Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires

L’objectif général de cette procédure est de démontrer des méthodes pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les tissus vivants et fixes de l’organisme modèle drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie mitochondriale. Comme les mécanismes de régulation de la fonction mitochondriale.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle effectue une analyse détaillée de la relation structure/fonction mitochondriale. Après avoir trié cinq mouches femelles anesthésiées selon le protocole de texte, sous le microscope de dissection, utilisez deux paires de pinces pour sectionner le thorax de l’abdomen. Ensuite, transférez soigneusement les abdomens dans le deuxième puits du plat.

À l’aide d’une paire de pinces pour maintenir l’abdomen à l’extrémité postérieure, utilisez l’autre paire de pinces pour pousser lentement les ovaires vers l’extérieur. Ensuite, utilisez la pince pour tenir un ovaire individuel par l’extrémité postérieure opaque et déplacez-le soigneusement vers le troisième puits du plat pour le taquiner ou le fixer. Taquinez soigneusement la gaine protectrice autour des ovaires, en utilisant une paire de pinces pour tenir l’extrémité postérieure et en balayant légèrement une aiguille taquine de l’extrémité postérieure à l’extrémité antérieure.

Pour préparer des chambres recouvertes de polylysène, placez deux gouttes séparées de 20 microlitres de polylysène sur le verre de couverture d’une boîte de Pétri à fond de verre. Faites sécher les plaques à l’air libre à 37 degrés Celsius pendant une heure et tracez le contour de la polylysine sur la face inférieure de la plaque. Réglez les paramètres de balayage sur le microscope confocal en ouvrant le logiciel d’acquisition d’images, et dans l’onglet d’acquisition, définissez les paramètres de balayage appropriés.

Cochez les cases Séries chronologiques, Blanchiment et Régions pour ouvrir les onglets individuels. Entrez ensuite les valeurs des paramètres d’acquisition appropriées dans chaque onglet. Ensuite, placez un ovaire disséqué et taquiné sur une région recouverte de polylysine marquée et utilisez une aiguille à taquiner pour écarter l’ovaire et séparer les ovaires.

Placez une goutte de 10 microlitres de produit de dissection d’insectes sur l’ovaire, en veillant à couvrir toute la zone recouverte de polylysine. Ensuite, couvrez la boîte de Pétri. Immédiatement après le montage de l’ovaire, placez l’échantillon sur la platine du microscope et utilisez l’oculaire pour localiser rapidement le champ d’intérêt dans le tissu vivant.

Cliquez sur en direct pour acquérir une image en direct du champ d’intérêt sélectionné, puis cliquez sur arrêter pour arrêter le balayage en direct. Si nécessaire, ajustez les paramètres d’acquisition de sorte que le signal fluorescent détecté soit inférieur aux niveaux de saturation avec l’arrière-plan défini en ajustant les valeurs de décalage. Depuis l’onglet graphique, utilisez l’outil de dessin de Bézier pour dessiner un petit ROI afin de délimiter la zone de blanchiment de la photo sur l’image acquise par numérisation.

Effectuez ensuite l’acquisition d’images, en cliquant sur démarrer l’expérience. Pour effectuer une coloration en direct avec des colorants mitochondriaux fluorescents, diluez le stock de colorants dans un milieu de dissection chaud jusqu’aux concentrations de travail finales. Une fois la dissection et les taquineries démontrées plus tôt, placez les ovaires dans 200 microlitres de solution de coloration dans un puits d’une boîte de dissection.

Couvrez le plat d’une boîte enveloppée de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubez le tissu pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les ovaires tachés à l’aide d’une pince pour les déplacer soigneusement dans trois puits consécutifs contenant du milieu sans tache. Pour la co-coloration avec TMRE, dans la coloration mitrochondriale globale compatible, effectuez d’abord la coloration avec TMRE, puis sans laver le tissu, transférez immédiatement l’échantillon dans la coloration mitochondriale globale.

Après avoir lavé et monté les ovaires, comme démontré précédemment dans cette vidéo, pour effectuer une imagerie confocale sur l’échantillon, cochez la case de section en Z pour ouvrir l’onglet. Tournez la molette de mise au point vers le bas de l’échantillon pendant qu’il est scanné en direct et cliquez sur set-first pour définir la section en Z la plus basse. Déplacez ensuite la molette de mise au point dans la direction opposée pour définir la section la plus haute.

Effectuez l’acquisition d’images en cliquant sur démarrer l’expérience. Dans le cas de la xvivamicroscopie en direct, les données doivent être obtenues dans les 15 minutes suivant le montage des tissus, sinon les résultats expérimentaux peuvent être affectés par des altérations de la physiologie dues à la mort du tissu. Immédiatement après la dissection, sous une hotte, placez les ovaires dans 200 microlitres de PFA frais à température ambiante dans le puits d’un plat de dissection en verre.

Incuber le tissu pendant 15 minutes pour le fixer. Après avoir lavé les ovaires dans le PBS selon le protocole textuel, alors qu’il est encore dans le PBS, taquinez les ovaires pour retirer soigneusement la gaine de fibre protectrice qui peut entraver l’accès de l’antigène de l’anticorps. Perméabiliser les ovaires taquinés en les plaçant dans un tube de microfusion avec 500 microlitres de tritan à 0,5 pour cent x 100 dans du PBS.

Ensuite, placez le tube dans une boîte couverte et réglez-le à 25 tr/min pendant 30 minutes. Retirez le PBS/TX selon le protocole de texte, bloquez le tissu en ajoutant 200 microlitres de BSA dissous dans 0,5 pour cent de PBS/TX. Incuber les échantillons sur le rocker à température ambiante pendant une heure.

Après avoir retiré la solution bloquante, ajoutez la désycline E anti-rage et les anticorps anti-ATPB de souris. Incuber le tissu sur le transat à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, utilisez PBS-TX pour laver les ovaires trois fois pendant 15 minutes chacune.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaires appropriés et du PBS-TX frais et incubez à température ambiante pendant une heure. Après avoir lavé le mouchoir deux fois, ajoutez des crochets au troisième lavage. Ensuite, à l’aide d’un micropipette d’un millilitre, retirez les ovaires immuno-colorés du tube de microfusion dans un puits frais d’une boîte de dissection en verre contenant 200 microlitres de PBS.

Ajoutez une goutte de produit de montage à base de glycérol sur une lame de verre et ajoutez les ovaires immuno-colorés un par un au milieu de montage. Sous un microscope de dissection, tout en tenant la partie opaque de l’ovaire avec une pince, utilisez une aiguille à taquiner pour retirer doucement les ovaires transparents des chambres opaques des ovules matures. Ensuite, retirez les chambres d’œufs matures du support de montage.

Placez un verre de protection sur la lame et appuyez légèrement pour vous assurer que le support de montage s’étale uniformément. Faites sécher les échantillons à l’air libre pendant 15 minutes avant d’utiliser du vernis à ongles pour sceller les bords. Enfin, effectuez une microscopie confocale au besoin.

Comme illustré ici, le retournement ciblé sur l’un des nuages mitochondriaux associés aux cellules nerveuses entraîne une perte de plus de 50 % du signal fluorescent des ROI bleus et blancs entourant le ROI rouge en 200 secondes, tandis que le ROI de contrôle jaune est minimalement blanchi. Les ovaires de la drosophile présentaient une diminution du signal avec une profondeur de tissu, et il est important de discerner la profondeur maximale du tissu dans laquelle les phlorophores tels que TMRE et mitostain peuvent être détectés lors de l’imagerie en direct. Une analyse qualitative de la co-coloration avec TMRE et de la coloration mitochondriale globale, montre que le germarium de drisophilla présente un potentiel mitochondrial plus élevé par unité de masse au stade 2B.

Dans cette figure, une analyse semi-qualitative démontre la différence de potentiel mitochondrial par unité de masse entre les AFC et les MBC, telle qu’analysée à partir d’une chambre d’œuf de stade 9. Ces images révèlent que l’absorption du mitosox se produit dans les cellules folliculaires mitotiques et post-mitotiques de la drisophille. Dans cette expérience, la coloration co-immunologique identifie un signal de décycline élevé chevauchant le signal ATPB mitochondrial et les clones noles DRP1 négatifs à la GFP dans le Germarium et dans une chambre d’œuf de stade 9.

Les méthodes décrites peuvent être modifiées et utilisées pour étudier la fonction de la structure mitochondriale dans d’autres tissus de drisophille. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer, de colorer et d’imager des ovaires de drisophille fixes et vivants pour étudier la structure et la fonction mitochonriales.