Name: Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant lARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Apprenez à identifier les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures mésencéphaliques à l'aide de l'expression eGFP et du séquençage ARN. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et les propriétés électrophysiologiques de ces neurones.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (DA017279, AG033954, DA037743), de la Fondation Michael J. Fox et de la Caltech Innovation Initiative finançant le laboratoire de génétique et de génomique Millard et Muriel Jacobs du California Institute of Technology. Nous remercions Brian Williams d’avoir optimisé le protocole de la bibliothèque RNA-Seq et de nous avoir fourni de l’aide. Nous remercions Henry Amrhein pour la formation informatique. Nous remercions Barbara J. Wold pour l’utilisation de son équipement et de son espace de laboratoire. Nous remercions Igor Antoshechkin pour le séquençage de la bibliothèque et pour la gestion des installations.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous isolons des cellules individuelles à partir d&#39;une population hétérogène utilisant un marqueur fluorescent, puis étudier chaque cellule avec une seule cellule ARN-seq. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP que nous récoltés et séquencés étaient neurones dopaminergiques en effet, en fonction de la présence des trois transcrits du gène DA liées suivantes, TH, DDC et SLC6A3. Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l&#39;ARN-Seq. Cela a été concordant a...

Maladie de Parkinson (PD) est une maladie incurable liée à l&#39;âge neurodégénérative. La cause de ce trouble relativement courant reste mal comprise. Il y a une perte généralisée des neurones dans le cerveau, avec la dégénérescence neuronale prononcée des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra (SNC), conduisant à des caractéristiques cliniques de diagnostic de la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. cultures mixtes primaires contenant des neurones dopaminergiques SNc sont particulièrement pertinents pour la maladie de Parkinson. Ventral tegmentale Area (VTA) neurones dopaminergiques ont été impliqués dans la récompense et la dépendance. Ventral mésencéphalique (VM) cultures embryonnaires mixtes primaires contiennent à la fois les neurones Snc VTA dopaminergique (DA) et les neurones GABAergiques. VM cultures primaires peuvent être utiles pour des essais de neuroprotection et d&#39;élucider la vulnérabilité sélective des neurones dopaminergiques. Il n&#39;y a aucun moyen fiable pour identifier les cellules dopaminergiques dans la culture en fonction de la morphologie. Ilre nous développons des techniques pour identifier et récolter les neurones dopaminergiques simples, et de construire une seule cellule, à rendement élevé des bibliothèques de séquençage de l&#39;ARN. Nous rapportons les données ARN transcriptomiques représentatives pour dopaminergique unique et les neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Ce protocole peut être utilisé pour la neuroprotection, la neurodégénérescence, et les dosages pharmacologiques pour étudier les effets de divers traitements sur le transcriptome DA / GABA. Parce que les neurones dopaminergiques représentent une petite minorité des neurones exprimés dans les cultures primaires VM, la capacité à identifier de manière fiable ces neurones dans les cultures vivantes permettra une gamme élargie d&#39;études unicellulaires. Ces nouvelles techniques faciliteront les progrès dans la compréhension des mécanismes qui se déroulent au niveau cellulaire et peuvent avoir des applications ailleurs dans les domaines des neurosciences et de la biologie moléculaire.

<table><tbody><tr><td></td><td>Papain Worthington Biochemical Corporation&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>solution saline équilibrée en écheveaux (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Sérum équin</td><td>donneur Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Milieu : Milieu neurobasal</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture contenant une forme stabilisée de L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine : GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>35050-061</td><td>Concentration finale de 0,5 mM.</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>17504-044</td><td>50x solution mère, 1x concentration finale.</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek· &nbsp ;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>L2020</td><td>Stocké à -20 &deg ; C en 20 & micro ; L aliquotes</td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I (DNase)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette bleues P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp ;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri peu profonde de 10 mm</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C, incubateur</td><td></td><td></td><td></td>à 5 % d’humidité</tr><tr><td>16 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences&nbsp ;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Equitech&nbsp ;</td><td>SD-0100HI</td><td>Solution mère à 100 %, concentration finale de 1 %.</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux à modèle standard</td><td>Outils de science fine</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince - 2x3 dents</td><td>Outils de science fine</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Dumont #55</td><td>Outils de science fine</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Aiguille 21 G</td><td>BD PrecisionGlide Aiguille</td><td>305167</td><td>100 aiguilles</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>modèle P-87</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Instrument Sutter</td><td>&nbsp ; Kit de séquençage MP-285</td><td></td></tr><tr><td>: Kit SMARTer Ultra Low RNA pour séquençage Illumina</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, y compris le kit Advantage2PCR</td></tr><tr><td>oligonucléotide (12 &micro ; M) : oligonucléotide SMARTer IIA (12 &micro ; M)</td><td></td><td></td><td>Du kit SMARTer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (100 unités)</td><td>SMARTcribe Transcriptase</td><td></td><td>inverse du kit SMARTer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Apprêt 1</td><td>3' CDSIIa primer&nbsp ;</td><td></td><td>Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS Amorce</td><td></td><td>PCR Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>50x 2 mélange de polymérase</td><td>50x Advantage 2 mélange</td><td></td> de polymérase <td>Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>10x tampon PCR</td><td>10x Advantage 2 Tampon</td><td></td><td>PCR Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>Pointes d’ARN</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Rack de refroidisseur</td><td>PCR IsoFreeze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de préparation d’échantillons d’ADN&nbsp ;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 échantillons</td></tr><tr><td>Mélange maître PCR</td><td>Nextera (NPM)</td><td></td><td>Du kit Nextera&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cocktail d’amorces PCR (PPC)</td><td>Nextera PCR primer cocktail (PPC)&nbsp ;</td><td></td><td>Du kit Nextera</td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Le kit Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse&nbsp ;</td><td>Bioanalyseur Agilent 2100.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques : Agencourt AMPure&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Lingette RNAse : Lingettes RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Taille 100 Feuilles</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>Sondes moléculaires&nbsp ;</td><td>Q32854</td><td>500 dosages</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel : Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre</td> <td>(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm de diamètre extérieur)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (ou équivalent)&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séquenceur</td><td>Illumina HiSeq instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP souche de souris&nbsp ;</td><td></td><td>Numéro de stock MMRRC : 000292-UNC</td><td>Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center</td></tr></tbody></table>

identification fiable de la vie neurones dopaminergiques dans les cultures mésencéphale utilisant l&#39;arn séquençage et th-promoteur-driven egfp expression

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> Dans la maladie de Parkinson (PD), il y a une perte neuronale répandue dans le cerveau avec une dégénérescence marquée des neurones dopaminergiques dans le snc, conduisant à la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. L&#39;identification des neurones dopaminergiques vivant dans ventral mésencéphalique (VM) des cultures primaires en utilisant un marqueur fluorescent fournit une autre façon d&#39;étudier la vulnérabilité sélective de ces neurones sans compter sur la immunocoloration des cellules fixes. Ici, nous isoler, dissocier, et les neurones VM de souris de culture pendant 3 semaines. Nous identifions alors les neurones dopaminergiques dans les cultures en utilisant eGFP fluorescence (entraînée par un promoteur Tyrosine hydroxylase (TH)). neurones individuels sont récoltés dans des tubes à centrifuger à l&#39;aide de micropipettes de verre. Ensuite, nous Lyse des cellules récoltées, et nous effectuons la synthèse d&#39;ADNc et transposon médiée &quot;tagmentation&quot; pour produire seule cellule ARN-Seq bibliothèques 1, 2,ass = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Après avoir passé une vérification de contrôle de qualité, les bibliothèques unicellulaires sont séquencées et l&#39;analyse ultérieure est réalisée pour mesurer l&#39;expression génique. Nous présentons les résultats transcriptome pour dopaminergique individuel et neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été recueillies et ont été séquencées neurones dopaminergiques. Ces techniques auront des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.

Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d' une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de la tyrosine hydroxylase, la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome d'ARN en utilisant l' ARN-seq (figure 1). Les données montrent que 100% des cellules TH-EGFP-positives qui ont été récoltés et séquencés sont des neurones dopaminergiques, bas...

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d&#39;une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l&#39;ARN-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures du mésencéphale en utilisant l’expression de l’eGFP induite par la tyrosine hydroxlase, la récolte de cellules uniques et la génération de banques de séquençage de l’ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la maladie de Parkinson et de la toxicomanie, car elle permet de réaliser des tests d’expression génique et électrophysiologiques sur des neurones dopaminergiques vivants identifiés en culture. L’avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants plutôt que fixes dans les cultures mésencéphaliques ventrales primaires.La démonstration de la première partie de la procédure sera assurée par Charlene Kim, une technicienne du laboratoire d’Henry Lester. Commencez par stabiliser la tête d’un embryon de souris à l’aide d’une pince fermement placée sur le museau, de sorte que la surface dorsale soit accessible. À l’aide d’une pince tenue dans l’autre main, pincez la couche de peau et le crâne juste avant la crête du mésencéphale et décollez la peau et le crâne caudelly le long de la ligne médiane.Placez la pince autour de la crête avec une pointe entre le cortex et le mésonépale et l’autre sur le cervelet. Pincez et retirez tout le mésencéphale. Placez le mésencéphale dans une boîte de Pétri avec HBSS froide sous un microscope de dissection.Sous le microscope à dissection, retournez le segment du cerveau de sorte que la face ventrale soit maintenant accessible. Il y a maintenant quatre quadrants visibles. Retirez toutes les méninges et le système vasculaire en saisissant doucement les méninges avec des pinces et en tirant vers le haut pour les éloigner du cerveau.Ensuite, placez une pince dans le ventricule à peu près au centre du segment. Ensuite, pour séparer le mésencéphale, faites une pincée dorsale, puis pincez médialement de chaque côté. Prenez les deux quadrants inférieurs en faisant des coupes latérales des deux côtés.L’aire tegmentale ventrale et la substantia nigra pars compacta se trouvent dans la section ventrale inférieure, qui semble dense. Placez le tissu disséqué contenant à la fois l’ATV et le SNC dans le HBSS frais dans une zone séparée de la boîte de Pétri. Après avoir disséqué tous les segments du cerveau, utilisez une pince et un scalpel numéro 11 pour couper chaque section du mésencéphale en morceaux de taille à peu près égale.Ensuite, utilisez une pointe de pipette P1000 à large alésage pour transférer tous les segments du mésencéphale coupés en quartiers dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir laissé le tissu se déposer et retiré le HBSS, ajoutez 500 microlitres de solution de papaïne. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après l’incubation, utilisez une pointe P1000 à large alésage pour transférer uniquement les segments du mésencéphale dans une aliquote d’un millilitre de solution de DNase I et laissez les segments se déposer au fond du tube. Ensuite, transférez uniquement les segments du mésencéphale dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de solution d’arrêt à froid. Remplacez le deuxième rinçage par un millilitre de solution d’arrêt fraîche et pipetez de haut en bas sept fois avec une pointe de pipette P1000 pour triturer les cellules.Ensuite, sous-couche la suspension cellulaire en pipetant lentement 200 microlitres de solution BSA à 4 % dans le fond du tube. Après une centrifugation à 280 x g pendant six minutes, aspirer le surnageant avec un P1000 et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de placage. Effectuez un comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre, puis diluez la suspension cellulaire à 1000 cellules par microlitre avec un milieu de placage.Plaquez 120 microlitres de suspension cellulaire sur des boîtes de culture enrobées de poly-D-lysine, de poly-L-ornithine et de laminine immédiatement après l’aspiration de la laminine, pour s’assurer que le revêtement ne sèche pas et ne forme pas une surface inégale. Ensuite, après une heure d’incubation, ajoutez soigneusement trois millilitres de milieu de culture à une zone non ensemencée de la boîte de culture pour minimiser la perturbation des cellules. Après trois semaines de culture, rincez la coupelle de culture avec deux millilitres de PBS Dulbecco’s sans RNase.Retirez le DPBS. Remplacez ensuite par un millilitre de DPBS frais pour la récolte. Utilisez l’ensemble de filtres GFP et l’objectif 40X sur un microscope à épifluorescence inversée pour identifier les neurones TH positifs fluorescents dans les cultures.Utilisez le micromanipulateur pour pipeter sur le soma cellulaire. Ensuite, utilisez un tube en plastique fixé à l’orifice latéral du porte-micropipette pour appliquer une aspiration douce afin d’aspirer le neurone dans la micropipette en verre. Retirez immédiatement la micropipette contenant la cellule de la solution de bain et placez l’embout à l’intérieur d’un tube PCR de 0,2 millilitre contenant un tampon de réaction.Cassez la pointe contre le côté du tube près du bas. Placez ensuite une aiguille de seringue stérile de calibre 21 à l’arrière de la micorpipette et appliquez une pression pour expulser le liquide restant de l’extrémité cassée de la micropipette. Centrifugez le tube de prélèvement pendant cinq secondes à l’aide d’une microcentrifugeuse de bureau, puis congelez-le dans de la glace sèche.Pendant que vous travaillez dans l’armoire PCR avec des réactifs sur de la glace, ou sur un bloc refroidisseur, préparez le premier mélange maître de souche plus 10 % de volume supplémentaire à température ambiante. Et un microlitre de trois amorces primaires, un et un microlitre de pointes d’ARN quantifiées à l’échantillon. Ensuite, incubez l’échantillon dans le thermocycleur pendant trois minutes à 72 degrés Celsius, puis placez les échantillons directement sur le support de la glacière PCR.Ensuite, ajoutez 5,5 microlitres du mélange maître préparé dans le tube de réaction dans un support de refroidisseur PCR et mélangez en pipetant doucement. Après avoir centrifugé le tube pendant cinq secondes, incuber dans un thermocycleur réglé sur les paramètres maintenant affichés à l’écran. Pour purifier l’ADNc du premier brin, ajoutez 25 microlitres de billes magnétiques vortex à température ambiante à l’échantillon.Mélangez en pipetant tout le volume de haut en bas au moins 10 fois. Ensuite, incubez à température ambiante pendant huit minutes pour permettre à l’ADNc de se lier aux billes. Placez ensuite les échantillons et les billes magnétiques sur le dispositif de séparation magnétique jusqu’à ce que le liquide apparaisse complètement clair et qu’il ne reste plus de billes dans le surnageant.Aspirez et jetez le surnageant. Faites tourner l’échantillon pendant cinq secondes pour recueillir le liquide sur le côté du tube. Placez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant 30 secondes.Retirez ensuite tout le surnageant restant avec le pipeteur P10 pour ne laisser que les billes avec de l’ADN lié. Ajoutez 50 microlitres du mélange maître PCR ds-cDNc, puis exécutez le programme de PCR de synthèse de deuxième brin pour obtenir l’ADNc double brin. Cet histogramme montre le nombre de gènes codant pour des protéines détectés dans les banques de séquençage d’ARN dopaminergique unicellulaire générées à partir de cellules positives TH-eGFP en fragments par kilobase de transcrit par million de lectures cartographiées.6 000 à 8 000 gènes protéiques ont été détectés dans les banques de cellules uniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq semaines, y compris le temps de dériver les cellules, de permettre la maturation des cellules en culture, les étapes de récolte et de génération de cellules et de génération de banques, le séquençage des banques et l’analyse préliminaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder un espace de travail exempt d’ARNase pour la génération de banques de recherche d’ARN et la récolte de cellules, de maintenir des techniques stériles tout au long de la culture cellulaire et de fabriquer des pipettes de taille appropriée pour la récolte de cellules uniques.N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte, l’évitement du contact avec la peau et les yeux, l’éloignement de la chaleur et des flammes nues et le port de vêtements de protection individuelle appropriés doivent toujours être prises. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’expression génique et l’analyse du réseau de gènes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont les traitements médicamenteux affectent l’expression des protéines dans les cellules dopaminergiques.

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En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA)...

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Les neurones dopaminergiques jouent un rôle régulateur essentiel dans le cerveau. Leur perte est associée à la maladie de Parkinson. Dans cette vidéo, nous montrons comment générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques centraux à partir de mésencéphale embryonnaire de souris. De telles cultures sont utiles pour étudier l’extrême vulnérabilité de ces neurones à divers stress.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.

Réactivation des cellules souches neurales dans les explants cérébraux de drosophiles en culture

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Cette étude présente une méthode robuste pour isoler les ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux, permettant la séparation totale des neurones par rapport aux neurites et la purification de l’ARN. Combiné à RTddPCR, cette approche permet une quantification absolue des transcrits à faible copie, facilitant les études sur le transport et la traduction locale de l’ARNm avec une grande sensibilité, une grande reproductibilité et une large applicabilité expérimentale.

Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

Apprenez à identifier les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures mésencéphaliques à l'aide de l'expression eGFP et du séquençage ARN. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et les propriétés électrophysiologiques de ces neurones.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant lARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression (Vidéo) | JoVE Journal

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

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