peuvent être isolés. Les mesures peuvent être prises sur plusieurs sites à travers un échantillon, générant une image, un pixel à la fois. Ce processus est appelé raster scanning. Images de tous les éléments d’intérêt peuvent être générés par la suite. Ces cartes élémentaires fournissent des informations précieuses sur l’échantillon. Avec une compréhension de XRF, vous êtes maintenant prêt à préparer un échantillon de cellules biologiques pour produire des cartes élémentaires.

Pour commencer, tout d’abord préparer et stériliser une fenêtre de nitrure de silicium, qui tiendra l’échantillon en place pour l’analyse. Soyez prudent, car ils sont très fragiles. Orienter la fenêtre afin qu’il soit côté plat vers le haut. Puis placer la fenêtre dans une boîte de Pétri, et il respecte le plat à l’aide de petits morceaux de ruban adhésif.

Enfin, stériliser la fenêtre de nitrure de silicium avec un rayonnement UV pour 1 heure.

Maintenant que la fenêtre a été stérilisée, l’échantillon peut être fixée à celle-ci. Tout d’abord, tenez la boîte de Petri à angle et ajouter des éléments multimédias sur le côté du plat. Lentement, soulager l’inclinaison pour enrober la fenêtre. Ajouter des cellules à la capsule de la même manière et incuber.

Régulièrement observer les cellules au microscope léger jusqu’à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.

Dans une hotte à flux laminaire, aspirez doucement les médias du plat.

Ensuite, rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate pour enlever l’excès médiatique.

Aspirer le PBS et fixer les cellules avec du paraformaldéhyde. Après 20 min, retirer le mélange et jeter parmi les déchets dangereux.

Supprimer la fenêtre de la capsule et rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe. Définir la fenêtre sur une surface propre pour sécher.

Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur la fenêtre avec un microscope optique.

À l’aide de vernis à ongles transparent, fixer la fenêtre pour un support en aluminium.

Insérez le porte-échantillon dans la fixation de l’instrument, puis placer le support sur scène de positionnement des microscopes à rayons x.

Placer la fenêtre de l’échantillon au point focal de l’optique du microscope à rayons x, avec un angle de 45 degrés au faisceau incident.

Sortir de la zone de l’instrument et effectuer les étapes restantes à distance afin de minimiser l’exposition aux rayons x.

Ouvrir l’obturateur et permet de concentrer le faisceau de rayons x monochromatique jusqu’à une taille de tache sous micromètre optique.

La position de la tache peut être photographiée avec un appareil calibré. Utilisez les étapes de localisation, déterminer approprié width et height pour raster sur l’échantillon.

Recueillir un spectre pour l’essai de l’élément d’intérêt avec un temps de pause de 1 à 2 secondes.

Dans le spectre de test, choisissez un temps d’acquisition appropriée afin de fournir un rapport signal-bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.

Ensuite, déterminez la résolution nécessaire pour l’échantillon. La résolution doit être plus petit que les caractéristiques d’intérêt, mais plus grand que la taille du spot. Enfin, programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.

Dans cette expérience, une carte élémentaire d’une cellule a été réalisée pour plusieurs éléments différents. Beaucoup de métaux, tels que le cuivre, le fer et zinc est des substances nutritives dans la cellule et ont été clairement identifiés au sein de la cellule.

En déterminant où que chaque métal est trouvé dans la cellule, des informations précieuses peuvent être élucidées sur ses processus cellulaires normaux. En outre, les maladies à base de métal peuvent être comprises.

Fluorescence des rayons x est utilisé dans un large éventail de domaines scientifiques. La nature non destructifs de FRx permet son utilisation dans l’étude des artéfacts historiques. Historiens de l’art d’utiliser la technique pour déterminer les pigments utilisés à l’origine d’oeuvres d’art. Cela peut élucider des informations sur les activités, telles que la provenance, les couleurs qui ont disparu avec le temps et l’authenticité. Légistes utilisent également XRF dans l’investigation de scène de crime. Lorsqu’une arme à feu est déclenché, la région environnante est revêtue de résidu de coup de feu. Résidus de tir pistolet contient la poudre à Canon, amorce d’allumage et du metal de l’enveloppe et la balle. L’information recueillie au XRF peut identifier le coupable et l’arme utilisée.

Un autre domaine d’études qui se prête à la fluorescence x est paléontologie. Ici, une information élémentaire est récoltée dans un fossile de trilobite, un arthropode marin qui a vécu il y a plus de 250 millions ans.

En caractérisant la composition élémentaire des fossiles, nouvelles informations peuvent être obtenues sur la vie depuis longtemps disparue. Échantillons de nombreuses peuvent même fournir la composition des tissus mous qui se sont détériorées il y a longtemps.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE à fluorescence x. Vous devez maintenant comprendre la théorie de la spectroscopie des rayons x et la collecte des informations élémentaires d’un large éventail de sources.

Merci de regarder !

Results

La carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente est illustrée à la Figure 1. Chaque panneau présente la répartition d’un élément particulier (par exemple, cuivre, fer, zinc, etc.) sur la cellule. Le panneau intitulé « s_a » montre l’absorption des rayons x.

Figure 1. Carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Applications and Summary

Imagerie de fluorescence de rayons x peut être un outil utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences forensiques, géosciences, biologie, science des matériaux et même dans l’étude de notre patrimoine culturel. En science des matériaux, il peut aider à trouver des défauts en copeaux et catalyseurs faites avec des métaux. Travaux de patrimoine culturel, il a servi à identifier les métaux toxiques dans les cheveux de célébrités mortes (p. ex., Beethoven) et d’identifier la source des peintures utilisées dans l’art. En biologie, il est utilisé pour étudier les métaux naturels qui effectuent la biochimie important. En sciences de la terre, il est souvent utilisé pour étudier les événements relatés dans le dossier rock. Deux caractéristiques particulières qui rendent l’imagerie de fluorescence de rayons x utiles dans donc beaucoup de domaines est 1) son non destructive, ainsi que bon nombre des éléments qui sont rare, ou de valeur élevée peut être photographiée et 2) alors que la préparation des échantillons décrite ici pour les cellules est complexe, car les cellules doivent être séchées-pour nombreux matériaux tels que des roches, art ou autres articles, il y a très peu de préparation échantillon requis , autres qu’il doit être plat et exempt de poussière. Un synchrotron est obligatoire qui est le mieux accessible grâce à la collaboration avec des scientifiques de ces installations, la technique peut être très accessible.

Transcript

X-ray fluorescence, or XRF, spectroscopy is a non-destructive analytical technique that is used to perform elemental analysis of samples at room temperature.

XRF can be applied to a wide range of samples, including biological, forensic, environmental, and even works of art. The samples can also take a variety of forms, such as powders, crystals, and liquids. In XRF, a sample is bombarded with a beam of X-rays causing it to emit secondary X-rays at a lower energy, which are called fluorescent radiation.

Though it is referred to as a fluorescence technique, XRF differs from traditional fluorescence microscopy in that it does not use lower energy visible light, or light-active molecules.

This video will introduce the basics of XRF, and demonstrate how to collect elemental maps of a biological sample.

When a photon of sufficient energy collides with an atom, the energy is absorbed, exciting one of the outer shell electrons. As the electron relaxes, it emits a secondary photon, typically of lower energy. This process is known as fluorescence. Unlike lower-energy photons, like those used in fluorescence microscopy, X-ray photons are energetic enough to completely expel tightly held electrons from an inner shell. An electron from a higher-energy shell will then fall into the vacancy. A photon proportional to the energy difference between the two shells is released. Each element emits a unique set of photons, or spectrum, that can be used to identify the element and determine the quantity present. This phenomenon is known as X-ray fluorescence.

Once an elemental spectrum has been collected, the signals of elements of interest can be isolated. Measurements can be taken at multiple locations across a sample, generating an image, one pixel at a time. This process is known as raster scanning. Images of all elements of interest can be subsequently generated. These elemental maps provide valuable information about the sample. With an understanding of XRF, you are now ready to prepare a biological cell sample to generate elemental maps.

To begin, first prepare and sterilize a silicon nitride window, which will hold the sample in place for the scan. Use care, as they are very fragile. Orient the window so that it is flat side up. Then place the window in a culture dish, and adhere it to the dish using small pieces of adhesive tape.

Finally, sterilize the silicon nitride window with UV radiation for 1 hr.

Now that the window has been sterilized, the sample can be fixed to it. First, hold the culture dish at an angle and add media to the side of the dish. Slowly relieve the tilt to coat the window. Add cells to the dish in the same manner, and incubate.

Periodically observe the cells under a light microscope until they are ready to use.

In a laminar flow hood, gently aspirate the media from the dish.

Then, rinse the cells with phosphate buffered saline to remove excess media.

Aspirate the PBS, and fix the cells with paraformaldehyde. After 20 min, remove the mixture and dispose as hazardous waste.

Remove the window from the dish, and quickly blot the edges and back indentation of the window with a Kimwipe. Set the window on a clean surface to dry.

Once the sample is dry, verify the presence of cells on the window with a light microscope.

Using clear nail polish, secure the window to an aluminum holder.

Insert the sample holder into the instrument mount, then place the mount on the X-ray microscopes’ positioning stage.

Position the sample window at the focal point of the X-ray microscope optics, with a 45-degree angle to the incident beam.

Exit the instrument area and conduct the remaining steps remotely to minimize X-ray exposure.

Open the shutter, and use optics to focus the monochromatic X-ray beam down to a sub-micrometer spot size.

The position of the spot can be imaged with a pre-calibrated camera. Using the positioning stages, determine the appropriate width and height needed to raster over the sample.

Collect a test spectrum of the element of interest with a dwell time of 1 – 2 seconds.

From the test spectrum, choose an appropriate scan time in order to provide a sufficient signal-to-noise ratio for the elements of interest.

Then, determine the resolution needed for the sample. The resolution should be smaller than the features of interest, but larger than the spot size. Finally, program the scan into the scanning software, and collect the image.

In this experiment, an elemental map of a cell was performed for several different elements. Many metals, such as copper, iron, and zinc are important nutrients in the cell, and were clearly identified within the cell.

By determining where each metal is found in the cell, valuable information can be elucidated about its normal cellular processes. In addition, metal-based diseases can be understood.

X-ray fluorescence is used in a wide range of scientific fields. The non-destructive nature of XRF enables its use in the study of historical artifacts. Art historians utilize the technique to determine the pigments originally used in works of art. This can elucidate information about the work, such as the provenance, colors that have faded over time, and the authenticity. Forensic scientists also use XRF in crime scene investigation. When a gun is fired, the surrounding area is coated with gun shot residue. Gun shot residue contains gun powder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. The information collected with XRF can identify the culprit and weapon used.

Another field of study that lends itself to X-ray fluorescence is paleontology. Here, elemental information is collected from a trilobite fossil, a marine arthropod that lived over 250 million years ago.

By characterizing the elemental composition of fossils, new information can be gained about long extinct life. Better-preserved samples can even provide the composition of soft tissues that have deteriorated long ago.

You’ve just watched JoVE’s introduction to X-ray fluorescence. You should now understand the theory of X-ray spectroscopy and how to collect elemental information from a wide range of sources.

Thanks for watching!

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X-ray Fluorescence XRF Spectroscopy Elemental Analysis Non-destructive Technique Room Temperature Analysis Biological Samples Forensic Samples Environmental Samples Works Of Art Powders Crystals Liquids Fluorescent Radiation Fluorescence Technique X-ray Photons Inner Shell Electrons Secondary Photon Emission Element Identification