Spectrométrie de fluorescence des rayons X
Source : Laboratoire de Dr. Lydia Finney, Argonne National Laboratory
Fluorescence des rayons x est un induit, émis un rayonnement qui peut être utili…
1. préparer les fenêtres de nitrure de silicium
- Utiliser des pinces inversées pour ramasser une fenêtre (nitrure de silicium windows seront brisera en cas de chute).
- Placer la fenêtre sur une lame de verre, côté plat vers le haut.
- Respecter les petits morceaux de Scotch sur les côtés de la fenêtre et utilisez-les pour respecter les fenêtres vers le bas de la boîte de Pétri.
- Stériliser les fenêtres de Pétri avec les rayons UV. Ceci peut être accompli avec le paramètre auto-crosslink sur une armoire UV-réticulation, suivie par l’irradiation UV supplémentaire sous la lampe UV dans la hotte à flux laminaire pendant environ 1 h.
2. les cellules sur les vitres de nitrure de silicium stérilisé de placage
- Tenir le plat avec elle inclinée à un angle de 45°.
- Ajouter des éléments multimédias en pipettant également, du côté du plat et soulager lentement l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec les médias.
- Ajouter des cellules à la boîte de Petri, de la même manière et incuber.
- Observer les cellules occasionnellement à l’aide d’un microscope optique pour déterminer quand ils sont prêts à l’emploi.
3. la fixation et le séchage des cellules
- Dans une hotte à flux laminaire, retirez le support en aspirant doucement tout en inclinant le plat tel que décrit ci-dessus.
- Ajouter PBS, pipetage vers le côté du plat en le tenant à angle. Lentement, soulager l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec du PBS.
- Supprimer les PBS avec aspirant doucement.
- Pipetage vers le côté du plat et en tenant à un angle, ajoutent 4 % PFA/PBS, pH 7 pour couvrir les cellules. Garder dans cette solution pendant 20 min à température ambiante.
- Retirer le mélange PFA/PBS et jeter comme des matières dangereuses.
- Ajouter PBS, pipetage comme décrit ci-dessus.
- Répétez les étapes 3.5 et 3.6 deux fois.
- Supprimer les PBS en aspirant doucement.
- Ajouter des tuyaux de 20 mM, saccharose de 200 mM, pH 7.
- Enlever le tuyaux/saccharose en aspirant doucement.
- Répétez les étapes 2.8 et 2.9 deux fois.
- Rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe en arrière, puis définir la fenêtre sur une surface propre, comme un tapis de caoutchouc grille, sécher.
4. imagerie de Fluorescence des cellules de rayons x
- Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur les fenêtres à l’aide d’un microscope optique.
- Vernis à ongles permet de sécuriser les fenêtres à un titulaire en aluminium fournie par la source de rayonnement.
- Insérez le support d’aluminium dans une monture cinématique et puis placez-le en position au point focal de l’optique dans le microscope à rayons x et à un angle d’environ 45° du faisceau de rayons x, monté sur les étapes de nanopositionnement échantillon.
- Sortir de la zone d’instrument microscope à rayons x (habituellement une huche faite des murs de plomb) et ouvrir la trappe. Effectuer les étapes restantes à distance.
- À l’aide d’une plaque de zone ou miroirs Kirkpatrick-Baez, concentrer le faisceau de rayons x monochromatique (habituellement 10 keV d’énergie) jusqu'à une taille de tache sub-micronique.
- Utiliser les étapes d’échantillon de nanopositionnement et visualiser la position du faisceau de rayons x sur l’échantillon avec une caméra précalibré scintillateur en aval, déterminent la largeur appropriée et la hauteur du raster scan afin de capturer les données de l’échantillon.
- Avec le détecteur de dérive de silicium dispersive en longueur d’onde à 90° pour le faisceau incident et environ 3 mm ou moins de l’échantillon, recueillir un spectre pour l’essai avec un temps de pause de 1 à 2 sec.
- La visualisation du spectre pour l’essai, choisissez une durée appropriée pour l’analyse, pour fournir le signal sur bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
- Choisissez une résolution appropriée pour l’analyse, ce qui n’est pas significativement plus petite que la taille de tache du faisceau sur l’échantillon, ni plus grand que les caractéristiques d’intérêt dans l’échantillon.
- Programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.
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La spectroscopie par fluorescence X, ou XRF, est une technique analytique non destructive utilisée pour effectuer l’analyse élémentaire d’échantillons à température ambiante.
La fluorescence X peut être appliquée à un large éventail d’échantillons, y compris des échantillons biologiques, médico-légaux, environnementaux et même des œuvres d’art. Les échantillons peuvent également prendre diverses formes, telles que des poudres, des cristaux et des liquides. Dans le domaine de la fluorescence Xx, un échantillon est bombardé d’un faisceau de rayons X, ce qui l’amène à émettre des rayons X secondaires à une énergie plus faible, appelés rayonnements fluorescents.
Bien qu’il s’agisse d’une technique de fluorescence, la XRF diffère de la microscopie à fluorescence traditionnelle en ce qu’elle n’utilise pas de lumière visible de faible énergie ou de molécules actives à la lumière.
Cette vidéo présente les principes de base de la fluorescence X et montre comment collecter des cartes élémentaires d’un échantillon biologique.
Lorsqu’un photon d’énergie suffisante entre en collision avec un atome, l’énergie est absorbée, excitant l’un des électrons de la couche externe. Lorsque l’électron se détend, il émet un photon secondaire, généralement de plus faible énergie. Ce processus est connu sous le nom de fluorescence. Contrairement aux photons de plus basse énergie, comme ceux utilisés en microscopie à fluorescence, les photons de rayons X sont suffisamment énergétiques pour expulser complètement les électrons étroitement maintenus d’une coquille interne. Un électron d’une couche de plus haute énergie tombera alors dans le vide. Un photon proportionnel à la différence d’énergie entre les deux couches est libéré. Chaque élément émet un ensemble unique de photons, ou spectre, qui peut être utilisé pour identifier l’élément et déterminer la quantité présente. Ce phénomène est connu sous le nom de fluorescence X.
Une fois qu’un spectre élémentaire a été collecté, les signaux des éléments d’intérêt peuvent être isolés. Les mesures peuvent être prises à plusieurs endroits sur un échantillon, générant une image, un pixel à la fois. Ce processus est connu sous le nom de balayage matriciel. Des images de tous les éléments d’intérêt peuvent être générées par la suite. Ces cartes élémentaires fournissent des informations précieuses sur l’échantillon. Avec une compréhension de la XRF, vous êtes maintenant prêt à préparer un échantillon de cellule biologique pour générer des cartes élémentaires.
Pour commencer, préparez et stérilisez d’abord une fenêtre en nitrure de silicium, qui maintiendra l’échantillon en place pour le balayage. Faites attention, car ils sont très fragiles. Orientez la fenêtre de manière à ce qu’elle soit à plat. Placez ensuite la fenêtre dans une boîte de culture et collez-la sur la boîte à l’aide de petits morceaux de ruban adhésif.
Enfin, stérilisez la fenêtre en nitrure de silicium avec un rayonnement UV pendant 1 h.
Maintenant que la fenêtre a été stérilisée, l’échantillon peut y être fixé. Tout d’abord, tenez la boîte de culture en biais et ajoutez du milieu sur le côté de la boîte. Relâchez lentement l’inclinaison pour recouvrir la fenêtre. Ajoutez les cellules dans la boîte de la même manière et incuberez.
Observez périodiquement les cellules au microscope optique jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
Dans une hotte à flux laminaire, aspirez doucement le média de la parabole.
Ensuite, rincez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate pour éliminer l’excès de milieu.
Aspirez le PBS et fixez les cellules avec du paraformaldéhyde. Après 20 min, retirez le mélange et jetez-le comme déchet dangereux.
Retirez la fenêtre de la parabole et épongez rapidement les bords et l’indentation arrière de la fenêtre avec un Kimwipe. Placez la fenêtre sur une surface propre pour qu’elle sèche.
Une fois l’échantillon sec, vérifiez la présence de cellules sur la fenêtre à l’aide d’un microscope optique.
À l’aide de vernis à ongles transparent, fixez la fenêtre à un support en aluminium.
Insérez le porte-échantillon dans le support de l’instrument, puis placez le support sur la platine de positionnement des microscopes à rayons X.
Positionnez la fenêtre de l’échantillon au point focal de l’optique du microscope à rayons X, avec un angle de 45 degrés par rapport au faisceau incident.
Sortez de la zone des instruments et effectuez les étapes restantes à distance pour minimiser l’exposition aux rayons X.
Ouvrez l’obturateur et utilisez l’optique pour focaliser le faisceau de rayons X monochromatique jusqu’à une taille de spot inférieure au micromètre.
La position du spot peut être imagée à l’aide d’une caméra pré-calibrée. À l’aide des étapes de positionnement, déterminez la largeur et la hauteur appropriées nécessaires pour tramer l’échantillon.
Collecter un spectre d’essai de l’élément d’intérêt avec un temps de séjour de 1 ? 2 secondes.
À partir du spectre d’essai, choisir une durée de balayage appropriée afin d’obtenir un rapport signal/bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
Ensuite, déterminez la résolution nécessaire pour l’échantillon. La résolution doit être inférieure aux caractéristiques d’intérêt, mais supérieure à la taille du spot. Enfin, programmez le balayage dans le logiciel de numérisation et collectez l’image.
Dans cette expérience, une carte élémentaire d’une cellule a été réalisée pour plusieurs éléments différents. De nombreux métaux, tels que le cuivre, le fer et le zinc, sont des nutriments importants dans la cellule et ont été clairement identifiés dans la cellule.
En déterminant où se trouve chaque métal dans la cellule, il est possible d’obtenir des informations précieuses sur ses processus cellulaires normaux. De plus, les maladies à base de métaux peuvent être comprises.
La fluorescence X est utilisée dans un large éventail de domaines scientifiques. La nature non destructive de la fluorescence X permet son utilisation dans l’étude d’artefacts historiques. Les historiens de l’art utilisent cette technique pour déterminer les pigments utilisés à l’origine dans les œuvres d’art. Cela peut élucider des informations sur l’œuvre, telles que la provenance, les couleurs qui se sont estompées avec le temps et l’authenticité. Les scientifiques médico-légaux utilisent également la fluorescence X dans les enquêtes sur les scènes de crime. Lorsqu’une arme à feu est tirée, la zone environnante est recouverte de résidus de balle. Les résidus de tir contiennent de la poudre à canon, de l’amorce d’allumage et du métal provenant de l’enveloppe et de la balle. Les informations recueillies avec la XRF permettent d’identifier le coupable et l’arme utilisée.
Un autre domaine d’étude qui se prête à la fluorescence X est la paléontologie. Ici, des informations élémentaires sont recueillies à partir d’un fossile de trilobite, un arthropode marin qui vivait il y a plus de 250 millions d’années.
En caractérisant la composition élémentaire des fossiles, on peut obtenir de nouvelles informations sur la vie éteinte depuis longtemps. Des échantillons mieux conservés peuvent même fournir la composition de tissus mous qui se sont détériorés il y a longtemps.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la fluorescence X. Vous devriez maintenant comprendre la théorie de la spectroscopie des rayons X et comment collecter des informations élémentaires à partir d’un large éventail de sources.
Merci d’avoir regardé !
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Q1: How does X-ray fluorescence differ from traditional fluorescence microscopy?
XRF uses high-energy X-ray photons that expel tightly held electrons from inner shells, whereas traditional fluorescence microscopy uses lower-energy visible light and light-active molecules. X-ray photons are energetic enough to cause inner-shell ionization, producing characteristic fluorescent radiation unique to each element that enables elemental identification and quantification.
Q2: What happens when an X-ray photon collides with an atom in XRF?
A high-energy X-ray photon expels an electron from an inner shell of the atom. An electron from a higher-energy shell then falls into the vacancy, releasing a secondary photon proportional to the energy difference between the two shells. This emitted photon is characteristic of the specific element and forms the basis of elemental identification.
Q3: What types of samples can be analyzed using X-ray fluorescence?
XRF can be applied to biological, forensic, environmental, and art samples in various forms including powders, crystals, and liquids. The non-destructive nature of XRF makes it ideal for analyzing historical artifacts, crime scene evidence, and paleontological fossils without damaging the original material.
Q4: How are elemental maps generated in XRF analysis?
Once an elemental spectrum is collected, signals of elements of interest are isolated and measured at multiple locations across a sample through raster scanning. This pixel-by-pixel process generates images for all elements of interest, producing elemental maps that reveal the spatial distribution and concentration of specific elements within the sample.
Q5: Why is sample preparation important before XRF analysis of biological cells?
Proper sample preparation ensures cells adhere securely to the silicon nitride window and remain intact during analysis. Sterilization with UV radiation, fixation with paraformaldehyde, and careful handling prevent contamination and cell damage, enabling accurate elemental mapping and reliable identification of metals like copper, iron, and zinc within cellular structures.
Q6: What information can forensic scientists obtain from XRF analysis of gunshot residue?
Gunshot residue contains gunpowder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. XRF identifies the elemental composition of this residue, providing information that can identify the culprit and weapon used in crime scene investigations through the characteristic metal signatures present in the residue.
Q7: How does XRF contribute to understanding paleontological specimens?
By characterizing the elemental composition of fossils using XRF, researchers gain new information about long-extinct life forms. Better-preserved samples can reveal the elemental composition of soft tissues that deteriorated millions of years ago, providing insights into ancient organisms and their biological processes.