Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l'identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

L’objectif global de cette méthodologie est d’identifier la phosphorylation multiple d’une protéine intrinsèquement désordonnée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire en utilisant la protéine tau comme étude de cas. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la régulation moléculaire liée à la maladie, telles que l’impact de la phosphorylation sur l’interaction de la protéine avec son partenaire moléculaire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons identifier la phosphorylation spécifique d’un site dans une protéine désordonnée et la relier à des changements structurels et fonctionnels.

Cette méthode peut fournir des informations sur la fonction. Il peut également être appliqué à d’autres protéines telles que les restes désordonnés de la protéine d’ADN du virus aPtc Les applications de cette technique s’étendent à la thérapie par le développement de protéines, inhibiteurs d’interaction protéique. Cette méthode sera démontrée par Clément Danis, Clément Després, Luiza Bessa et Hamida Merzougui, les doctorants de notre groupe.

Pour commencer, mélangez doucement 50 microlitres de cellules BL21 compétentes avec 100 nanogrammes d’ADN plasmidique formant 10 à 15 millions de colonies par microgramme d’ADN plasmatique dans un tube en plastique de 1,5 millilitre. Après avoir placé le mélange cellulaire sur de la glace pendant 30 minutes, choquez-le thermiquement pendant 10 secondes à 42 degrés Celsius. Remettez ensuite le tube sur de la glace pendant cinq minutes avant d’ajouter un millilitre de Luria Bertani ou de milieu LB à température ambiante.

Incuber la suspension bactérienne à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sous une légère agitation. À l’aide d’un épandeur, étalez uniformément 100 microlitres de suspension cellulaire sur une plaque de gélose de milieu LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’antibiotique ampicilline. Incuber la plaque de sélection pendant 15 heures à 37 degrés Celsius.

Ensuite, solubilisez 300 milligrammes de milieu enrichi en azote 15 et en carbone 13, un gramme de chlorure d’ammonium à l’azote 15 et deux grammes de glucose marqué au carbone 13 dans 10 millilitres de milieu M9. Filtre : stérilisez la solution isotopique directement dans le milieu M9 à l’aide d’un filtre de 0,2 micron. À l’aide d’une pipette pasteure, suspendre une colonie de bactéries transformées par plasma recombinant à partir de la plaque de sélection dans 20 millilitres de milieu LB, complétés par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.

Incuber le milieu inoculé à 37 degrés Celsius pendant environ six heures. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres ou OD600 à l’aide d’un millilitre d’une dilution de dix fois de la culture bactérienne dans une cuvette de spectromètre en plastique. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de la culture LB saturée à un litre de milieu de croissance M9 complété par de l’ampicilline dans une fiole de culture à chicanes en verre Erlenmeyer de deux litres.

Placez le ballon de culture dans un incubateur programmable réglé à 10 degrés Celsius et 50 tr/min. Programmez l’incubateur pour qu’il passe à 200 tr/min et 37 degrés Celsius tôt le matin du lendemain. Mesurez l’OD600 sur un millilitre de culture bactérienne dans une cuvette de spectromètre en plastique.

Ajouter 400 microlitres d’une solution mère molaire d’IPTG lorsque l’OD600 atteint une valeur d’environ 1,0 pour induire l’expression de la protéine tau recombinante. Après avoir incubé les cellules bactériennes à 37 degrés Celsius pendant trois heures supplémentaires, collectez-les par centrifugation à 5 000 fois g pendant 20 minutes. Décongelez la pastille de cellules bactériennes et remettez-la soigneusement en suspension dans 45 millilitres de tampon d’échange cationique A, fraîchement complété par 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase DNasel 1.

Perturber les cellules bactériennes à l’aide d’un homogénéisateur à haute pression à 20 000 PSI, trois à quatre passages sont nécessaires pour perturber adéquatement les cellules. Centrifugez les cellules perturbées à 20 000 fois g pendant 40 minutes pour éliminer le matériau insoluble. Chauffez l’extrait de cellules bactériennes pendant 15 minutes à 75 degrés Celsius à l’aide d’un bain-marie.

Un précipité blanc sera observé au bout de quelques minutes. Ensuite, centrifugez l’extrait chauffé à 15 000 fois g pendant 20 minutes et conservez le surnageant contenant la protéine tau stable à la chaleur. Ensuite, effectuez une chromatographie échangeuse de cations sur une résine CEX forte emballée dans une colonne de lit de 5 millilitres à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides.

Réglez le débit à 2,5 millilitres par minute et équilibrez la colonne dans le tampon CEX A. Ensuite, chargez l’extrait de tau chauffé de 60 à 70 millilitres à l’aide d’une pompe d’échantillonnage, collectez le flux pour l’analyse afin de vérifier que la protéine tau se lie efficacement à la résine. Lavez la résine avec un tampon CEX A jusqu’à ce que l’absorbance à 280 nanomètres soit revenue à la valeur de référence.

Programmez le FPLC avec un gradient allant jusqu’à 25 % de tampon CEX B dans 10 volumes de colonne pour atteindre 250 millimolaires de chlorure de sodium. Poursuivez avec un tampon à 50 % CEX B dans cinq volumes de colonne pour atteindre 500 millimolaires de chlorure de sodium. Enfin, augmentez le gradient à 100 % de tampon CEX B dans deux volumes de colonne pour atteindre une molaire de chlorure de sodium.

Collectez des fractions de 1,5 millilitre pendant les étapes d’élution. Ensuite, effectuez un échange de tampon sur la protéine tau contenant les fractions regroupées. Equilibérez une colonne de dessalage avec un lit garni de résine G25 de 53 millilitres dans un tampon de bicarbonate d’ammonium de 15 millimolaires à l’aide d’un système FPLC.

Réglez le débit à cinq millilitres par minute et injectez l’échantillon tau sur la colonne via une boucle d’injection de cinq millilitres. Recueillir les fractions correspondant au pic d’absorption à 280 nanomètres. Regroupez toutes les fractions tau avant d’allouer l’échantillon dans les tubes.

Choisissez ces tubes de manière à ce que le volume de la solution soit petit par rapport au volume du tube. Ensuite, percez des trous dans les bouchons des tubes à l’aide d’une aiguille avant de congeler les échantillons de tau à moins 80 degrés Celsius pour une lyophilisation ultérieure. Solubiliser quatre milligrammes de tau phosphorylé lyophilisé enrichi en azote 15 et en carbone 13 dans 400 microlitres de tampon RMN.

Ajoutez cinq pour cent d’oxyde de deutérium pour le verrouillage du spectromètre RMN et un TMSP millimolaire comme référence de signal RMN interne. Ajoutez également 10 microlitres d’une solution mère de 40 EK d’un cocktail complet d’inhibiteurs de protéase. Transférez l’échantillon dans un tube RMN de cinq millilitres à l’aide d’une seringue électronique munie d’une longue aiguille ou à l’aide d’une pipette Pasteur.

Fermez le tube RMN à l’aide du piston. Éliminez toutes les bulles d’air coincées entre le piston et le liquide en déplaçant le piston. Placez le tube RMN dans une cuisse.

Utilisez la jauge appropriée pour ajuster sa position verticale dans la toupie de sorte que la majeure partie de la solution de l’échantillon se trouve à l’intérieur de la bobine RMN. Ensuite, démarrez le flux d’air dans l’instrument RMN en cliquant sur soulever dans la fenêtre du système de contrôle magnétique. Placez soigneusement le cône avec le tube dans le flux d’air en haut de l’alésage de l’aimant.

Ensuite, arrêtez le flux d’air et laissez le tube descendre en place à l’intérieur de la tête de sonde à l’intérieur de l’aimant. Après avoir laissé l’échantillon s’équilibrer à 25 degrés Celsius, tapez ATMM dans la ligne de commande pour effectuer un réglage semi-automatique et une correspondance de la tête de sonde afin d’optimiser la transmission de puissance. Cliquez ensuite sur le verrou dans la fenêtre du système de contrôle de l’aimant pour activer le verrouillage de fréquence de champ du spectromètre.

Démarrez la procédure de calage pour optimiser l’homogénéité du champ magnétique à la position de l’échantillon en tapant d’abord TopShim GUI sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre de calage. Cliquez ensuite sur démarrer dans la fenêtre de cale. Vérifiez l’écart-type B0 résiduel pour vérifier que les cales sont optimales.

Ensuite, calibrez le paramètre P1, qui est la durée d’une impulsion de radiofréquence de proton en microsecondes. Ce paramètre est nécessaire pour obtenir une rotation de 90 degrés de l’aimantation du spin du proton. Visez l’impulsion de 360 degrés en utilisant un spectre unidimensionnel de protons d’eau.

Ajustez le décalage de fréquence en réglant le paramètre O1 sur la fréquence de l’eau du proton dans le spectre unidimensionnel. Enfin, commencez l’acquisition du spectre de protons unidimensionnel en tapant ZG dans la ligne de commande. Un résultat représentatif de la purification de la protéine tau recombinante montre un pic d’absorption majeur à 280 nanomètres observé pendant le gradient d’élution.

Ce pic correspond à la protéine tau purifiée telle qu’on la voit sur le gel d’acrylamide au-dessus du chromatogramme. Le chromatogramme pour le dessalage de la protéine tau purifiée recombinante montre que le pic d’absorption à 280 nanomètres et le pic de conductivité sont bien séparés, ce qui garantit que le dessalage de la protéine est efficace pour l’étape de lyophilisation. Le spectre RMN unidimensionnel de l’azote recombinant 15 tau à 900 mégahertz confirme qu’un signal RMN provenant de l’échantillon de protéine peut être détecté.

Un bon rapport signal/bruit indique que les paramètres d’acquisition de base ont été correctement réglés. Le spectre bidimensionnel de la protéine phosphorylée montre une bonne résolution, les résonances sont étroites et bien séparées. Les résonances dans la région du spectre encadré en rouge correspondent aux résidus phosphorylés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure de produire une protéine recombinante avec un marquage facile à choisir, de purifier cette protéine et de configurer le paramètre de base pour l’acquisition des données spectrales. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en deux semaines s’il est bien organisé. N’oubliez pas que la spectroscopie RMN utilise des aimants très puissants qui ne doivent pas être approchés avec des objets métalliques.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que ces autres protéines sont sensibles à la lyse de la protéase et qu’un certain nombre de précautions doivent être prises pour éviter la dégradation de l’échantillon. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la RMN à l’état solide peuvent être appliquées pour étudier les agrégats de type amyloïde qui sont souvent formés par des protéines désordonnées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie chimique pour explorer des composés actifs à potentiel sérapatique dans des systèmes modèles in vitro.