Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture

Ce protocole a été initialement publié par le Dr Gary Bunker et ses collègues, et permet la culture à long terme et à haute pureté de neurones hippocampiques embryonnaires en maintenant les neurones en suspension au-dessus d'une couche de cellules gliales. Ce résultat est fondamental pour l'ensemble de nos autres résultats cruciaux concernant l'hippocampe, car il permet aux neurones de croître à faible densité avec peu de cellules gliales contaminantes. Ce modèle est donc idéal pour l'imagerie de haute résolution et l'analyse fonctionnelle de la typographie ainsi que des neurones matures en culture.

La post-maturation de ce protocole devrait accélérer l'adaptation par de nouveaux chercheurs, car plusieurs états clés au cours de la procédure sont difficiles à décrire, ce qui facilite la compréhension pas à pas. Ce protocole comprend trois populations indépendantes nécessaires à la culture de neurones primaires de haute qualité. Ces étapes incluent la culture de cellules gliales, la fabrication et l'enduction de lamelles, ainsi que la préparation de cellules nerveuses hippocampiques.

Pour commencer, le tissu cortical de rat en période postnatale précoce doit être obtenu comme décrit dans le protocole écrit. Bien que cela ne soit pas directement montré ici, notez que l'étape de dissection présentée ultérieurement dans ce protocole est presque identique à celle utilisée pour la dissection corticale. Pour cette raison, les étapes pertinentes seront mises en évidence pendant la procédure de dissection hippocampique présentée plus tard dans cette vidéo.

À partir de l'étape six du protocole écrit, retirez le HBSS du tissu cortical collecté, puis hachez finement le tissu à l’aide de ciseaux. Ajoutez suffisamment de HBSS au tissu haché pour transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres, puis complétez le volume total à 12 millilitres en ajoutant du HBSS. Ajoutez 1,5 millilitre de chacun des réactifs suivants : trypsine à 2,5 % et solution d'ADN à 10 milligrammes par millilitre, retournez le tube pour homogénéiser, puis incubez le mélange obtenu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 12 minutes.

Triturez le tissu de 10 à 15 fois à l’aide d’une pipette Pasteur en verre, puis incubez-le dans le bain-marie pendant trois minutes supplémentaires. Assurez-vous que tous les morceaux de tissu se sont déposés au fond du tube, puis filtrez le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres contenant 5 millilitres de BGS. Ajoutez 13,5 millilitres de HBSS et 1,5 millilitre de 2.5&trypsin dans le tube contenant les morceaux restants de tissu non digéré, retournez-le pour mélanger, puis incubez-le dans le bain-marie pendant 10 minutes supplémentaires.

Après l'incubation, triturer le tissu restant de 10 à 15 fois, puis le filtrer dans le tube contenant le filtrat initial. Ensuite, rincer le filtre en faisant passer à travers 3 millilitres supplémentaires de BGS. À ce stade, le filtrat peut être divisé en plusieurs tubes afin de simplifier à la fois l'équilibrage et la resuspension du culot cellulaire.

Centrifuger les suspensions pendant six minutes à 130 ×g. Après la centrifugation, noter que le fond du culot présente une légère teinte rougeâtre, en raison de la présence de composants sanguins. Éliminer les surnageants, puis ajouter 1 millilitre de milieu glial dans chaque tube, en prenant soin de ne pas perturber le culot. Transférer les parties de chaque culot qui ne présentent pas cette apparence rougeâtre dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Ajoutez jusqu'à 2 millilitres de milieu glial par sourisonne pour resuspendre le tissu combiné, puis transférez chaque volume de 2 millilitres de suspension dans 18 millilitres de milieu glial préchauffé dans un flacon de culture de 75 centimètres carrés. Incubez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Le jour suivant le semis des cellules, remplacez le milieu dans chaque flacon par du milieu glial frais.

À ce stade, la culture sera un mélange d'astrocytes et d'autres types cellulaires non ciblés. Pour éliminer les types cellulaires non astrocytaires, les flacons doivent être agités énergiquement environ quatre jours après leur ensemencement. Pour ce faire, rincez les flacons avec du HBSS, puis ajoutez 10 millilitres de HBSS frais dans chaque flacon et agitez vigoureusement chacun cinq à dix fois.

Aspirez le HBSS et rincez deux fois supplémentaires avec du HBSS. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de milieu glial, puis remettez les flacons dans l’incubateur comme précédemment. Notez que, bien que cette étape soit vigoureuse, les astrocytes destinés à la culture resteront fortement adhérents à la surface du flacon.

Pour maintenir les cultures d'astrocytes, changez le milieu pour du milieu glial frais deux fois par semaine jusqu'à ce qu'elles soient confluentes. Une fois confluentes, les cellules peuvent être congelées pour une utilisation ultérieure, comme décrit dans le protocole écrit. Les cellules gliales doivent être ensemencées dans des boîtes au moins 14 jours avant le début de la culture de neurones, comme indiqué dans le protocole écrit.

Immergez les lamelles dans de l'acide nitrique concentré et soumettez-les à une sonication pendant 30 minutes à température ambiante. Soyez prudent, car l'acide nitrique concentré est extrêmement corrosif. Notez également que certains laboratoires préfèrent faire tremper les lamelles dans l'acide nitrique toute la nuit en utilisant des porte-lamelles en céramique.

Jetez soigneusement l'acide nitrique dans la hotte chimique conformément aux directives institutionnelles, puis rincez les lamelles trois fois avec de l'eau déionisée. Immergez les lamelles dans l'eau et soumettez-les à une nouvelle sonication pendant 30 minutes. Ensuite, retirez l'eau et rincez à nouveau les lamelles trois fois.

Immergez les lamelles dans 50 millilitres d'eau, puis stérilisez-les en autoclave. Dans une hotte à flux laminaire stérile, retirez l'eau et ajoutez 20 à 30 millilitres d'éthanol pour rincer. Ajoutez une autre quantité de 20 à 30 millilitres d'éthanol, puis transférez les lamelles et l'éthanol dans une boîte de Pétri de 100 millimètres.

À l’aide de pinces émoussées, transférer les lamelles colorées dans des boîtes de Pétri de 60 millilitres, quatre à cinq par boîte, puis les laisser sécher à l’air en appuyant les lamelles contre le bord de la boîte. Une fois l’éthanol évaporé, remettre les lamelles en position horizontale. Faire fondre 10 grammes de paraffine dans un flacon en verre résistant à la chaleur, et maintenir à environ 150 à 200 degrés Celsius.

La température idéale peut nécessiter quelques ajustements, et des températures inappropriées peuvent rendre difficile la production de pieds en paraffine de la bonne taille. Plongez une pipette Pasteur dans le paraffine, puis touchez rapidement trois points situés près du bord de chaque lame. Les gouttes de paraffine se solidifieront en formant des billes d’environ 3 à 5 millimètres de hauteur et de 1 à 2 millimètres de diamètre, qui serviront à créer un espace entre les neurones sur la lame et la couche monocouche de cellules gliales située en dessous.

Obtenez des boîtes contenant des lamelles préparées au préalable avec des pieds en paraffine. Ajoutez 200 microlitres de poly-l-lysine et de tampon borate à la surface de chaque lamelle, et laissez la solution agir sur les lamelles toute la nuit, à température ambiante et à l’abri de la lumière. La surface à revêtir doit être celle sur laquelle se trouvent les billes de paraffine.

Si elle est correctement nettoyée, la poly-l-lysine doit s'étaler facilement pour recouvrir la surface du lamelle. Le lendemain matin, laver les lamelles deux fois en les faisant tremper dans de l'eau stérile pendant deux heures à chaque fois. Après le dernier lavage, remplacer l'eau par 4 millilitres de milieu de culture par boîte.

Remarquez qu'il est important que la surface des lamelles ne sèche pas après avoir été recouverte de poly-l-lysine. Placez les boîtes contenant les lamelles dans un incubateur à 37 degrés Celsius. La lamelle recouverte doit être incubée pendant au moins 24 heures avant le début de la culture de neurones.

Obtenir un rat gestant au dix-huitième ou dix-neuvième jour de développement embryonnaire, puis euthanasier par une méthode approuvée. Pulvériser la face inférieure du rat avec de l'éthanol à 70 %, puis pratiquer une incision médiane depuis la région pubienne jusqu'à l'extrémité de la cavité abdominale. Afin d'éviter toute contamination, veiller à ne couper que la peau à cette étape.

Stérilisez les instruments de dissection à l’aide d’éthanol à 70 %, puis incisez la paroi abdominale afin d’exposer l’utérus. Retirez les deux cornes utérines et placez-les dans une boîte stérile. Dans une hotte à flux laminaire stérile, retirez les membranes utérines entourant les fœtus, puis décapitez-les et placez les têtes dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 20 millilitres de HBSS.

Extraire les cerveaux et les placer immédiatement dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant 2 millilitres de HBSS sur de la glace. Collecter uniquement deux à trois cerveaux par boîte afin de laisser suffisamment d'espace pour l'étape suivante. Sous un microscope stéréoscopique, retirer les méninges à partir de la ligne médiane des hémisphères cérébraux.

Ensuite, disséquez les hippocampes. Notez que l'hippocampe peut être distingué comme une structure en forme de croissant sur la surface médiale de l'hémisphère cortical, et qu'il est facile à extraire car il est délimité latéralement par un ventricule. Une fois libérés, placez les hippocampes dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant 4,5 millilitres de HBSS et maintenez-les sur de la glace.

Remarquez que les étapes effectuées jusqu'à ce point s'appliquent également à la dissection corticale, sauf que les cortèxes sont conservés au lieu des hippocampes. Pour la dissection corticale, l'étape suivante consiste à séparer le cortex du reste du cerveau, comme illustré ici, puis à recueillir les cortèxes et le HBSS comme indiqué précédemment. Une fois que tous les tissus hippocampiques ont été recueillis dans le HBSS, transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajouter 5 millilitres de trypsine à 2,5 %, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer délicatement la solution de trypsine à l’aide d’une pipette de Pasteur, en laissant le tissu hippocampique intact au fond du tube. Laver le tissu deux fois en ajoutant doucement 5 millilitres de HBSS, en incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis en retirant à nouveau à l’aide d’une pipette de Pasteur, en veillant à ne pas perturber le tissu au fond.

Pendant l'attente de l'étape d'incubation précédemment indiquée, préparez deux variantes de pipettes polies à la flamme pour la dissociation du tissu. Pour ce faire, exposez brièvement l'extrémité de la pipette Pasteur en verre à une flamme, puis examinez l'extrémité de la pipette. Pour la première variante, répétez cette étape jusqu'à ce que les bords de l'extrémité de la pipette soient lissés, mais que le diamètre reste inchangé.

Pour la deuxième, répéter jusqu'à ce que les bords soient lissés et que le diamètre de la pointe soit réduit d'environ la moitié. Il est important de s'entraîner afin de trouver le diamètre idéal pour que le tissu soit dissocié afin d'obtenir des cellules individuelles sans endommager ces cellules au cours du processus. Après le deuxième lavage, ajuster le volume total à 5 millilitres en ajoutant un volume suffisant de HBSS au tissu.

Homogénéisez le tissu hippocampique d'abord par environ 10 passages à l'aide d'une pipette normale à bord lisse, puis par cinq à 10 passages supplémentaires à l'aide d'une pipette à diamètre de pointe réduit. L'objectif ici est d'obtenir une solution homogène de cellules sans agrégats tissulaires, ou en très faible nombre. Déterminez la densité cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.

Les rendements typiques sont d'environ 800 000 à un million de cellules par souris. Transférez un volume suffisant de la suspension cellulaire dans des boîtes contenant des lamelles revêtues de poly-l-lysine dans 4 millilitres de milieu de mise en culture, afin d'obtenir une densité de mise en culture comprise entre 100 000 et 500 000 cellules par boîte de 60 millimètres, selon l'expérience prévue. Placez les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après trois à quatre heures, transférez les lamelles avec les neurones attachés vers des boîtes contenant des cellules gliales et du milieu NBG. Cette opération doit être effectuée de manière à ce que la face sur laquelle les neurones ont été ensemencés soit orientée vers le bas, en direction de la couche de cellules gliales. Ajoutez un total de quatre ou cinq lamelles par boîte de cellules gliales.

Deux ou trois jours après le semis, ajoutez la solution d’aérocele à une concentration finale de cinq micromoles par plat afin d’arrêter la croissance des cellules gliales. Alimentez les cellules une fois par semaine en remplaçant 2 millilitres de l’ancien milieu par 2,5 millilitres de milieu frais à chaque alimentation. Le milieu supplémentaire ajouté compense l’évaporation survenue au fil du temps.

Et seule une partie du milieu est renouvelée afin d'assurer un conditionnement constant du milieu par les cellules gliales. Ces cultures sont généralement saines pendant au moins un mois. Les neurones ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis incubés avec des anticorps primaires pour l'imagerie de fluorescence.

Comme le montrent les colorations immuno-histochimiques pour la protéine Tau et la MAP2, ces neurones développent une arborisation étendue avec des axones et des dendrites bien différenciés. Les neurones matures développent également des épines synaptiques, identifiées par la localisation sélective de la Drebrine 1, qui sont étroitement associées à des spécialisations pré-synaptiques, telles qu'identifiées par la coloration immuno-histochimique de la synapsine 1. Ces neurones primaires sont particulièrement adaptés aux études fonctionnelles et structurales des neurones et des synapses, notamment aux études de la transduction du signal, de la polarité neuronale, du trafic subcellulaire, ainsi que du développement et de la plasticité synaptique, entre autres.

Ce vidéo devrait aider à comprendre et à exécuter correctement plusieurs étapes clés de ce protocole. Le respect rigoureux de la méthode décrite doit permettre d'obtenir une culture de neurones sains, denses et présentant une arborisation étendue, ainsi que des synapses bien développées sur les plans morphologique et fonctionnel.