Name: Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
Description: Apprenez à cultiver des neurones hippocampiques primaires à faible densité sur des lamelles en verre au-dessus d'une couche gliale. Cette méthode permet l'imagerie optique à haute résolution et les tests fonctionnels de neurones matures.

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<ol><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%3A+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li>
<li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li>
<li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li>
<li>Varoqueaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+determine+synapse+maturation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuroligins determine synapse maturation and function.</a> Neuron. 51, 741-754 (2006).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li>
<li>Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+6-cyano-7-nitroquinoxaline-2%2C3-dione+with+the+N-methyl-D-aspartate+receptor-associated+glycine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site.</a> Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoslin%2C+K+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. 2, 339-370 (1998).</li>
<li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Bien que la méthode « sandwich » de la culture des neurones a été bien décrit par ailleurs 2, 11, il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont assez difficiles à décrire seul dans le texte, ce qui peut conduire à la frustration pour les chercheurs qui souhaitent adopter. La méthode peut être divisée en trois grands flux de travail: culture gliales, préparation de la culture et de couvre-neurone et de maintenance. Chacune des tr...

Le cerveau est organisé en réseaux complexes de neurones. La contribution des neurones individuels à l&#39;activité du réseau et la fonction cérébrale peut être étudiée par une altération sélective de leur composition moléculaire et perturbance de leurs propriétés physiologiques. La manipulation génétique et chimique des neurones individuels est sans doute plus facile dans les neurones en culture que dans le tissu cérébral intact, non grevé par l&#39;hétérogénéité et la complexité cellulaire de ce dernier. Neurones dans la culture se développent axonale bien définis et arborisation dendritique et forment de vastes connexions synaptiques entre eux. Alors que la culture des neurones des animaux adultes ou d&#39;autres régions du système nerveux est possible, les cultures hippocampiques embryonnaires sont souvent préférées en raison de leur population cellulaire pyramidale définie et relativement faible densité gliale 1, 2. neurones hippocampiques cultivés à faible densité dans la culture sont particulièrement ammenable à l&#39;étude de la localisation subcellulaire, le trafic des protéines, la polarité neuronale et le développement des synapses. Les neurones de culture ont également été largement utilisé dans l&#39; étude des processus moléculaires dans la plasticité synaptique 3, 4, 5, 6. Préparations de culture Neuron de souris avec des délétions génétiques globales qui ne survivent pas postnatal ont été particulièrement utiles dans l&#39; étude des rôles cellulaires et synaptiques de certains gènes 7. Comme dans le cerveau, les neurones hippocampiques en culture dépendent du soutien des cellules gliales trophique. Cela complique leur culture, et a conduit au développement de plusieurs méthodes différentes par lesquelles ce soutien est fourni. Une méthode couramment utilisée consiste à plaquer directement les neurones sur une monocouche de cellules gliales 8, ou qui permettent à des cellules gliales contaminant du hipp acquisocampal tissu à proliférer et à former une monocouche sous les neurones 9. Bien que cette méthode a trouvé un certain succès, l&#39;impureté de la culture neuronale résultante est désavantageux pour des expériences d&#39;imagerie. Une autre méthode couramment utilisée pour la culture de neurones est de laisser-out de la couche d&#39; alimentation de cellules gliales au total, et au lieu de fournir un support trophique sous la forme d&#39;un milieu de croissance défini 10. Nous décrivons ici la méthode « sandwich » ou « Banker » de la culture des neurones 2, 11. Cette méthode consiste à plaquer les neurones de l&#39;hippocampe sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales séparées par des perles de cire de paraffine. Cela facilite la culture à long terme d&#39;une population homogène de neurones sans contaminer glie tout en permettant le soutien de la monocouche trophique gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont de niveau suffisant âge ou de maturité,les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l&#39;imagerie ou des analyses fonctionnelles.

<table><tbody><tr><td>Dissection Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Ciseaux de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ciseaux à ressort de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro Ciseaux à ressort de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td> <td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pince (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Préparation des tissus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (2,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Porte-filtre Swinnex, 25&nbsp ; mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Utilisé comme passoire à cellules. Assembler d’abord avec un filtre et un autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 Nettoyage des lentilles Tissu</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Utilisé comme passoire cellulaire. Assembler d’abord dans un porte-filtre et un autoclave Pipettes</td></tr><tr><td>Pasteur en verre avec filtre en coton</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution sans calcium, magnésium, rouge de phénol (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I du pancréas bovin (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butane Bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Modèle 65</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tissue Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 mm)</td><td>Boîte</td> de Pétri Fisher <td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Sérum de</td> cheval Fisher <td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Peut être utilisé à la place du BGS, mais chaque lot doit être testé en raison de la variation entre les lots. L’inactivation thermique du sérum est recommandée.</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimum (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Peut être utilisé à la place de la L-Glutamine dans le milieu NBG</td></tr><tr><td>Boîte de culture (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de croissance bovine (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>L’inactivation par la chaleur est recommandée avant utilisation.</td></tr><tr><td>Supplément B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoïque (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>><Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Coverslip Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffine Wax</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Four à convection par gravité</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Utilisé pour la méthode alternative de nettoyage des lamelles discutée dans le protocole</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons (sonisateur)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Anachemie</td> à<td>l’acide nitrique</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Supports de coloration en céramique</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Utilisé pour la méthode alternative de nettoyage des lamelles discutée dans le protocole</td></tr><tr><td>Couvre-lames</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&nbsp ; Le fabricant de la GmbH</td><td>1001/18</td><td>est très important, car les neurones n’adhèrent pas bien au verre de qualité inférieure.</td></tr><tr><td>Acide Borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Divers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringues stériles</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Utilisé avec la seringue BD pour seringue de stérilisation par filtre</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Utilisé avec les filtres à seringue stériles VWR pour la stérilisation</td></tr> au <tr><td>litre Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger stériles coniques</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger stériles coniques</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

faible densité primaire hippocampique neuron culture

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

La capacité à sonder la structure et de la physiologie des cellules nerveuses individuelles dans la culture est essentielle pour l&#39;étude de la neurobiologie, et permet une certaine souplesse dans la manipulation génétique et chimique des cellules individuelles ou des réseaux définis. Une telle facilité de manipulation est plus simple dans le système de culture réduite par rapport au tissu cérébral intact. Bien que de nombreuses méthodes pour l&#39;isolement et la croissance de ces neurones primaires existent, chacun a ses propres limites. Ce protocole décrit un procédé de culture de faible densité et de haute pureté rongeurs embryonnaires neurones hippocampiques sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales. Cette « culture sandwich » permet une croissance exclusive à long terme d&#39;une population de neurones tout en permettant un soutien trophique de la monocouche gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont suffisamment âgé ou au niveau de la maturité, les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l&#39;imagerie ou des analyses fonctionnelles. g neuronesrown par cette méthode survivent généralement pendant plusieurs semaines et développer de vastes tonnelles, les connexions synaptiques et les propriétés du réseau.

Dans cette méthode « sandwich » de la culture des cellules nerveuses primaires, les neurones hippocampiques (figure 3) se développent sur un lit de cellules gliales (figure 1) séparées par des billes de paraffine (Figure 2). Cela garantit que la croissance des neurones de manière sélective sur des lamelles de verre à la contamination des cellules gliales minimale mais reçoivent un soutien adéquat de la glie trophique de plus en plus sur ...

Cet article décrit le protocole pour la culture de neurones hippocampiques primaires de basse densité en croissance sur des lamelles de verre inversées sur une monocouche de cellules gliales. Les couches de neurones et de cellules gliales sont séparés par des billes de cire de paraffine. Les neurones cultivés par ce procédé sont appropriés pour l&#39;imagerie optique à haute résolution et des essais fonctionnels.

Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Ce protocole a été initialement publié par le Dr Gary Bunker et ses collègues, et permet la culture à long terme et à haute pureté de neurones hippocampiques embryonnaires en maintenant les neurones en suspension au-dessus d'une couche de cellules gliales. Ce résultat est fondamental pour l'ensemble de nos autres résultats cruciaux concernant l'hippocampe, car il permet aux neurones de croître à faible densité avec peu de cellules gliales contaminantes. Ce modèle est donc idéal pour l'imagerie de haute résolution et l'analyse fonctionnelle de la typographie ainsi que des neurones matures en culture.La post-maturation de ce protocole devrait accélérer l'adaptation par de nouveaux chercheurs, car plusieurs états clés au cours de la procédure sont difficiles à décrire, ce qui facilite la compréhension pas à pas. Ce protocole comprend trois populations indépendantes nécessaires à la culture de neurones primaires de haute qualité. Ces étapes incluent la culture de cellules gliales, la fabrication et l'enduction de lamelles, ainsi que la préparation de cellules nerveuses hippocampiques.Pour commencer, le tissu cortical de rat en période postnatale précoce doit être obtenu comme décrit da

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Ce protocole décrit les étapes nécessaires à disséquer, transfecter par électroporation et de neurones de souris de la culture de l'hippocampe et du cortex. Cultures à court terme peut être utilisé pour des études d'excroissance axonale et d'orientation, tout en cultures à long terme peut être utilisé pour des études de la synaptogenèse et l'analyse des épines dendritiques.

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