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La spectroscopie par fluorescence X, ou XRF, est une technique analytique non destructive utilisée pour effectuer l’analyse élémentaire d’échantillons à température ambiante.
La fluorescence X peut être appliquée à un large éventail d’échantillons, y compris des échantillons biologiques, médico-légaux, environnementaux et même des œuvres d’art. Les échantillons peuvent également prendre diverses formes, telles que des poudres, des cristaux et des liquides. Dans le domaine de la fluorescence Xx, un échantillon est bombardé d’un faisceau de rayons X, ce qui l’amène à émettre des rayons X secondaires à une énergie plus faible, appelés rayonnements fluorescents.
Bien qu’il s’agisse d’une technique de fluorescence, la XRF diffère de la microscopie à fluorescence traditionnelle en ce qu’elle n’utilise pas de lumière visible de faible énergie ou de molécules actives à la lumière.
Cette vidéo présente les principes de base de la fluorescence X et montre comment collecter des cartes élémentaires d’un échantillon biologique.
Lorsqu’un photon d’énergie suffisante entre en collision avec un atome, l’énergie est absorbée, excitant l’un des électrons de la couche externe. Lorsque l’électron se détend, il émet un photon secondaire, généralement de plus faible énergie. Ce processus est connu sous le nom de fluorescence. Contrairement aux photons de plus basse énergie, comme ceux utilisés en microscopie à fluorescence, les photons de rayons X sont suffisamment énergétiques pour expulser complètement les électrons étroitement maintenus d’une coquille interne. Un électron d’une couche de plus haute énergie tombera alors dans le vide. Un photon proportionnel à la différence d’énergie entre les deux couches est libéré. Chaque élément émet un ensemble unique de photons, ou spectre, qui peut être utilisé pour identifier l’élément et déterminer la quantité présente. Ce phénomène est connu sous le nom de fluorescence X.
Une fois qu’un spectre élémentaire a été collecté, les signaux des éléments d’intérêt peuvent être isolés. Les mesures peuvent être prises à plusieurs endroits sur un échantillon, générant une image, un pixel à la fois. Ce processus est connu sous le nom de balayage matriciel. Des images de tous les éléments d’intérêt peuvent être générées par la suite. Ces cartes élémentaires fournissent des informations précieuses sur l’échantillon. Avec une compréhension de la XRF, vous êtes maintenant prêt à préparer un échantillon de cellule biologique pour générer des cartes élémentaires.
Pour commencer, préparez et stérilisez d’abord une fenêtre en nitrure de silicium, qui maintiendra l’échantillon en place pour le balayage. Faites attention, car ils sont très fragiles. Orientez la fenêtre de manière à ce qu’elle soit à plat. Placez ensuite la fenêtre dans une boîte de culture et collez-la sur la boîte à l’aide de petits morceaux de ruban adhésif.
Enfin, stérilisez la fenêtre en nitrure de silicium avec un rayonnement UV pendant 1 h.
Maintenant que la fenêtre a été stérilisée, l’échantillon peut y être fixé. Tout d’abord, tenez la boîte de culture en biais et ajoutez du milieu sur le côté de la boîte. Relâchez lentement l’inclinaison pour recouvrir la fenêtre. Ajoutez les cellules dans la boîte de la même manière et incuberez.
Observez périodiquement les cellules au microscope optique jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
Dans une hotte à flux laminaire, aspirez doucement le média de la parabole.
Ensuite, rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate pour éliminer l’excès de milieu.
Aspirez le PBS et fixez les cellules avec du paraformaldéhyde. Après 20 min, retirez le mélange et jetez-le comme déchet dangereux.
Retirez la fenêtre de la parabole et épongez rapidement les bords et l’indentation arrière de la fenêtre avec un Kimwipe. Placez la fenêtre sur une surface propre pour qu’elle sèche.
Une fois l’échantillon sec, vérifiez la présence de cellules sur la fenêtre à l’aide d’un microscope optique.
À l’aide de vernis à ongles transparent, fixez la fenêtre à un support en aluminium.
Insérez le porte-échantillon dans le support de l’instrument, puis placez le support sur la platine de positionnement des microscopes à rayons X.
Positionnez la fenêtre de l’échantillon au point focal de l’optique du microscope à rayons X, avec un angle de 45 degrés par rapport au faisceau incident.
Sortez de la zone des instruments et effectuez les étapes restantes à distance pour minimiser l’exposition aux rayons X.
Ouvrez l’obturateur et utilisez l’optique pour focaliser le faisceau de rayons X monochromatique jusqu’à une taille de spot inférieure au micromètre.
La position du spot peut être imagée à l’aide d’une caméra pré-calibrée. À l’aide des étapes de positionnement, déterminez la largeur et la hauteur appropriées nécessaires pour tramer l’échantillon.
Collecter un spectre d’essai de l’élément d’intérêt avec un temps de séjour de 1 ? 2 secondes.
À partir du spectre d’essai, choisir une durée de balayage appropriée afin d’obtenir un rapport signal/bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
Ensuite, déterminez la résolution nécessaire pour l’échantillon. La résolution doit être inférieure aux caractéristiques d’intérêt, mais supérieure à la taille du spot. Enfin, programmez le balayage dans le logiciel de numérisation et collectez l’image.
Dans cette expérience, une carte élémentaire d’une cellule a été réalisée pour plusieurs éléments différents. De nombreux métaux, tels que le cuivre, le fer et le zinc, sont des nutriments importants dans la cellule et ont été clairement identifiés dans la cellule.
En déterminant où se trouve chaque métal dans la cellule, il est possible d’obtenir des informations précieuses sur ses processus cellulaires normaux. De plus, les maladies à base de métaux peuvent être comprises.
La fluorescence X est utilisée dans un large éventail de domaines scientifiques. La nature non destructive de la fluorescence X permet son utilisation dans l’étude d’artefacts historiques. Les historiens de l’art utilisent cette technique pour déterminer les pigments utilisés à l’origine dans les œuvres d’art. Cela peut élucider des informations sur l’œuvre, telles que la provenance, les couleurs qui se sont estompées avec le temps et l’authenticité. Les scientifiques médico-légaux utilisent également la fluorescence X dans les enquêtes sur les scènes de crime. Lorsqu’une arme à feu est tirée, la zone environnante est recouverte de résidus de balle. Les résidus de tir contiennent de la poudre à canon, de l’amorce d’allumage et du métal provenant de l’enveloppe et de la balle. Les informations recueillies avec la XRF permettent d’identifier le coupable et l’arme utilisée.
Un autre domaine d’étude qui se prête à la fluorescence X est la paléontologie. Ici, des informations élémentaires sont recueillies à partir d’un fossile de trilobite, un arthropode marin qui vivait il y a plus de 250 millions d’années.
En caractérisant la composition élémentaire des fossiles, on peut obtenir de nouvelles informations sur la vie éteinte depuis longtemps. Des échantillons mieux conservés peuvent même fournir la composition de tissus mous qui se sont détériorés il y a longtemps.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la fluorescence X. Vous devriez maintenant comprendre la théorie de la spectroscopie des rayons X et comment collecter des informations élémentaires à partir d’un large éventail de sources.
Merci d’avoir regardé !
