Name: Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez des méthodes d'analyse de la structure et de la fonction mitochondriales dans les ovaires de Drosophila melanogaster, en tissus vivants et fixés. Ces techniques permettent d'étudier les mécanismes régulateurs de la fonction mitochondriale.

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Nous remercions Leena Patel et Diamond Woodard pour leur aide dans la préparation du milieu de la drosophile et le Dr Igor Chesnokov pour avoir fourni l’accès au stéréomicroscope fixé à la caméra.

<ol><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Youle, R. J., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2C+fusion%2C+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission, fusion, and stress.</a> Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).</li>
<li>Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission-fusion+as+an+emerging+key+regulator+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation.</a> Bioessays. , (2013).</li>
<li>Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+division%3A+molecular+machinery+and+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions.</a> Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+functions+of+mitochondrial+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Physiological functions of mitochondrial fusion.</a> Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).</li>
<li>Liesa, M., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+the+regulation+of+nutrient+utilization+and+energy+expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure.</a> Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).</li>
<li>Hoppins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).</li>
<li>Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRP1-dependent+mitochondrial+fission+initiates+follicle+cell+differentiation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis.</a> J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).</li>
<li>Klusza, S., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+differentiation+and+proliferation%3A+precise+control+of+cell-cycle+changes+by+multiple+signaling+pathways+in+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells.</a> Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Parker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mitochondrial+pool+of+cyclin+E%2C+regulated+by+Drp1%2C+is+linked+to+cell-density-dependent+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).</li>
<li>Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+mitochondrial+axonal+transport+and+membrane+potential+without+increased+reactive+oxygen+species+production+in+a+Drosophila+model+of+Friedreich+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia.</a> J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+the+Drosophila+follicle+cell+epithelium+produces+%26%2334%3Bfalse+clones%26%2334%3B+with+apparent+polarity+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces &#34;false clones&#34; with apparent polarity phenotypes.</a> Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+progression+during+development+as+revealed+by+the+tenured+mutation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila.</a> Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).</li>
<li>Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+in+Drosophila%3A+Imaginal+Discs+as+a+Model+for+Epithelial+Tumor+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Étapes critiques dans le Protocole Photobleaching: Prévention photoblanchiment excessive des échantillons fluorescents est absolument nécessaire à l&#39;exécution efficace de la microscopie confocale. Par conséquent, le temps utilisé pour localiser des échantillons à travers l&#39;oculaire ou pour définir les paramètres d&#39;acquisition d&#39;image à travers le mode de balayage en direct devrait être réduit au minimum afin de minimiser photoblanchiment. <p class="jove_c...

Les mitochondries sont classiquement décrites comme la centrale cellulaire, car ils sont les principaux sièges de la production d&#39;énergie dans les cellules différenciées. En outre, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans le métabolisme, la génération de chaleur, une modification lipidique, le calcium et l&#39; homéostasie redox, l&#39;orchestration des processus de signalisation cellulaire, etc. 1. Les mitochondries jouent également un rôle actif dans l&#39;induction de la mort cellulaire 2, ainsi que dans la régulation du cycle cellulaire 3. Cette multi-fonctionnalité soulève les questions fondamentales suivantes: a) comment les mitochondries remplissent toutes ces fonctions simultanément et b) sont là piscines mitochondriaux spécifiques ou sous-zones qui sont spécialisés pour des fonctions distinctes? Dans ce contexte, il est important de noter que les mitochondries multifonctionnels sont dynamiques dans leur forme, la taille et la structure au sein des cellules individuelles et que la forme à l&#39;état stable des mitochondries peuvent varier entre les types de cellules. Des décennies de recherche de divers laboratoirepatronages suggèrent que la modification de la forme mitochondriale, la taille et la structure, la dynamique collectivement appelées mitochondries, est crucial pour le maintien de diverses fonctions mitochondriales 4,5,6. Ces résultats soulèvent la possibilité que les mitochondries peuvent accomplir leur multi-fonctionnalité en raison de leur dynamisme structurel. Des efforts considérables sont en cours pour comprendre la relation structure-fonction mitochondriale. Le dynamisme de la structure mitochondriale est principalement maintenu par leur aptitude à subir une fission et de fusion des événements les uns avec les autres. Fission de grandes mitochondries les convertit en éléments mitochondriales plus petits, tandis que la fusion entre deux mitochondries plus petites les fusionne en un élément mitochondrial plus grande 7. En outre, la fusion transitoire de deux mitochondries peut se produire pour permettre le mélange de leur contenu. La fission et de fusion événements des membranes mitochondriales interne et externe sont soigneusement régies par les spécificationstib ensembles de protéines. Le mécanisme de base de fission se compose de protéine apparentée à la dynamine-1 (DRP1), qui est recruté dans le cytosol vers la mitochondrie par son interaction avec certains de bonne protéines mitochondriales bonne (par exemple Fis1 ou Mff1), tandis que la fonction DRP1 peut également être régulée par d&#39; autres protéines sur la surface mitochondriale 4. Bien que DRP1 agit sur la membrane externe, ses capacités de fission impact sur la membrane interne aussi bien. L&#39;orchestration de la fission des membranes mitochondriales externes et internes ne sont pas bien compris. D&#39;un autre côté, la fusion de la membrane interne est régie au coeur par les activités de Opa1, tandis que mitofusins régissent la fusion de la membrane externe 5. Le solde des produits de fission et fusion contrecarrant événements de mitochondries dicter la forme mitochondriale à l&#39;état stable dans une cellule. Par exemple, la répression de la fission mitochondriale se traduirait par une fusion complète et sans opposition, alors que la sur-activité des mitochondriesl fission se traduirait par une fragmentation des mitochondries 3. L&#39;étude de la relation structure-fonction mitochondriale implique principalement deux approches complémentaires: a) l&#39;analyse des phénotypes cellulaires et organismales après la manipulation génétique des protéines fission / fusion mitochondriales et b) des évaluations directes de la structure et la fonction mitochondriale. Il est à noter que les analyses génétiques ne peuvent pas toujours révéler la fonctionnalité directe de la molécule à portée de main (dans ce cas, les protéines fission / fusion mitochondriales), que les phénotypes peuvent survenir en raison d&#39;effets secondaires. Par conséquent, il est de la plus haute importance pour développer et utiliser des outils pour étudier la structure et la fonction mitochondriale directement. Toute évaluation de la structure mitochondriale implique divers outils de microscopie. L&#39;utilisation de la microscopie à fluorescence de cellules vivantes a considérablement avancé les études de la dynamique mitochondriale, car le dynamisme mitochondrial peut être contrôlé à la fois qualitativement et quantitativement en utilisant les outils et techniques 8 de microscopie par fluorescence appropriés. Outils de microscopie par fluorescence ont été développées pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les tissus vivants et fixes Drosophila melanogaster, élucidant l&#39;importance du dynamisme mitochondriale in vivo 9. Ceux - ci et des procédés associés sont décrits ici, dans le but d&#39;étudier la structure et la fonction mitochondriale dans l&#39;ovaire chez la drosophile. L&#39;ovaire chez la drosophile est constituée de lignées germinales et somatiques, qui résultent de leurs cellules souches adultes respectives qui se trouvent dans le germarium 10,11. Seize cellules germinales syncytial (GCS) s&#39;encapsulées par les cellules folliculaires somatiques (FC) pour former des chambres d&#39;œufs individuels qui émergent de l&#39;germarium (Figure 1). L&#39;un des 16 glucocorticoïdes get engagé à devenir un ovocyte, et les 15 restants GCS développent dans les cellules nourricières qui soutiennent la croissance de la chambre de l&#39;ovocyte, Ce qui facilite la maturation de l&#39;œuf avant qu&#39;elle ne soit déposée. La majorité des FC subissent 9 séries de divisions mitotiques avant qu&#39;ils ne quittent le cycle cellulaire mitotique pour différencier terminale dans une couche de cellules épithéliales motif constitué par des cellules antérieure du follicule (AFC), les cellules du follicule postérieur (PFC) et principales cellules du corps (CBM) . Les chambres d&#39;œufs consécutives sont reliées par des cellules de tige, qui sont des cellules qui sont également dérivées des FC au début du développement différenciés. Forme mitochondriale régulée par mitochondrial DRP1 protéine de fission est activement impliquée dans le processus de différenciation au cours du développement normal de la FC couche ovarienne Drosophila 9,12. Les méthodes utilisées dans ces études pour déterminer l&#39;implication de la drosophile DRP1 développement de la couche de cellules folliculaires sont décrites ici.

<table><tbody><tr><td>Grace’s Media (milieu de dissection d’insectes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>30611031-2</td><td></td></tr><tr><td>41 Paraformaldéhyde AQ</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>50-259-99</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Green (coloration mitochondriale globale)</td><td>Life Technologies</td><td>m7514</td><td>Reconstituer et aliquote</td></tr><tr><td>Tétraméthylrhodamine ester éthyl ester perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87917-25MG</td><td>Reconstituer et aliquote</td></tr><tr><td>MitoSox (coloration Mito-Ros)</td><td>Life Technologies</td><td>m36008</td><td>Reconstituer et aliquote</td></tr><tr><td>PolyLysine</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN15017625</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de mouches</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Mouches coniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de mouches</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS273</td><td></td></tr><tr><td>Mouche Conique Flugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS 277</td><td></td></tr><tr><td>Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS153</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin E Antibody (d-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc- 33748</td><td></td></tr><tr><td>ATPB Anticorps [3D5] - Marqueur mitochondrial</td><td>AbCam</td><td>ab14730</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-175-144</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Fisher Scientific</td><td>H100</td><td></td></tr><tr><td>Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-252</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de microscope en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mat Tek Corp&nbsp ; Fond en verre Plat Mircrowell Fisher</td><td>Scientific</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Levure sèche active</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10140001</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Technologies</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin</td><td>Stand Fine Science Technologies</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Technologies</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>MYFP ( w[*] ; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7194</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Fly stuff</td><td>59-118</td><td></td></tr><tr><td>Sarbacane</td><td>Fly</td> stuff <td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>Blowgun needle</td><td>Flystuff</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zen&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Open source</td><td>Image J</td><td></td></tr><tr><td>Research Macro Zoom Microscope</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>QICAM Fast 1394 Appareil photo numérique refroidi, 12 bits, Mono&nbsp ;</td><td>QImaging</td><td>QIC-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>QCapture Pro 5.1</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Étudier mitochondrial structure et fonction drosophila ovaires

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. La microscopie à fluorescence est un outil indispensable pour l’évaluation directe de la structure et de la fonction mitochondriales dans les cellules vivantes et pour l’étude de la relation structure-fonction mitochondriale, qui est principalement modulée par les molécules régissant les événements de fission et de fusion entre les mitochondries. Cet article décrit et démontre des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les tissus vivants et fixes de l’organisme modèle Drosophila melanogaster. Le tissu de choix ici est l’ovaire de la drosophile, qui peut être isolé et rendu apte à la microscopie confocale en direct ex vivo. De plus, l’article décrit comment manipuler génétiquement la protéine de fission mitochondriale, Drp1, dans les ovaires de la drosophile pour étudier l’implication de la fission mitochondriale induite par Drp1 dans la modulation de la relation structure-fonction mitochondriale. L’utilisation généralisée de ces méthodes est démontrée dans des données déjà publiées ainsi que dans de nouvelles données. Les méthodes décrites peuvent être étendues à la compréhension de l’impact direct des nutriments et/ou des facteurs de croissance sur les propriétés mitochondriales ex vivo. Étant donné que la dysrégulation mitochondriale est à la base de l’étiologie de diverses maladies, les méthodes innovantes décrites développées dans un organisme modèle génétiquement traitable, la drosophile, devraient contribuer de manière significative à la compréhension des détails mécanistes de la relation structure-fonction mitochondriale et au développement de stratégies thérapeutiques dirigées vers les mitochondries.

Les procédés décrits peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction mitochondriale dans les ovaires vivants et fixes de Drosophila (figure 2B). Pourvu quelques exemples de résultats escomptés obtenus avec les méthodes décrites. Dissection de l'ovaire chez la drosophile: Lorsque disséqué en outre, les abdomens sectionnés (figure 3B) de l'...

L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. Des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile vivants et fixes sont décrites et démontrées dans cet article.

Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

L’objectif général de cette procédure est de démontrer des méthodes pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les tissus vivants et fixes de l’organisme modèle drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie mitochondriale. Comme les mécanismes de régulation de la fonction mitochondriale.Le principal avantage de cette technique est qu’elle effectue une analyse détaillée de la relation structure/fonction mitochondriale. Après avoir trié cinq mouches femelles anesthésiées selon le protocole de texte, sous le microscope de dissection, utilisez deux paires de pinces pour sectionner le thorax de l’abdomen. Ensuite, transférez soigneusement les abdomens dans le deuxième puits du plat.À l’aide d’une paire de pinces pour maintenir l’abdomen à l’extrémité postérieure, utilisez l’autre paire de pinces pour pousser lentement les ovaires vers l’extérieur. Ensuite, utilisez la pince pour tenir un ovaire individuel par l’extrémité postérieure opaque et déplacez-le soigneusement vers le troisième puits du plat pour le taquiner ou le fixer. Taquinez soigneusement la gaine protectrice autour des ovaires, en utilisant une paire de pinces pour tenir l’extrémité postérieure et en balayant légèrement une aiguille taquine de l’extrémité postérieure à l’extrémité antérieure.Pour préparer des chambres recouvertes de polylysène, placez deux gouttes séparées de 20 microlitres de polylysène sur le verre de couverture d’une boîte de Pétri à fond de verre. Faites sécher les plaques à l’air libre à 37 degrés Celsius pendant une heure et tracez le contour de la polylysine sur la face inférieure de la plaque. Réglez les paramètres de balayage sur le microscope confocal en ouvrant le logiciel d’acquisition d’images, et dans l’onglet d’acquisition, définissez les paramètres de balayage appropriés.Cochez les cases Séries chronologiques, Blanchiment et Régions pour ouvrir les onglets individuels. Entrez ensuite les valeurs des paramètres d’acquisition appropriées dans chaque onglet. Ensuite, placez un ovaire disséqué et taquiné sur une région recouverte de polylysine marquée et utilisez une aiguille à taquiner pour écarter l’ovaire et séparer les ovaires.Placez une goutte de 10 microlitres de produit de dissection d’insectes sur l’ovaire, en veillant à couvrir toute la zone recouverte de polylysine. Ensuite, couvrez la boîte de Pétri. Immédiatement après le montage de l’ovaire, placez l’échantillon sur la platine du microscope et utilisez l’oculaire pour localiser rapidement le champ d’intérêt dans le tissu vivant.Cliquez sur en direct pour acquérir une image en direct du champ d’intérêt sélectionné, puis cliquez sur arrêter pour arrêter le balayage en direct. Si nécessaire, ajustez les paramètres d’acquisition de sorte que le signal fluorescent détecté soit inférieur aux niveaux de saturation avec l’arrière-plan défini en ajustant les valeurs de décalage. Depuis l’onglet graphique, utilisez l’outil de dessin de Bézier pour dessiner un petit ROI afin de délimiter la zone de blanchiment de la photo sur l’image acquise par numérisation.Effectuez ensuite l’acquisition d’images, en cliquant sur démarrer l’expérience. Pour effectuer une coloration en direct avec des colorants mitochondriaux fluorescents, diluez le stock de colorants dans un milieu de dissection chaud jusqu’aux concentrations de travail finales. Une fois la dissection et les taquineries démontrées plus tôt, placez les ovaires dans 200 microlitres de solution de coloration dans un puits d’une boîte de dissection.Couvrez le plat d’une boîte enveloppée de papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubez le tissu pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les ovaires tachés à l’aide d’une pince pour les déplacer soigneusement dans trois puits consécutifs contenant du milieu sans tache. Pour la co-coloration avec TMRE, dans la coloration mitrochondriale globale compatible, effectuez d’abord la coloration avec TMRE, puis sans laver le tissu, transférez immédiatement l’échantillon dans la coloration mitochondriale globale.Après avoir lavé et monté les ovaires, comme démontré précédemment dans cette vidéo, pour effectuer une imagerie confocale sur l’échantillon, cochez la case de section en Z pour ouvrir l’onglet. Tournez la molette de mise au point vers le bas de l’échantillon pendant qu’il est scanné en direct et cliquez sur set-first pour définir la section en Z la plus basse. Déplacez ensuite la molette de mise au point dans la direction opposée pour définir la section la plus haute.Effectuez l’acquisition d’images en cliquant sur démarrer l’expérience. Dans le cas de la xvivamicroscopie en direct, les données doivent être obtenues dans les 15 minutes suivant le montage des tissus, sinon les résultats expérimentaux peuvent être affectés par des altérations de la physiologie dues à la mort du tissu. Immédiatement après la dissection, sous une hotte, placez les ovaires dans 200 microlitres de PFA frais à température ambiante dans le puits d’un plat de dissection en verre.Incuber le tissu pendant 15 minutes pour le fixer. Après avoir lavé les ovaires dans le PBS selon le protocole textuel, alors qu’il est encore dans le PBS, taquinez les ovaires pour retirer soigneusement la gaine de fibre protectrice qui peut entraver l’accès de l’antigène de l’anticorps. Perméabiliser les ovaires taquinés en les plaçant dans un tube de microfusion avec 500 microlitres de tritan à 0,5 pour cent x 100 dans du PBS.Ensuite, placez le tube dans une boîte couverte et réglez-le à 25 tr/min pendant 30 minutes. Retirez le PBS/TX selon le protocole de texte, bloquez le tissu en ajoutant 200 microlitres de BSA dissous dans 0,5 pour cent de PBS/TX. Incuber les échantillons sur le rocker à température ambiante pendant une heure.Après avoir retiré la solution bloquante, ajoutez la désycline E anti-rage et les anticorps anti-ATPB de souris. Incuber le tissu sur le transat à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, utilisez PBS-TX pour laver les ovaires trois fois pendant 15 minutes chacune.Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’anticorps secondaires appropriés et du PBS-TX frais et incubez à température ambiante pendant une heure. Après avoir lavé le mouchoir deux fois, ajoutez des crochets au troisième lavage. Ensuite, à l’aide d’un micropipette d’un millilitre, retirez les ovaires immuno-colorés du tube de microfusion dans un puits frais d’une boîte de dissection en verre contenant 200 microlitres de PBS.Ajoutez une goutte de produit de montage à base de glycérol sur une lame de verre et ajoutez les ovaires immuno-colorés un par un au milieu de montage. Sous un microscope de dissection, tout en tenant la partie opaque de l’ovaire avec une pince, utilisez une aiguille à taquiner pour retirer doucement les ovaires transparents des chambres opaques des ovules matures. Ensuite, retirez les chambres d’œufs matures du support de montage.Placez un verre de protection sur la lame et appuyez légèrement pour vous assurer que le support de montage s’étale uniformément. Faites sécher les échantillons à l’air libre pendant 15 minutes avant d’utiliser du vernis à ongles pour sceller les bords. Enfin, effectuez une microscopie confocale au besoin.Comme illustré ici, le retournement ciblé sur l’un des nuages mitochondriaux associés aux cellules nerveuses entraîne une perte de plus de 50 % du signal fluorescent des ROI bleus et blancs entourant le ROI rouge en 200 secondes, tandis que le ROI de contrôle jaune est minimalement blanchi. Les ovaires de la drosophile présentaient une diminution du signal avec une profondeur de tissu, et il est important de discerner la profondeur maximale du tissu dans laquelle les phlorophores tels que TMRE et mitostain peuvent être détectés lors de l’imagerie en direct. Une analyse qualitative de la co-coloration avec TMRE et de la coloration mitochondriale globale, montre que le germarium de drisophilla présente un potentiel mitochondrial plus élevé par unité de masse au stade 2B.Dans cette figure, une analyse semi-qualitative démontre la différence de potentiel mitochondrial par unité de masse entre les AFC et les MBC, telle qu’analysée à partir d’une chambre d’œuf de stade 9. Ces images révèlent que l’absorption du mitosox se produit dans les cellules folliculaires mitotiques et post-mitotiques de la drisophille. Dans cette expérience, la coloration co-immunologique identifie un signal de décycline élevé chevauchant le signal ATPB mitochondrial et les clones noles DRP1 négatifs à la GFP dans le Germarium et dans une chambre d’œuf de stade 9.Les méthodes décrites peuvent être modifiées et utilisées pour étudier la fonction de la structure mitochondriale dans d’autres tissus de drisophille. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer, de colorer et d’imager des ovaires de drisophille fixes et vivants pour étudier la structure et la fonction mitochonriales.

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