Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la présence de plusieurs souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’un dosage immunologique par puce à fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’environnement, de la surveillance et de la gestion de l’eau, telles que la présence de toxines produites par des bactéries productrices de protoxines avant que les proliférations ne deviennent visibles à l’œil nu. Le principal avantage de cette technique est que plusieurs souches de cyanobactéries et plusieurs échantillons peuvent être surveillés simultanément sur une période de trois à quatre heures, à la fois in situ ou en laboratoire.

Ainsi, ces méthodes peuvent donner un aperçu de la biodiversité. Il peut également être appliqué à d’autres domaines, tels que la surveillance des installations agricoles, la détection de vie dans des environnements tendus ou l’exploration planétaire. En général, les personnes novices dans cette méthode n’auront pas de difficultés.

En raison de la simplicité du traitement des échantillons et de la facilité d’interprétation des résultats. Après avoir produit et purifié les anticorps conformément au protocole de texte, ajoutez 100 microlitres de DMSO dans un flacon commercial contenant un colorant pour le marquage, un milligramme de protéines. Une fois le colorant dissous, étiquetez les anticorps purifiés en ajoutant deux microlitres de colorant à 50 microlitres de chaque préparation d’anticorps.

Maintenir les réactions d’étiquetage à température ambiante sous agitation continue sur une plate-forme vibrante pendant une heure. Après avoir purifié les anticorps marqués selon le protocole textuel, chargez une petite aliquote dans un spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 280 et 650 nanomètres. Calculez l’efficacité de l’étiquetage en suivant les recommandations du fournisseur.

Pour fabriquer une CYANOCHIP, préparez 30 microlitres de chaque anticorps purifié en mélangeant un milligramme par millilitre d’anticorps dans un tampon d’impression protéique 1X avec 01 % de volume par volume de Tween 20. Préparez 30 microlitres des solutions d’impression suivantes comme contrôles. Tampon d’impression protéiné 1X avec 01 % de volume par volume de Tween 20.

Chaque protéine A a purifié le sérum pré-immun à raison d’un milligramme par millilitre dans 1 tampon d’impression protéique avec 01 % Tween 20 et un milligramme par millilitre de BSA et 1 tampon d’impression protéique 1 % avec 01 % Tween 20. Ajoutez 30 microlitres par puits des solutions d’impression préparées aux microplaques de haute qualité à 384 puits. Après avoir configuré le robot d’impression et les substrats de lames selon le protocole de texte, repérez tous les anticorps et les commandes sur les lames en un motif de point en trois exemplaires d’environ 180 à 200 microns de diamètre de point.

Pour l’échantillonnage dans l’environnement, utilisez une seringue stérile pour recueillir un à 100 millilitres de liquides et concentrez les cellules en faisant passer l’échantillon à travers un filtre de trois microns de la taille des pores. Si nécessaire, prélevez des échantillons solides dans des roches ou des sols et conservez-les dans des tubes stériles. Les échantillons peuvent être analysés dans un petit laboratoire de terrain.

Ajoutez un millilitre de tampon d’incubation d’extraction pour récupérer la biomasse recueillie dans le filtre et utilisez une spatule pour racler le filtre dans un tube de 15 millilitres. À l’aide d’un processeur à ultrasons portable, ou en pipetant plusieurs fois de haut en bas, ceux-ci agrègent et homogénéisent l’échantillon. De plus, pesez jusqu’à 0,5 gramme de l’échantillon solide dans un tube séparé de 10 millilitres et ajoutez jusqu’à deux millilitres de tampon d’extraction.

Immergez une sonde sonicatrice dans le tube et sonifiez à l’aide d’un processeur à ultrasons portatif ou d’un autre appareil à ultrasons. Tout en gardant l’échantillon sur de la glace, effectuez au moins cinq cycles de 30 secondes à 30 kilohertz, en s’arrêtant pendant 30 secondes entre les sonications. Pour préparer un extrait de filtrat pour l’immunoessai, utilisez une seringue de 10 millilitres couplée à un porte-filtre en nylon de cinq à 20 microns pour filtrer la solution dans un tube de 1,5 millilitre afin d’éliminer le sable, l’argile et d’autres matériaux grossiers.

Avec les spots de microréseau vers le bas, posez la lame sur une goutte de 100 à 200 microlitres de solution de blocage et incubez pendant trois à cinq minutes. À l’aide d’une pince à bout de plastique et en évitant les zones de microréseau, prenez soigneusement la lame. Plongez la lame dans une solution de blocage fraîche et incubez la lame avec une légère agitation pendant 30 minutes.

Pour sécher la lame, placez-la dans une centrifugeuse adaptée aux lames de microscope et faites-la tourner brièvement. Installez la lame dans une cassette d’hybridation de microréseaux de trois par huit puits en suivant les instructions du fournisseur. Alternativement, après avoir modifié le motif d’impression de l’anticorps, configurez une cassette sur mesure, comme celle illustrée ici, ou utilisez simplement des diapositives de couverture pour la configuration.

Après l’assemblage de la lame et de la cassette, pipeter jusqu’à 50 microlitres de chaque extrait d’échantillon ou dilution de celui-ci dans un tampon d’incubation d’extraction dans chaque puits de la cassette. Vous pouvez également charger les échantillons dans d’autres dispositifs d’incubation ou simplement utiliser des lames de couverture. En tant que commande à blanc, pipetez 50 microlitres de tampon TBSTRR dans au moins deux puits séparés de la cassette.

Incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure et mélanger par pipetage toutes les 15 minutes, ou incuber à quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Pour laver les microréseaux, placez la cassette et tapotez-la soigneusement sur du papier absorbant propre. Ensuite, lavez les puits en ajoutant 150 microlitres de tampon d’incubation d’extraction à chacun d’eux et retirez le tampon en tapotant sur du papier absorbant comme précédemment.

Répétez le lavage trois fois de plus. Dans chaque puits, ajoutez 50 microlitres du mélange d’anticorps fluorescents qui contient les 17 anticorps de la souche anti-cyanobactérienne. Incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure ou à quatre degrés Celsius pendant 12 heures.

Pour laver les microréseaux, placez soigneusement la cassette et tapotez-la doucement sur du papier absorbant propre. Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon d’incubation d’extraction avant de le retirer en tapotant sur une serviette en papier. Répétez le lavage trois fois.

Ensuite, démontez la cassette et plongez la diapositive dans une solution PBS 0,1X pour un rinçage rapide. Centrifugez rapidement comme avant pour sécher la lame. À l’aide d’un scanner fluorescent, balayez la lame pour détecter la fluorescence au pic d’émission maximal pour le colorant fluorescent rouge lointain.

Prenez plusieurs images des microréseaux avec différents paramètres de balayage en modifiant la valeur de gain. Enfin, chargez la grille, quantifiez, puis traitez et analysez les données selon le protocole texte. L’immunoessai multiplex CYANOCHIP démontré dans cette vidéo a été utilisé pour tester l’identification simultanée des espèces de cyanobactéries d’eau douce les plus pertinentes, comme indiqué dans ce tableau.

Des échantillons d’eau prélevés sur la rive d’un réservoir d’eau douce ont été analysés à l’aide d’un test de microréseau. Les principales réactions immunitaires positives correspondaient à des anticorps dirigés contre les cyanobactéries planctoniques microcystis et contre les espèces benthiques leptolyngbya. Des signaux fluorescents plus faibles ont été obtenus pour les espèces planctoniques nostocales aphanizomenon, anabaena, microcystis flos-aquae et les espèces benthiques rivularia.

La puce a également été validée en analysant un tapis microbien sec de l’Antarctique pour tester la présence de marqueurs cyanobactériens. Des réactions positives ont été produites dans les anticorps contre les cyanobactéries benthiques, les espèces anabaena et leptolyngbya. D’autres réactions immunitaires positives ont été détectées avec des anticorps contre les cyanobactéries planctoniques, telles que les espèces de microcystis, d’aphanizomenon et de planctothrix rubescens.

Enfin, ces signaux ont été obtenus à partir d’anticorps dirigés contre d’autres espèces benthiques, notamment les espèces de tolypothrix et les espèces d’anabaena. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois, quatre heures, si elle est correctement exécutée, à l’exclusion de la production d’anticorps et du nivellement. Grâce à l’incubation simultanée de l’échantillon et d’anticorps fluorescents, il est possible de gagner une heure.

Lors de la tentative de ces procédures, il est important de se rappeler de préparer le mélange d’anticorps fluorescents avec son anticorps à sa dilution de travail optimale. Suite à ces procédures, d’autres méthodes, comme la microscopie optique ou l’extraction d’ADN et une amplification PCR spécifique, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la concentration dans le sol ou pour confirmer le type de souche détectée. Après sa mise au point, cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la surveillance environnementale pour explorer les plans d’eau, dans les processus de biculture, la gestion de l’eau douce ou les études d’écologie microbienne, quel que soit le type d’échantillon.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les anticorps par fluorescence, de manipuler les microréseaux d’anticorps, d’effectuer des essais immunologiques multiplexes et d’analyser et d’interpréter les résultats des essais immunologiques sur puces. N’oubliez pas que le travail avec des ultrasons peut être dangereux et que des précautions telles que le port de dispositifs de protection auditive ou d’autres mesures de soins spécifiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.