Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures du mésencéphale en utilisant l’expression de l’eGFP induite par la tyrosine hydroxlase, la récolte de cellules uniques et la génération de banques de séquençage de l’ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la maladie de Parkinson et de la toxicomanie, car elle permet de réaliser des tests d’expression génique et électrophysiologiques sur des neurones dopaminergiques vivants identifiés en culture. L’avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants plutôt que fixes dans les cultures mésencéphaliques ventrales primaires.

La démonstration de la première partie de la procédure sera assurée par Charlene Kim, une technicienne du laboratoire d’Henry Lester. Commencez par stabiliser la tête d’un embryon de souris à l’aide d’une pince fermement placée sur le museau, de sorte que la surface dorsale soit accessible. À l’aide d’une pince tenue dans l’autre main, pincez la couche de peau et le crâne juste avant la crête du mésencéphale et décollez la peau et le crâne caudelly le long de la ligne médiane.

Placez la pince autour de la crête avec une pointe entre le cortex et le mésonépale et l’autre sur le cervelet. Pincez et retirez tout le mésencéphale. Placez le mésencéphale dans une boîte de Pétri avec HBSS froide sous un microscope de dissection.

Sous le microscope à dissection, retournez le segment du cerveau de sorte que la face ventrale soit maintenant accessible. Il y a maintenant quatre quadrants visibles. Retirez toutes les méninges et le système vasculaire en saisissant doucement les méninges avec des pinces et en tirant vers le haut pour les éloigner du cerveau.

Ensuite, placez une pince dans le ventricule à peu près au centre du segment. Ensuite, pour séparer le mésencéphale, faites une pincée dorsale, puis pincez médialement de chaque côté. Prenez les deux quadrants inférieurs en faisant des coupes latérales des deux côtés.

L’aire tegmentale ventrale et la substantia nigra pars compacta se trouvent dans la section ventrale inférieure, qui semble dense. Placez le tissu disséqué contenant à la fois l’ATV et le SNC dans le HBSS frais dans une zone séparée de la boîte de Pétri. Après avoir disséqué tous les segments du cerveau, utilisez une pince et un scalpel numéro 11 pour couper chaque section du mésencéphale en morceaux de taille à peu près égale.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette P1000 à large alésage pour transférer tous les segments du mésencéphale coupés en quartiers dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir laissé le tissu se déposer et retiré le HBSS, ajoutez 500 microlitres de solution de papaïne. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après l’incubation, utilisez une pointe P1000 à large alésage pour transférer uniquement les segments du mésencéphale dans une aliquote d’un millilitre de solution de DNase I et laissez les segments se déposer au fond du tube. Ensuite, transférez uniquement les segments du mésencéphale dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de solution d’arrêt à froid. Remplacez le deuxième rinçage par un millilitre de solution d’arrêt fraîche et pipetez de haut en bas sept fois avec une pointe de pipette P1000 pour triturer les cellules.

Ensuite, sous-couche la suspension cellulaire en pipetant lentement 200 microlitres de solution BSA à 4 % dans le fond du tube. Après une centrifugation à 280 x g pendant six minutes, aspirer le surnageant avec un P1000 et remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de placage. Effectuez un comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre, puis diluez la suspension cellulaire à 1000 cellules par microlitre avec un milieu de placage.

Plaquez 120 microlitres de suspension cellulaire sur des boîtes de culture enrobées de poly-D-lysine, de poly-L-ornithine et de laminine immédiatement après l’aspiration de la laminine, pour s’assurer que le revêtement ne sèche pas et ne forme pas une surface inégale. Ensuite, après une heure d’incubation, ajoutez soigneusement trois millilitres de milieu de culture à une zone non ensemencée de la boîte de culture pour minimiser la perturbation des cellules. Après trois semaines de culture, rincez la coupelle de culture avec deux millilitres de PBS Dulbecco’s sans RNase.

Retirez le DPBS. Remplacez ensuite par un millilitre de DPBS frais pour la récolte. Utilisez l’ensemble de filtres GFP et l’objectif 40X sur un microscope à épifluorescence inversée pour identifier les neurones TH positifs fluorescents dans les cultures.

Utilisez le micromanipulateur pour pipeter sur le soma cellulaire. Ensuite, utilisez un tube en plastique fixé à l’orifice latéral du porte-micropipette pour appliquer une aspiration douce afin d’aspirer le neurone dans la micropipette en verre. Retirez immédiatement la micropipette contenant la cellule de la solution de bain et placez l’embout à l’intérieur d’un tube PCR de 0,2 millilitre contenant un tampon de réaction.

Cassez la pointe contre le côté du tube près du bas. Placez ensuite une aiguille de seringue stérile de calibre 21 à l’arrière de la micorpipette et appliquez une pression pour expulser le liquide restant de l’extrémité cassée de la micropipette. Centrifugez le tube de prélèvement pendant cinq secondes à l’aide d’une microcentrifugeuse de bureau, puis congelez-le dans de la glace sèche.

Pendant que vous travaillez dans l’armoire PCR avec des réactifs sur de la glace, ou sur un bloc refroidisseur, préparez le premier mélange maître de souche plus 10 % de volume supplémentaire à température ambiante. Et un microlitre de trois amorces primaires, un et un microlitre de pointes d’ARN quantifiées à l’échantillon. Ensuite, incubez l’échantillon dans le thermocycleur pendant trois minutes à 72 degrés Celsius, puis placez les échantillons directement sur le support de la glacière PCR.

Ensuite, ajoutez 5,5 microlitres du mélange maître préparé dans le tube de réaction dans un support de refroidisseur PCR et mélangez en pipetant doucement. Après avoir centrifugé le tube pendant cinq secondes, incuber dans un thermocycleur réglé sur les paramètres maintenant affichés à l’écran. Pour purifier l’ADNc du premier brin, ajoutez 25 microlitres de billes magnétiques vortex à température ambiante à l’échantillon.

Mélangez en pipetant tout le volume de haut en bas au moins 10 fois. Ensuite, incubez à température ambiante pendant huit minutes pour permettre à l’ADNc de se lier aux billes. Placez ensuite les échantillons et les billes magnétiques sur le dispositif de séparation magnétique jusqu’à ce que le liquide apparaisse complètement clair et qu’il ne reste plus de billes dans le surnageant.

Aspirez et jetez le surnageant. Faites tourner l’échantillon pendant cinq secondes pour recueillir le liquide sur le côté du tube. Placez les échantillons sur le dispositif de séparation magnétique pendant 30 secondes.

Retirez ensuite tout le surnageant restant avec le pipeteur P10 pour ne laisser que les billes avec de l’ADN lié. Ajoutez 50 microlitres du mélange maître PCR ds-cDNc, puis exécutez le programme de PCR de synthèse de deuxième brin pour obtenir l’ADNc double brin. Cet histogramme montre le nombre de gènes codant pour des protéines détectés dans les banques de séquençage d’ARN dopaminergique unicellulaire générées à partir de cellules positives TH-eGFP en fragments par kilobase de transcrit par million de lectures cartographiées.

6 000 à 8 000 gènes protéiques ont été détectés dans les banques de cellules uniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq semaines, y compris le temps de dériver les cellules, de permettre la maturation des cellules en culture, les étapes de récolte et de génération de cellules et de génération de banques, le séquençage des banques et l’analyse préliminaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder un espace de travail exempt d’ARNase pour la génération de banques de recherche d’ARN et la récolte de cellules, de maintenir des techniques stériles tout au long de la culture cellulaire et de fabriquer des pipettes de taille appropriée pour la récolte de cellules uniques.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte, l’évitement du contact avec la peau et les yeux, l’éloignement de la chaleur et des flammes nues et le port de vêtements de protection individuelle appropriés doivent toujours être prises. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’expression génique et l’analyse du réseau de gènes peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont les traitements médicamenteux affectent l’expression des protéines dans les cellules dopaminergiques.