Name: Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant lARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Apprenez à identifier les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures mésencéphaliques à l'aide de l'expression eGFP et du séquençage ARN. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et les propriétés électrophysiologiques de ces neurones.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (DA017279, AG033954, DA037743), de la Fondation Michael J. Fox et de la Caltech Innovation Initiative finançant le laboratoire de génétique et de génomique Millard et Muriel Jacobs du California Institute of Technology. Nous remercions Brian Williams d’avoir optimisé le protocole de la bibliothèque RNA-Seq et de nous avoir fourni de l’aide. Nous remercions Henry Amrhein pour la formation informatique. Nous remercions Barbara J. Wold pour l’utilisation de son équipement et de son espace de laboratoire. Nous remercions Igor Antoshechkin pour le séquençage de la bibliothèque et pour la gestion des installations.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous isolons des cellules individuelles à partir d&#39;une population hétérogène utilisant un marqueur fluorescent, puis étudier chaque cellule avec une seule cellule ARN-seq. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP que nous récoltés et séquencés étaient neurones dopaminergiques en effet, en fonction de la présence des trois transcrits du gène DA liées suivantes, TH, DDC et SLC6A3. Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l&#39;ARN-Seq. Cela a été concordant a...

Maladie de Parkinson (PD) est une maladie incurable liée à l&#39;âge neurodégénérative. La cause de ce trouble relativement courant reste mal comprise. Il y a une perte généralisée des neurones dans le cerveau, avec la dégénérescence neuronale prononcée des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra (SNC), conduisant à des caractéristiques cliniques de diagnostic de la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. cultures mixtes primaires contenant des neurones dopaminergiques SNc sont particulièrement pertinents pour la maladie de Parkinson. Ventral tegmentale Area (VTA) neurones dopaminergiques ont été impliqués dans la récompense et la dépendance. Ventral mésencéphalique (VM) cultures embryonnaires mixtes primaires contiennent à la fois les neurones Snc VTA dopaminergique (DA) et les neurones GABAergiques. VM cultures primaires peuvent être utiles pour des essais de neuroprotection et d&#39;élucider la vulnérabilité sélective des neurones dopaminergiques. Il n&#39;y a aucun moyen fiable pour identifier les cellules dopaminergiques dans la culture en fonction de la morphologie. Ilre nous développons des techniques pour identifier et récolter les neurones dopaminergiques simples, et de construire une seule cellule, à rendement élevé des bibliothèques de séquençage de l&#39;ARN. Nous rapportons les données ARN transcriptomiques représentatives pour dopaminergique unique et les neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Ce protocole peut être utilisé pour la neuroprotection, la neurodégénérescence, et les dosages pharmacologiques pour étudier les effets de divers traitements sur le transcriptome DA / GABA. Parce que les neurones dopaminergiques représentent une petite minorité des neurones exprimés dans les cultures primaires VM, la capacité à identifier de manière fiable ces neurones dans les cultures vivantes permettra une gamme élargie d&#39;études unicellulaires. Ces nouvelles techniques faciliteront les progrès dans la compréhension des mécanismes qui se déroulent au niveau cellulaire et peuvent avoir des applications ailleurs dans les domaines des neurosciences et de la biologie moléculaire.

<table><tbody><tr><td></td><td>Papain Worthington Biochemical Corporation&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>solution saline équilibrée en écheveaux (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Sérum équin</td><td>donneur Thermo Scientific&nbsp ;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Milieu : Milieu neurobasal</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture contenant une forme stabilisée de L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine : GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>35050-061</td><td>Concentration finale de 0,5 mM.</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>17504-044</td><td>50x solution mère, 1x concentration finale.</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek· &nbsp ;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>L2020</td><td>Stocké à -20 &deg ; C en 20 & micro ; L aliquotes</td></tr><tr><td>Déoxyribonucléase I (DNase)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette bleues P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp ;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri peu profonde de 10 mm</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C, incubateur</td><td></td><td></td><td></td>à 5 % d’humidité</tr><tr><td>16 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences&nbsp ;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Equitech&nbsp ;</td><td>SD-0100HI</td><td>Solution mère à 100 %, concentration finale de 1 %.</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux à modèle standard</td><td>Outils de science fine</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince - 2x3 dents</td><td>Outils de science fine</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Dumont #55</td><td>Outils de science fine</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pince - Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Aiguille 21 G</td><td>BD PrecisionGlide Aiguille</td><td>305167</td><td>100 aiguilles</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>modèle P-87</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Instrument Sutter</td><td>&nbsp ; Kit de séquençage MP-285</td><td></td></tr><tr><td>: Kit SMARTer Ultra Low RNA pour séquençage Illumina</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, y compris le kit Advantage2PCR</td></tr><tr><td>oligonucléotide (12 &micro ; M) : oligonucléotide SMARTer IIA (12 &micro ; M)</td><td></td><td></td><td>Du kit SMARTer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (100 unités)</td><td>SMARTcribe Transcriptase</td><td></td><td>inverse du kit SMARTer&nbsp ;</td></tr><tr><td>Apprêt 1</td><td>3' CDSIIa primer&nbsp ;</td><td></td><td>Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS Amorce</td><td></td><td>PCR Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>50x 2 mélange de polymérase</td><td>50x Advantage 2 mélange</td><td></td> de polymérase <td>Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>10x tampon PCR</td><td>10x Advantage 2 Tampon</td><td></td><td>PCR Du kit SMARTer</td></tr><tr><td>Pointes d’ARN</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Rack de refroidisseur</td><td>PCR IsoFreeze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de préparation d’échantillons d’ADN&nbsp ;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 échantillons</td></tr><tr><td>Mélange maître PCR</td><td>Nextera (NPM)</td><td></td><td>Du kit Nextera&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cocktail d’amorces PCR (PPC)</td><td>Nextera PCR primer cocktail (PPC)&nbsp ;</td><td></td><td>Du kit Nextera</td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Le kit Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse&nbsp ;</td><td>Bioanalyseur Agilent 2100.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Perles magnétiques : Agencourt AMPure&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Lingette RNAse : Lingettes RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Taille 100 Feuilles</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>Sondes moléculaires&nbsp ;</td><td>Q32854</td><td>500 dosages</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel : Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire en verre</td> <td>(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm de diamètre extérieur)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (ou équivalent)&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séquenceur</td><td>Illumina HiSeq instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP souche de souris&nbsp ;</td><td></td><td>Numéro de stock MMRRC : 000292-UNC</td><td>Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center</td></tr></tbody></table>

identification fiable de la vie neurones dopaminergiques dans les cultures mésencéphale utilisant l&#39;arn séquençage et th-promoteur-driven egfp expression

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> Dans la maladie de Parkinson (PD), il y a une perte neuronale répandue dans le cerveau avec une dégénérescence marquée des neurones dopaminergiques dans le snc, conduisant à la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. L&#39;identification des neurones dopaminergiques vivant dans ventral mésencéphalique (VM) des cultures primaires en utilisant un marqueur fluorescent fournit une autre façon d&#39;étudier la vulnérabilité sélective de ces neurones sans compter sur la immunocoloration des cellules fixes. Ici, nous isoler, dissocier, et les neurones VM de souris de culture pendant 3 semaines. Nous identifions alors les neurones dopaminergiques dans les cultures en utilisant eGFP fluorescence (entraînée par un promoteur Tyrosine hydroxylase (TH)). neurones individuels sont récoltés dans des tubes à centrifuger à l&#39;aide de micropipettes de verre. Ensuite, nous Lyse des cellules récoltées, et nous effectuons la synthèse d&#39;ADNc et transposon médiée &quot;tagmentation&quot; pour produire seule cellule ARN-Seq bibliothèques 1, 2,ass = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Après avoir passé une vérification de contrôle de qualité, les bibliothèques unicellulaires sont séquencées et l&#39;analyse ultérieure est réalisée pour mesurer l&#39;expression génique. Nous présentons les résultats transcriptome pour dopaminergique individuel et neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été recueillies et ont été séquencées neurones dopaminergiques. Ces techniques auront des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.

Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d' une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de la tyrosine hydroxylase, la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome d'ARN en utilisant l' ARN-seq (figure 1). Les données montrent que 100% des cellules TH-EGFP-positives qui ont été récoltés et séquencés sont des neurones dopaminergiques, bas...

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d&#39;une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l&#39;ARN-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

L’objectif global de cette procédure est d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures du mésencéphale en utilisant l’expression de l’eGFP induite par la tyrosine hydroxlase, la récolte de cellules uniques et la génération de banques de séquençage de l’ARN. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la maladie de Parkinson et de la toxicomanie, car elle permet de réaliser des tests d’expression génique et électrophysiologiques sur des neurones dopaminergiques vivants identifiés en culture. L’avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier de manière fiable les neurones dopaminergiques vivants plutôt que fixes dans les cultures mésencéphaliques ventrales primaires.La démonstration de la première partie de la procédure sera assurée par Charlene Kim, une technicienne du laboratoire d’Henry Lester. Commencez par stabiliser la tête d’un embryon de souris à l’aide d’une pince fermement placée sur le museau, de sorte que la surface dorsale soit accessible. À l’aide d’une pince tenue dans l’autre main, pincez la couche de peau et le crâne juste avant la crête du mésencéphale et décollez la peau et le crâ

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Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l'embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d'autres neurones ventraux.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

Pour évaluer la fonction et la régulation des gènes lors du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale, nous décrivons une méthode qui consiste...

En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA)...

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Les neurones dopaminergiques jouent un rôle régulateur essentiel dans le cerveau. Leur perte est associée à la maladie de Parkinson. Dans cette vidéo, nous montrons comment générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques centraux à partir de mésencéphale embryonnaire de souris. De telles cultures sont utiles pour étudier l’extrême vulnérabilité de ces neurones à divers stress.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.

Réactivation des cellules souches neurales dans les explants cérébraux de drosophiles en culture

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Cette étude présente une méthode robuste pour isoler les ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux, permettant la séparation totale des neurones par rapport aux neurites et la purification de l’ARN. Combiné à RTddPCR, cette approche permet une quantification absolue des transcrits à faible copie, facilitant les études sur le transport et la traduction locale de l’ARNm avec une grande sensibilité, une grande reproductibilité et une large applicabilité expérimentale.

Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

Apprenez à identifier les neurones dopaminergiques vivants dans les cultures mésencéphaliques à l'aide de l'expression eGFP et du séquençage ARN. Cette méthode permet d'analyser l'expression génique et les propriétés électrophysiologiques de ces neurones.

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Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

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