Name: Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez la détection de cyanobactéries dans les échantillons liquides et solides par immunoessai sur microarray fluorescent. Cette méthode permet un suivi simultané de multiples souches en trois à quatre heures pour la gestion de l'eau.

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Nous remercions le Dr Antonio Quesada de l&#39;Universidad Autónoma de Madrid pour fournir des souches de cyanobactéries. Ce travail a été financé par le Subdirección général de Proyectos de Investigación de l&#39;espagnol Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), accorde pas. AYA2011-24803 et ESP2014-58494-R.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, un dosage immunologique en sandwich en utilisant le multiplex fluorescent CYANOCHIP, un micro - réseau 17-anticorps pour la détection et l&#39; identification d&#39;une grande variété de genres de cyanobactéries, est décrite 22. Ces cyanobactéries représentent les genres benthiques et planctoniques les plus fréquents dans les habitats d&#39;eau douce, certains d&#39;entre eux étant des producteurs de toxines. Récemment, le format de dosage immunologique en sandwich fluorescent a été...

La détection et la surveillance des micro-organismes dans les communautés microbiennes naturelles complexes sont cruciales dans de nombreux domaines, y compris la biomédecine, l&#39;écologie de l&#39;environnement, et l&#39;astrobiologie. Les cyanobactéries sont des micro - organismes procaryotes bien connus pour leur capacité à former des fleurs (prolifération excessive) des cellules dans l&#39; eau douce. Ils sont omniprésents, et de nombreuses espèces sont capables de produire des toxines, ce qui conduit non seulement à un risque potentiel pour la santé humaine, mais aussi à un impact écologique. À cet égard, il est essentiel de développer des méthodes rapides et sensibles pour la détection précoce des cyanobactéries et / ou leurs toxines dans le sol et l&#39; eau. A cet effet, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) a été développé comme un outil pour les gestionnaires de l&#39;eau afin de les aider à prendre des décisions et, par conséquent, la mise en œuvre des programmes de gestion de l&#39;eau. Un large éventail de méthodes a été développé pour détecter et identifier cyancellules obacterial et cyanotoxines dans le sol et l&#39;eau, y compris la microscopie optique, la biologie moléculaire et des techniques immunologiques. Ces méthodes peuvent varier considérablement dans les informations qu&#39;ils fournissent. Techniques microscopiques sont basés sur la morphologie des cellules et la détection de la fluorescence in vivo à partir de pigments, tels que les cyanobactéries phycocyanine ou la chlorophylle a 1. Bien qu&#39;ils soient des méthodes rapides et bon marché pour en temps réel et une surveillance fréquente qui informent sur le type et le nombre de cyanobactéries présentes dans un échantillon, ils ne donnent pas d&#39; informations sur la toxicité potentielle. En outre, ils ont besoin d&#39; un certain niveau d&#39;expertise, estimant qu&#39;il est souvent très difficile de faire la distinction entre les espèces étroitement apparentées 2. Pour surmonter ces limitations, la microscopie optique doit être accompagnée par les deux essais de criblage biologiques et biochimiques et méthodes physico-chimiques pour l&#39;identification et la quantification des cyanotoxines. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; dosages immuno-enzymatiques (ELISA), des essais d&#39;inhibition de phosphate de protéines (LPRP), et des tests neurochimiques chez la souris sont des exemples de tests de dépistage biochimiques pour la détection de cyanotoxines. Alors que les deux premiers sont des méthodes rapides et sensibles, les faux positifs ont été décrits lors de l&#39;utilisation des tests ELISA et ÉPFVP sont limités à trois types de toxines. Le test souris est une technique qualitative avec une faible sensibilité et la précision, et une licence spéciale et de formation est nécessaire. En outre, il ne donne pas d&#39;informations sur le type de toxines présentes dans un échantillon. Cyanotoxines peuvent être identifiés et quantifiés par d&#39;autres méthodes d&#39;analyse, telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la spectrométrie de chromatographie en masse liquide (LC-MS), chromatographie en phase gazeuse (GC), chromatographie-spectrométrie de masse de gaz (GC-MS), ou laser temps désorption / ionisation assistée par matrice de vol (MALDI-TOF). Toutefois, cela est possible uniquement si les normes de référence, qui sont besoined pour déterminer les concentrations de toxines individuelles dans des échantillons complexes, sont disponibles 3, 4. En outre, ces procédés prennent du temps; nécessitent des équipements coûteux, les fournitures et la préparation des échantillons; et doit être exécuté par un personnel expérimenté et spécialisé. Les méthodes moléculaires à base ont été appliquées depuis des décennies pour détecter, identifier et quantifier les cyanobactéries et cyanotoxines leurs correspondants grâce à l&#39;information de séquence publiée dans les bases de données du génome (par exemple, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Parmi ces méthodes sont celles basées sur l&#39;amplification en chaîne par polymérase (PCR), ce qui nécessite la conception d&#39;ensembles d&#39;amorces pour l&#39;amplification de l&#39;ADN et dépendent de la connaissance préalable des séquences d&#39;ADN de différentes espèces de cyanobactéries. Bien que la détection du gène, comme l&#39;opéron phycocyanine, conduit à une identification précise au niveau du genre, certaines espèces ou souches ne sont pas détectés aveccette méthode. Cependant, les gènes codant pour une toxine, tels que ceux appartenant à l&#39;opéron microcystine, faciliter l&#39;identification des toxines dans les échantillons où les producteurs sont rares 5. Néanmoins, la détection de marqueurs de toxine par PCR ne signifie pas nécessairement une toxicité dans l&#39;environnement. En outre, l&#39;ensemble des amorces développées pour analyser l&#39;ensemble des espèces de producteurs de cyanobactéries et de toxines présentes dans un échantillon est encore incomplète, et d&#39; autres études doivent être réalisées pour identifier des espèces inconnues. D&#39; autres techniques de biologie moléculaire sont basées sur la PCR-non, comme l&#39; hybridation fluorescente in situ (FISH) , et des puces à ADN dans. Au cours des deux dernières décennies, la technologie des microréseaux a gagné en importance dans de nombreux domaines d&#39;application, en particulier dans la surveillance environnementale. Les puces à ADN permettent une distinction entre les espèces et les analytes 4, 6, 7 </sup&gt;, 8, 9, 10, mais elles sont considérées comme très laborieuse et prend du temps des tâches qui impliquent plusieurs étapes (par exemple, les performances des puces à ADN, l&#39; extraction de l&#39; ADN, amplification par PCR et d&#39; hybridation). Pour cette raison, les dosages moins consommatrices de temps basées sur des anticorps, tels que les biopuces immunologiques sandwich et compétitives, sont devenus une méthode à haut débit essentiel et fiable pour la détection d&#39;analytes multiples de l&#39; environnement 11, 12, 13. La capacité des anticorps à reconnaître spécifiquement les composés cibles et de détecter de petites quantités d&#39;analytes et de protéines, ainsi que la possibilité de produire des anticorps contre pratiquement toute substance, faire microréseaux d&#39;anticorps une technique puissante pour des fins environnementales. En outre, la possibilité de réaliser des analyses multiples en tant quedosage Ingle, avec des limites de détection variant de ppb à ppm, est l&#39; un des principaux avantages de cette méthode 14. Biocapteurs à base d&#39; anticorps se sont révélés être des outils sensibles et rapides pour la détection d&#39;une large gamme d&#39;agents pathogènes et de toxines dans la surveillance environnementale 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Bien que les méthodes d&#39;ADN impliquent plusieurs étapes, les microréseaux à base d&#39;anticorps ne nécessitent qu&#39;une petite préparation de l&#39;échantillon qui est principalement basée sur une étape de lyse courte dans un tampon de solution appropriée. Ligler Delehanty et 15 ont rapporté la détection simultanée des protéines bactériennes et des analytes dans des mélanges complexes à base d&#39;un dosage immunologique sandwich d&#39; anticorps capable de détecter une concentration en protéine de 4 parties par milliard d&#39;j 10 4 ufc / ml de cellules. Szkola et al. 21 ont développé un microréseau multiplex fiable et pas cher pour la détection simultanée de proteotoxins et de petites toxines, des composés qui pourraient être utilisés dans la guerre biologique. Ils ont détecté des concentrations de toxine ricine, avec une limite de détection de 3 parties par milliard, en moins de 20 min. Récemment, le CYANOCHIP, un biocapteur basé sur un microréseau d&#39;anticorps pour la détection in situ de cyanobactéries toxiques et non toxiques, a été décrite 22. Cette microarray permet l&#39;identification des cyanobactéries blooms potentiels, surtout dans les milieux aquatiques, qui sont difficiles à identifier au microscope. La limite de détection de la puce est de 10 mars 2 à 10 cellules pour la plupart des espèces, en tournant ce biocapteur dans un outil rentable pour la détection multiplex et l&#39; identification des cyanobactéries, même au niveau de l&#39; espèce. Toutes ces propriétés font l&#39;Antibotechnique de microarray dy, et en particulier la méthode présentée dans ce travail, une méthode plus rapide et plus simple par rapport aux techniques mentionnées ci-dessus. Ce travail présente deux exemples d&#39;expériences qui utilisent un biocapteur à base de puces à ADN-anticorps pour détecter la présence de cyanobactéries dans des échantillons de sol et d&#39; eau. Il est une méthode simple et fiable basé sur un format de dosage immunologique en sandwich qui nécessite des volumes d&#39;échantillons très petits et la préparation des échantillons très basique. La méthode nécessite un court laps de temps et peut facilement être effectuée sur le terrain.

<table><tbody><tr><td>Filtres de pores de 0,22 mm</td><td>de diamètre Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>Pour la préparation d’immunogènes</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Eppendorf 5424R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour la préparation d’immunogènes</td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011036</td><td>50 mM phosphate de potassium, 150 mM NaCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Processeur à ultrasons UP50H</td><td>Hielscher</td><td></td><td>Pour la préparation d’immunogènes</td></tr><tr><td>Adjuvant complet de Freund&nbsp ;</td><td>Immunopotentialisateur</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td></tr><tr><td>Adjuvant de Freud incomplet</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>F5506</td><td>Pour injections de boost Kit de purification d’anticorps</td></tr> de <tr><td>protéine A&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURE1A&nbsp ;</td><td>Pour l’isolement des IgG</td></tr><tr><td>Dispositifs de filtrage centrifuge MWCO< 100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>Pour l’isolement des tubes de</td></tr><tr><td>dialyse</td><td>IgG, Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td> benzoylé <td>Pour l’isolement des colonnes IgG</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50</td><td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>Pour l’isolement du</td></tr><tr>réactif IgG<td>Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>Pour quantifier la concentration d’anticorps</td></tr><tr><td>Kit de dosage de la protéine MicroBCA&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>Pour quantifier la concentration en anticorps</td></tr><tr><td>Tampon de mise en réseau de protéines 2x</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&nbsp ;</td><td>S00537</td><td>Tampon d’impression ; 30 à 40 % de glycérol dans 1x PBS avec 0,01 % de Tween</td></tr><tr><td>20 Tween 20&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P9416</td><td>Détergent non ionique</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>A9418</td><td>Contrôle&nbsp ; pour l’impression, le réactif de blocage</td></tr><tr><td>Microplaque à 384 puits</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>Pour l’impression d’anticorps</td></tr><tr><td>Robot arrayer pour lames multiples MicroGrid</td><td>II TAS arrayer de Digilab</td><td></td><td>Pour l’impression d’anticorps</td></tr><tr><td>Lames de verre à substrat époxy</td><td>Arrayit corporation</td><td>VEPO25C</td><td>Support solide pour l’impression d’anticorps</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647 Ester de succinimidyle&nbsp ;</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A20006</td><td>Fluorochrome</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D8418</td><td>Dissolvant fluorochrome</td></tr><tr><td>Heidolph Titramax agitateur à plate-forme vibrante</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour le marquage des anticorps&nbsp ;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 colonnes&nbsp ;</td><td>Soins de santé</td><td>27-5330-01</td><td>Pour la purification des anticorps étiquetés</td></tr><tr><td>Tubes bruns de 0,5 mL scellés en toute sécurité</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>Pour le stockage des anticorps étiquetés&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Pour quantifier la concentration d’anticorps et l’efficacité du marquage</td></tr><tr><td>3 & micro ; m taille des pores polycarbonate 47 mm de diamètre</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td>Pour concentrer les cellules</td></tr><tr><td>1 M solution de chlorhydrate de Trizma pH 8</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T3038</td><td>Pour la préparation de TBSTRR ; pour bloquer les lames</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>S7653</td><td>Pour la préparation TBSTRR</td></tr><tr><td>20 & micro ; Filtres en nylon M&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>NY2004700</td><td>Pour la préparation d’extraits environnementaux</td></tr><tr><td>Porte-filtres de 10 à 12 mm</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td>Pour la préparation d’extraits environnementaux</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P8340</td><td>Pour le stockage des extraits environnementaux</td></tr><tr><td>1 M Solution de chlorhydrate de Trizma pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T2819</td><td>Pour bloquer les lames</td></tr><tr><td>Heidolph Duomax 1030 Agitateur à plate-forme basculante</td><td>VWR</td><td></td><td>Pour bloquer les lames ; pour les processus d’incubation&nbsp ;</td></tr><tr><td>VWR Galaxy miniarray microcentrifuge</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>Pour sécher les lames</td></tr><tr><td>Cassette d’hybridation de microarray Multi-Well</td><td>Arrayit corporation</td><td>AHC1X24</td><td>Cassette pour 24 dosages par lame</td></tr><tr><td>GenePix 4100A scanner de microarray&nbsp ;</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>Scanner pour fluorescence</td></tr><tr><td>Logiciel GenePix Pro Logiciel</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>pour l’analyse et la quantification d’images</td></tr></tbody></table>

protocole expérimental pour la détection cyanobactéries dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps microarray chip

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Le réchauffement climatique et de l&#39;eutrophisation font certains écosystèmes aquatiques se comportent comme de véritables bioréacteurs qui déclenchent la croissance des cyanobactéries rapide et massive; cela a la santé pertinente et des conséquences économiques. De nombreuses souches de cyanobactéries sont des producteurs de toxines, et seulement quelques cellules sont nécessaires pour induire des dommages irréparables à l&#39;environnement. Par conséquent, les autorités de l&#39;eau du corps et les administrations ont besoin de systèmes d&#39;alerte précoce rapides et efficaces qui fournissent des données fiables pour appuyer leurs décisions préventives ou curatives. Ce manuscrit rapporte un protocole expérimental pour la détection sur le terrain des souches de cyanobactéries produisant des toxines en utilisant une puce de microréseau d&#39;anticorps avec 17 anticorps (ABS) avec résolution taxonomique (de CYANOCHIP). Ici, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) pour la surveillance simultanée des 17 souches de cyanobactéries trouve fréquemment floraison dans les écosystèmes d&#39;eau douce, certains d&#39;entre eux les producteurs de toxines, est décrite. Un microréseau multiple répétitions identiques (jusqu&#39;à 24) du CYANOCHIP a été imprimé sur une lame de microscope unique pour tester simultanément un nombre similaire d&#39;échantillons. les échantillons liquides peuvent être testés soit par incubation directe avec l&#39;anticorps (Ab) ou après concentration des cellules par filtration à travers un filtre de 1 à 3 pm. Les échantillons solides, comme les sédiments et les roches du sol, sont d&#39;abord homogénéisés et dispersés par un appareil à ultrasons portatif dans un tampon d&#39;incubation. Ils sont ensuite filtrés (5-20 um) pour éliminer la matière grossière, et le filtrat est incubé avec Abs. Immunoréactions sont révélés par une incubation finale avec un mélange de 17 Abs marqué par fluorescence et sont lues par un détecteur de fluorescence portatif. L&#39;ensemble du processus prend environ 3 h, la plupart de celui-ci correspondant à deux périodes d&#39;incubation de 1 h. La sortie est une image, où des points lumineux correspondent à la détection positive des marqueurs de cyanobactéries.

Ce travail décrit un test de dosage immunologique multiplex pour l'identification simultanée des espèces d' eau douce de cyanobactéries les plus pertinentes (tableau 1) en utilisant le microréseau d'anticorps CYANOCHIP. La puce peut être un format 3 x 8 microarray imprimée sur des lames de microscope. Chaque microréseau est constitué d'un ensemble de 17 anticorps imprimés dans un motif de tache triple, leurs anticorps pré-immunitaires correspondants et BSA comme témoins ...

La présence de toxines cyanobactériennes dans les réservoirs d’eau douce destinée à la consommation humaine est une préoccupation majeure pour les autorités chargées de la gestion de l’eau. Afin d’évaluer le risque de contamination de l’eau, cet article décrit un protocole de détection sur le terrain des souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps.

Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la présence de plusieurs souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’un dosage immunologique par puce à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’environnement, de la surveillance et de la gestion de l’eau, telles que la présence de toxines produites par des bactéries productrices de protoxines avant que les proliférations ne deviennent visibles à l’œil nu. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs souches de cyanobactéries et plusieurs échantillons peuvent être surveillés simultanément sur une période de trois à quatre heures, à la fois in situ ou en laboratoire.Ainsi, ces méthodes peuvent donner un aperçu de la biodiversité. Il peut également être appliqué à d’autres domaines, tels que la surveillance des installations agricoles, la détection de vie dans des environnements tendus ou l’exploration planétaire. En général, les personnes novices dans cette méthode n’auront pas de difficultés.En raison de la simplicité du traitement des échantillons et de la facilité d’interprétation des résultats. Après avoir produit et purifié les anticorps conformément au protocole de texte, ajoutez 100 microlitres de DMSO dans un flacon commercial contenant un colorant pour le marquage, un milligramme de protéines. Une fois le colorant dissous, étiquetez les anticorps purifiés en ajoutant deux microlitres de colorant à 50 microlitres de chaque préparation d’anticorps.Maintenir les réactions d’étiquetage à température ambiante sous agitation continue sur une plate-forme vibrante pendant une heure. Après avoir purifié les anticorps marqués selon le protocole textuel, chargez une petite aliquote dans un spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 280 et 650 nanomètres. Calculez l’efficacité de l’étiquetage en suivant les recommandations du fournisseur.Pour fabriquer une CYANOCHIP, préparez 30 microlitres de chaque anticorps purifié en mélangeant un milligramme par millilitre d’anticorps dans un tampon d’impression protéique 1X avec 01 % de volume par volume de Tween 20. Préparez 30 microlitres des solutions d’impression suivantes comme contrôles. Tampon d’impression protéiné 1X avec 01 % de volume par volume de Tween 20.Chaque protéine A a purifié le sérum pré-immun à raison d’un milligramme par millilitre dans 1 tampon d’impression protéique avec 01 % Tween 20 et un milligramme par millilitre de BSA et 1 tampon d’impression protéique 1 % avec 01 % Tween 20. Ajoutez 30 microlitres par puits des solutions d’impression préparées aux microplaques de haute qualité à 384 puits. Après avoir configuré le robot d’impression et les substrats de lames selon le protocole de texte, repérez tous les anticorps et les commandes sur les lames en un motif de point en trois exemplaires d’environ 180 à 200 microns de diamètre de point.Pour l’échantillonnage dans l’environnement, utilisez une seringue stérile pour recueillir un à 100 millilitres de liquides et concentrez les cellules en faisant passer l’échantillon à travers un filtre de trois microns de la taille des pores. Si nécessaire, prélevez des échantillons solides dans des roches ou des sols et conservez-les dans des tubes stériles. Les échantillons peuvent être analysés dans un petit laboratoire de terrain.Ajoutez un millilitre de tampon d’incubation d’extraction pour récupérer la biomasse recueillie dans le filtre et utilisez une spatule pour racler le filtre dans un tube de 15 millilitres. À l’aide d’un processeur à ultrasons portable, ou en pipetant plusieurs fois de haut en bas, ceux-ci agrègent et homogénéisent l’échantillon. De plus, pesez jusqu’à 0,5 gramme de l’échantillon solide dans un tube séparé de 10 millilitres et ajoutez jusqu’à deux millilitres de tampon d’extraction.Immergez une sonde sonicatrice dans le tube et sonifiez à l’aide d’un processeur à ultrasons portatif ou d’un autre appareil à ultrasons. Tout en gardant l’échantillon sur de la glace, effectuez au moins cinq cycles de 30 secondes à 30 kilohertz, en s’arrêtant pendant 30 secondes entre les sonications. Pour préparer un extrait de filtrat pour l’immunoessai, utilisez une seringue de 10 millilitres couplée à un porte-filtre en nylon de cinq à 20 microns pour filtrer la solution dans un tube de 1,5 millilitre afin d’éliminer le sable, l’argile et d’autres matériaux grossiers.Avec les spots de microréseau vers le bas, posez la lame sur une goutte de 100 à 200 microlitres de solution de blocage et incubez pendant trois à cinq minutes. À l’aide d’une pince à bout de plastique et en évitant les zones de microréseau, prenez soigneusement la lame. Plongez la lame dans une solution de blocage fraîche et incubez la lame avec une légère agitation pendant 30 minutes.Pour sécher la lame, placez-la dans une centrifugeuse adaptée aux lames de microscope et faites-la tourner brièvement. Installez la lame dans une cassette d’hybridation de microréseaux de trois par huit puits en suivant les instructions du fournisseur. Alternativement, après avoir modifié le motif d’impression de l’anticorps, configurez une cassette sur mesure, comme celle illustrée ici, ou utilisez simplement des diapositives de couverture pour la configuration.Après l’assemblage de la lame et de la cassette, pipeter jusqu’à 50 microlitres de chaque extrait d’échantillon ou dilution de celui-ci dans un tampon d’incubation d’extraction dans chaque puits de la cassette. Vous pouvez également charger les échantillons dans d’autres dispositifs d’incubation ou simplement utiliser des lames de couverture. En tant que commande à blanc, pipetez 50 microlitres de tampon TBSTRR dans au moins deux puits séparés de la cassette.Incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure et mélanger par pipetage toutes les 15 minutes, ou incuber à quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Pour laver les microréseaux, placez la cassette et tapotez-la soigneusement sur du papier absorbant propre. Ensuite, lavez les puits en ajoutant 150 microlitres de tampon d’incubation d’extraction à chacun d’eux et retirez le tampon en tapotant sur du papier absorbant comme précédemment.Répétez le lavage trois fois de plus. Dans chaque puits, ajoutez 50 microlitres du mélange d’anticorps fluorescents qui contient les 17 anticorps de la souche anti-cyanobactérienne. Incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure ou à quatre degrés Celsius pendant 12 heures.Pour laver les microréseaux, placez soigneusement la cassette et tapotez-la doucement sur du papier absorbant propre. Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon d’incubation d’extraction avant de le retirer en tapotant sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.Ensuite, démontez la cassette et plongez la diapositive dans une solution PBS 0,1X pour un rinçage rapide. Centrifugez rapidement comme avant pour sécher la lame. À l’aide d’un scanner fluorescent, balayez la lame pour détecter la fluorescence au pic d’émission maximal pour le colorant fluorescent rouge lointain.Prenez plusieurs images des microréseaux avec différents paramètres de balayage en modifiant la valeur de gain. Enfin, chargez la grille, quantifiez, puis traitez et analysez les données selon le protocole texte. L’immunoessai multiplex CYANOCHIP démontré dans cette vidéo a été utilisé pour tester l’identification simultanée des espèces de cyanobactéries d’eau douce les plus pertinentes, comme indiqué dans ce tableau.Des échantillons d’eau prélevés sur la rive d’un réservoir d’eau douce ont été analysés à l’aide d’un test de microréseau. Les principales réactions immunitaires positives correspondaient à des anticorps dirigés contre les cyanobactéries planctoniques microcystis et contre les espèces benthiques leptolyngbya. Des signaux fluorescents plus faibles ont été obtenus pour les espèces planctoniques nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae et les espèces benthiques rivularia.La puce a également été validée en analysant un tapis microbien sec de l’Antarctique pour tester la présence de marqueurs cyanobactériens. Des réactions positives ont été produites dans les anticorps contre les cyanobactéries benthiques, les espèces anabaena et leptolyngbya. D’autres réactions immunitaires positives ont été détectées avec des anticorps contre les cyanobactéries planctoniques, telles que les espèces de microcystis, d’aphanizomenon et de planctothrix rubescens.Enfin, ces signaux ont été obtenus à partir d’anticorps dirigés contre d’autres espèces benthiques, notamment les espèces de tolypothrix et les espèces d’anabaena. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois, quatre heures, si elle est correctement exécutée, à l’exclusion de la production d’anticorps et du nivellement. Grâce à l’incubation simultanée de l’échantillon et d’anticorps fluorescents, il est possible de gagner une heure.Lors de la tentative de ces procédures, il est important de se rappeler de préparer le mélange d’anticorps fluorescents avec son anticorps à sa dilution de travail optimale. Suite à ces procédures, d’autres méthodes, comme la microscopie optique ou l’extraction d’ADN et une amplification PCR spécifique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la concentration dans le sol ou pour confirmer le type de souche détectée. Après sa mise au point, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la surveillance environnementale pour explorer les plans d’eau, dans les processus de biculture, la gestion de l’eau douce ou les études d’écologie microbienne, quel que soit le type d’échantillon.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les anticorps par fluorescence, de manipuler les microréseaux d’anticorps, d’effectuer des essais immunologiques multiplexes et d’analyser et d’interpréter les résultats des essais immunologiques sur puces. N’oubliez pas que le travail avec des ultrasons peut être dangereux et que des précautions telles que le port de dispositifs de protection auditive ou d’autres mesures de soins spécifiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.

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Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip (Vidéo) | JoVE Journal

Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

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