Name: Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour lidentification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de spectroscopie RMN pour identifier les phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées, avec la protéine Tau comme étude de cas. Cette technique permet de lier les modifications structurales aux fonctions moléculaires.

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Les installations de RMN ont été financées par la Région Nord, le CNRS, l’Institut Pasteur de Lille, la Communauté européenne (FEDER), le Ministère français de la Recherche et l’Université des Sciences et Technologies de Lille. Nous remercions le soutien du TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) et de la plateforme RMN de Lille et RPE Santé et Biologie. Nos recherches sont soutenues par des subventions du LabEx (Laboratoire d’Excellence), de DISTALZ (Développement de Stratégies Innovantes pour une approche Transdisciplinaire de la maladie d’Alzheimer), de l’EU, ITN, TASPPI et de l’ANR BinAlz.

1. Production de 15 N, 13 C-Tau (Figure 1) <ol><li> Transformer pET15b-Tau recombinante plasmide d&#39; expression de T7 13,14 dans BL21 (DE3) , les cellules bactériennes d&#39; Escherichia coli compétentes 15. REMARQUE: le codage de l&#39; ADNc le plus long (441 résidus d&#39;acides aminés) Tau isoforme est clone entre les sites de restriction Ncol et Xhol dans le plasmide pET15b. <ol><li> Mélanger doucement 50 ul de BL21 (DE3) compétentes cellules, formant 1-5 x 10 7 colonies par pg d&#39;ADN de plasmide, avec 100 ng d&#39;ADN plasmidique dans un tube en plastique de 1,5 ml. NOTE: Codon-utilisation optimisée des souches bactériennes pour l&#39;expression de l&#39;ADNc eucaryote ne sont pas indispensables pour produire Tau humaine. </li><li> Placez le mélange de cellules sur la glace pendant 30 min, puis le choc thermique pendant 10 secondes à 42 ° C. Placer le tube de retour sur la glace pendant 5 minutes et ajouter 1 ml de la température ambiante LB (Luria-Bertani). Incuber la suspension bactérienne à 37 ° C pendant 30 min sous douceagitation. </li></ol></li><li> Se propager à l&#39;aide d&#39;une boucle d&#39;inoculation de 100 ul de suspension cellulaire uniformément sur une plaque de gélose de milieu LB contenant 100 ug / ml d&#39;ampicilline antibiotique. </li><li> Incuber la plaque de sélection pendant 15 heures à 37 ° C. </li><li> Gardez la plaque de sélection à 4 ° C jusqu&#39;à passer à l&#39;étape de culture, pour un maximum de 2 semaines environ. REMARQUE: un stock de glycérol de culture bactérienne (50% de glycérol), stocké à -80 ° C, peut être préparé pour commencer la culture à un stade ultérieur. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 M MgSÛ4, 1 ml de 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitamine complément, 1 ml 100 mg / ml d&#39; ampicilline à 1 L de sels M9 autoclavées (6 g Na 2 HPO 4, 3 g de KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl). NOTE: Un précipité blanc se forme lors de l&#39; addition de la solution de CaCl2 aux sels M9 qui se dissipe rapidement. </li><li> Solubiliser 300 mg de 15 N, 13 moyen C-complète, 1 g de 15NH4CI et 2 g de 6 13C - glucose dans 10 ml de milieu M9. Filtre-stériliser la solution d&#39;isotopes utilisant un filtre de 0,2 um, directement dans le milieu M9. </li><li> Suspendre l&#39;aide d&#39;une boucle inoculation une colonie de pET15b-Tau transformé les bactéries de la plaque de sélection dans 20 ml de milieu LB supplémenté avec 100 ug / ml d&#39;ampicilline. </li><li> Incuber le milieu inoculé à 37 ° C pendant environ 6 heures. </li><li> Mesurer la densité optique à 600 nm (DO 600) sur 1 ml d&#39;une dilution de dix fois de la culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique. REMARQUE: La turbidité de la culture bactérienne correspondant à une DO 600 de 3,0 à 4,0 indique que la phase de croissance de saturation est atteint. </li><li> Ajouter 20 ml de la culture LB saturé à 1 L de milieu de culture M9 supplémenté avec de l&#39;ampicilline (100 ug / ml de concentration finale) dans 2 L d&#39;Erlenmeyer en matière plastique flacon de culture dérouté. </li><li> Placer le flacon de culture dans un incubateur programmable réglé à 10 °C et à 50 tours par minute. Programmer l&#39;incubateur pour passer à 200 tours par minute et 37 ° C au début de la matinée du lendemain. </li><li> Mesurer la DO 600 sur 1 ml de culture bactérienne dans une cuve de spectromètre en plastique. Ajouter 400 ul de 1 M d&#39; IPTG (les β-D-thiogalactopyranoside d&#39; isopropyle 1) de la solution mère (conservés à -20 ° C) lorsque DO600 atteigne une valeur d&#39;environ 1,0 à induire l&#39;expression de la protéine recombinante Tau. </li><li> Continuer l&#39;incubation à 37 ° C pendant encore 3 h. Recueillir les cellules bactériennes par centrifugation à 5000 xg pendant 20 min. </li><li> Congeler le culot bactérien à -20 ° C. Maintenir l&#39;état congelé jusqu&#39;à l&#39;étape de purification, pendant une période prolongée si nécessaire. </li></ol> 2. La purification du 15 N, 13 C-Tau (Figure 2) <ol><li> échangeuse de cations autoclave (CEX), des tampons de purification à 121 ° C sous 15 psi pendant 20 min. tampons Conserver à 4 ° C. </li><li> Décongeler le culot de cellules bactériennes et remettre en suspension dans 45 ml soigneusementd&#39;extraction CEX un tampon (50 mM de tampon NaPi pH 6,5, EDTA 1 mM) fraîchement additionné de 1x inhibiteur de protéase de cocktail (1) et les tablettes ADNase I (2000 unités). </li><li> Perturber les cellules bactériennes en utilisant un homogénéisateur haute pression à 20 000 psi. 3-4 passes sont nécessaires. Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 40 min pour éliminer la matière insoluble. </li><li> Chauffer l&#39;extrait de cellule bactérienne pendant 15 minutes à 75 ° C en utilisant un bain d&#39;eau. REMARQUE: un précipité blanc est observé au bout de quelques minutes. </li><li> Centrifuger à 15000 xg pendant 20 minutes et de garder le surnageant contenant la protéine Tau stable à la chaleur. </li><li> Conserver à -20 ° C jusqu&#39;à l&#39;étape suivante de purification, si nécessaire. </li><li> Réaliser une chromatographie échangeuse de cations sur une résine de CEX forts en tant que colonne garnie de 5 ml de lit en utilisant une chromatographie liquide rapide des protéines système (FPLC) (figure 3 A). <ol><li> Régler le débit à 2,5 ml / min. </li><li> Equilibrer la colonne dans CEX Un tampon </li><li> Chargez le 60-70 ml heated-extrait contenant Tau en utilisant une pompe d&#39;échantillonnage, ou encore la pompe A, en fonction du système. Recueillir l&#39;écoulement pour l&#39;analyse afin de vérifier que la protéine Tau est efficacement obligatoire à la résine (voir 2.8). </li><li> Laver la résine avec CEX Un tampon jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance à 280 nm est de retour à la valeur de référence. </li><li> Tau éluer de la colonne en utilisant un triple gradient de NaCl obtenu par augmentation progressive de la CEX tampon B (tampon A CEX avec 1 M de NaCl). Programme FPLC comme suit: première étape du gradient de tampon de 25% CEX B dans 10 volumes de colonne (CV) pour atteindre 250 mM de NaCl, deuxième étape à un tampon de 50% CEX B 5 CV pour atteindre 500 mM de NaCl, et une troisième étape à 100% de tampon CEX B en 2 CV pour atteindre 1 M de NaCl. Recueillir des fractions de 1,5 ml pendant les étapes d&#39;élution. </li></ol></li><li> Analyser 10 ul des fractions recueillies au cours de l&#39;étape d&#39;élution par SDS-PAGE (gel de SDS-acrylamide à 12%) et de Coomassie (figure 3 A) 16. Vérifiez l&#39;étape de chargement sur la colonne et par analyzing 10 pl de l&#39;écoulement. </li><li> Choisissez les fractions contenant Tau et mettre en commun ces fractions pour l&#39;étape suivante. </li><li> Effectuer un échange de tampon sur les fractions Tau contenant regroupées (Figure 3 B). <ol><li> Equilibrer une colonne de dessalage de résine lit 53 ml de G25 emballé (26 x 10 cm) en mM de bicarbonate d&#39;ammonium 50 (tampon volatile) en utilisant un système FPLC. </li><li> débit de Set à 5 ml / min. Injecter l&#39;échantillon Tau sur la colonne par l&#39;intermédiaire d&#39;une boucle d&#39;injection de 5 ml. Recueillir les fractions correspondant au pic d&#39;absorption à 280 nm. </li><li> Répéter l&#39;injection de 3-4 fois, en fonction du volume du bassin initial CEX. </li></ol></li><li> Calculer la quantité de protéine tau purifiée en utilisant la zone de pic du chromatogramme à 280 nm (1 mg de Tau correspond à 140 mUA * ml). NOTE: Le coefficient de la protéine Tau d&#39;extinction à 280 nm est 7,550 M -1 cm -1. Tau ne contient pas de résidus Trp. </li><li> Piscine toutes les fractions Tau. </li><li> aliquot l&#39;échantillon dans des tubes contenant l&#39;équivalent de 1 à 5 mg de Tau. Choisir ces tubes, de sorte que le volume de solution est faible par rapport au volume du tube (par exemple 5 ml d&#39;une solution dans un tube de 50 ml). </li><li> Percez des trous dans les bouchons de tube à l&#39;aide d&#39;une aiguille. Congeler des échantillons Tau à -80 ° C. </li><li> échantillons Lyophiliser Tau. la protéine Tau lyophilisée peut être conservée à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. </li></ol> 3. In Vitro Phosphorylation de 15 N-Tau <ol><li> Dissoudre 5 mg de Tau lyophilisée dans 500 pi de tampon de phosphorylation (50 mM Hepes KOH pH 8,0, 12,5 mM de MgCl2, 1 mM d&#39; EDTA, 50 mM de NaCl). </li><li> Ajouter mM ATP 2,5 (25 pi de solution mM 100 conservés à -20 ° C), 1 mM de DTT (1 pi de 1 M solution mère maintenue à -20 ° C), 1 mM d&#39;EGTA (2 pi d&#39;un stock de 0,5 M solution), inhibiteur de la protéase 1x cocktail (25 pl d&#39;un 40x disponible obtenue en dissolvant 1 comprimé dans 1 ml de tampon de phosphorylation) et 181; M activé His-ERK2 (250 ul dans un tampon de conservation Hepes 10 mM, pH 7,3, 1 mM de DTT, 5 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol, stocké à -80 ° C) dans un volume d&#39;échantillon total de 1 ml. NOTE: L&#39;activation His-ERK2 peut être préparé en interne 5,8 par phosphorylation avec la kinase MEK. </li><li> Incuber 3 heures à 37 ° C. </li><li> Chauffer l&#39;échantillon à 75 ° C pendant 15 minutes pour inactiver la kinase ERK. </li><li> Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 15 min. Recueillir et conserver le surnageant. </li><li> Dessaler l&#39;échantillon de protéine dans 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium en utilisant une colonne de résine lit 3,45 ml G25 emballé (1,3 x 2,6 cm), qui est adapté pour un échantillon de 1 ml. </li><li> Exécuter un SDS-PAGE à 12% 16 avec 2,5 pi de l&#39;échantillon de protéine pour vérifier à la fois son intégrité et sa phosphorylation efficace (figure 4). </li><li> Lyophiliser l&#39;échantillon Tau phosphorylée. Conserver la poudre à -20 ° C. </li></ol> 4. Acquisition de spectres RMN (Figurer 5) <ol><li> Solubiliser 4 mg de lyophilisé 15 N, 13 C ERK phosphorylée-Tau dans 400 tampon de RMN ul (mM NaPi 50 ou 50 mM deutérés tris- de .cl, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM et DTT 1 mM). </li><li> Ajouter 5% de D 2 O pour le champ de verrouillage du spectromètre RMN et 1 mM de TMSP (3- (triméthylsilyl) sel de sodium de l&#39; acide propionique 4-2,2,3,3-d)) en tant que référence interne RMN du signal. Ajouter 10 ul d&#39;une solution 40x stock de complet cocktail d&#39;inhibiteurs de la protéase. </li><li> Transférer l&#39;échantillon dans un tube RMN de 5 mm à l&#39;aide d&#39;une seringue électronique avec une longue aiguille ou d&#39;une pipette Pasteur. Fermer le tube RMN en utilisant le piston. Enlevez toute bulle d&#39;air emprisonné entre le piston et le liquide par des mouvements de piston. </li><li> Placer le tube RMN dans un spinner. Ajuster sa position verticale dans le métier à filer avec le gabarit approprié pour la tête de la sonde de RMN utilisé, de telle sorte que la majeure partie de la solution d&#39;échantillon sera à l&#39;intérieur de la bobine RMN. </li><li> Démarrez le flux d&#39;air: cliquez ascenseur in la fenêtre du système de contrôle d&#39;aimant. Placez délicatement le spinner avec le tube dans le flux d&#39;air dans la partie supérieure de l&#39;alésage de l&#39;aimant. Arrêter le flux d&#39;air (cliquez ascenseur) et laisser le tube descendre en place à l&#39; intérieur de la tête de sonde dans l&#39;aimant. </li><li> Réglez la température à 25 ° C (298 K). </li><li> Effectuer le réglage semi-automatique et adaptation de la tête de sonde pour optimiser la transmission de puissance. Tapez ATMM sur la ligne de commande. </li><li> Verrouiller la fréquence du spectromètre à l&#39; aide du signal D 2 O de l&#39;échantillon enregistré sur le canal de deuterium. Cliquez verrouillage dans la fenêtre du système de contrôle de l&#39; aimant. </li><li> Démarrer la procédure de calage afin d&#39;optimiser l&#39;homogénéité du champ magnétique à la position de l&#39;échantillon. Tapez topshim gui sur la ligne de commande pour ouvrir la fenêtre de shim. Cliquez sur Démarrer dans la fenêtre de shim. Vérifiez la valeur résiduelle de variation norme B0 pour vérifier que les cales sont optimales (moins de 2 Hz est bonne). </li><li> Calibrer le paramètre p1 (longueur d&#39;un protonimpulsion radiofréquence en microsecondes), ce qui est nécessaire pour obtenir une rotation des spins de protons de 90 °. Visez l&#39;impulsion à 360 ° en utilisant un spectre 1D de protons de l&#39; eau (figure 6). </li><li> Ajuster le décalage en réglant le paramètre o1 (en Hz) de la fréquence du proton de l&#39; eau dans le spectre 1D (figure 6) la fréquence. </li><li> Commencer l&#39; acquisition d&#39;un spectre de proton 1D (séquence d&#39;impulsions avec une séquence écluse pour la suppression du signal de l&#39; eau, par exemple zggpw5) pour vérifier les signaux provenant de l&#39;échantillon (figure 7). Adapter le nombre de balayages de la concentration relative des protéines. Tapez zg sur la ligne de commande pour démarrer l&#39;acquisition. </li><li> Mettre en place des paramètres supplémentaires pour l&#39;acquisition d&#39;une 2D [1 H, 15 N] spectre HSQC (séquence d&#39; impulsions hsqcetfpf3gpsi, figures 8-9). <ol><li> Pour un 15 N, 13 C marqué échantillon, découpler 13 C au cours de l&#39;évolution indirecte 15 N. </li><li&gt; Définir le nombre de points et la largeur spectrale (ppm) dans le 1 H (F2) et 15 N (F1) dimensions. REMARQUE: Adapter le nombre de points de données d&#39;acquisition sur le terrain du spectromètre pour maintenir un nombre similaire de Hz par point et de limiter les temps de découplage: utiliser 3.072 points 900 MHz et 2048 points à 600 MHz, dans la 1 H dimension. </li><li> Optimiser les paramètres supplémentaires dans les séquences d&#39;impulsions, ce qui correspond à des retards, des longueurs d&#39;impulsion, le décalage des fréquences, des niveaux de puissance. Type de elon sur la ligne de commande pour afficher tous les paramètres pertinents pour l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Définissez les paramètres pour l&#39;acquisition d&#39;une 3D [1 H, 15 N, 13 C] spectre HNCACB (séquence d&#39;impulsions de hncacbgpwg3d, figure 10A) à 600 MHz. </li><li> Définir les paramètres 3D [1 H, 15 N, 15 N] expérience HNCANNH (séquence d&#39; impulsions hncannhgpwg3d) à 600 MHz. Réglez le nombre de points à 2048 dans le 1 H et 64et 128 points dans les deux 15 N dimensions. Définir les largeurs spectrales 14, 25, 25 parties par million (ppm) centré sur 4,7, 119, 119 ppm en 1 H 15 N et 15 N dimensions. Durée d&#39;acquisition avec 16 balayages est de 1 jour et 22 heures. </li></ol> 5. Identification des sites Phosphorylation <ol><li> Les spectres de processus utilisant l&#39;acquisition et la RMN de traitement logiciel. <ol><li> Effectuer une transformation de Fourier des données (figure 7). Type de pieds pour un spectre 1D, xfb pour un spectre 2D ou ft3d pour un spectre 3D, sur la ligne de commande. </li><li> Phase et référence tous les spectres (figure 7C) en utilisant les fenêtres interactives. </li></ol></li><li> Identifier les résonances d&#39;intérêt dans la 2D HSQC potentiellement correspondant aux résidus Ser et Thr phosphorylée (figure 9, boîte rouge). </li><li> Plans d&#39;extrait (c. -à- 2D 1 H- 13 C spectres) à partir dele spectre 3D 1 H- 15 N 13 C 15 N en utilisant les déplacements chimiques des résonances d&#39;intérêt pour le 2D. Utiliser le curseur de dimension 2 (w2) pour sélectionner la fréquence 15 N correspondant au plan (W1-W3) à visualiser (figure 10B). </li><li> Choisissez les fréquences de résonance de &#39;CA&#39; et 13 C noyaux «CB» de la «i» et les résidus &#39;i-1&#39; (ensemble plus faible des signaux par rapport à celles du résidu i) pour chaque [1 H, 15 N] résonance d&#39;intérêt dans le spectre HNCACB 3D en cliquant sur la résonance, dans le menu du mode de pointeur trouver / ajouter de pointe, pour ajouter la valeur de décalage chimique dans un fichier de liste de pointe. <ol><li> Identifier le type de résidu i, pSer ou pthr, en comparant les changements chimiques dans la liste des pics à des valeurs connues de CA et CB changements chimiques de pSer et pthr 17. </li><li> Identifier la présence d&#39;un résidu Pro à la i + 1 position par une caractéristique supplémentaire +2 ppm changement of la valeur de décalage CA chimique 18. </li><li> Comparer les valeurs de déplacement chimique des CA et CB résonnances correspondant au résidu i-1 à une table des déplacements chimiques prévus pour Tau résidus d&#39;acides aminés 19 d&#39;identifier la nature du résidu à la position i-1. </li></ol></li><li> Choisissez les fréquences de résonance de 15 N noyaux de la &#39;i&#39; et &#39;i-1&#39; résidus pour chaque résonance [1 H, 15 N] d&#39;intérêt dans le spectre de HNCANNH. </li><li> Comparer les valeurs 15 N de déplacement chimique à l&#39;affectation de déplacement chimique de la protéine Tau 20 - 23. </li><li> Comparer les dipeptides identifiées avec la séquence de Tau pour définir la mission spécifique de séquence. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés. L&#39;expression recombinante et purification décrit ici pour la pleine longueur de la protéine Tau humaine peuvent de même être utilisés pour produire des mutants Tau Tau ou domaines. Isotopiquement enrichi de protéines est nécessaire pour la spectroscopie RMN, ce qui nécessite l&#39;expression recombinante. Identification des sites de phosphorylation nécessite l&#39; affectation de résonance et une protéine doublem...

L&#39; un des principaux défis de la santé au 21 e siècle , sont des maladies neurodégénératives telles que la maladie d&#39; Alzheimer (MA). Tau est une protéine associée aux microtubules qui stimule microtubules (MT) la formation. Tau est également impliqué dans plusieurs maladies neurodégénératives, soi-disant tauopathies, dont le plus connu est AD. Dans ces troubles, Tau auto-agrégats en filaments hélicoïdaux appariés (PHF) et se trouve modifié sur de nombreux résidus de modifications post - traductionnelles (PTM) , tels que la phosphorylation 1. La phosphorylation de la protéine Tau est impliquée à la fois dans la régulation de sa fonction physiologique de la stabilisation MT et la perte pathologique de la fonction qui caractérise les neurones AD. En outre, la protéine Tau, lorsqu&#39;ils sont intégrés dans les PHF dans des neurones malades, est invariablement hyperphosphorylée 2. Contrairement à Tau normale qui contient 2-3 groupes phosphate, le Tau hyperphosphorylée en PHF contient 5 à 9 phosphatgroupes E 3. Hyperphosphorylation de Tau correspond à la fois à une augmentation de la stoechiométrie à certains sites et de la phosphorylation des sites supplémentaires qui sont appelés des sites pathologiques de phosphorylation. Cependant, le chevauchement existe entre AD et modèles adultes normaux de phosphorylation, en dépit des différences quantitatives dans le niveau 4. Quelle est la spécificité des événements de phosphorylation fonction d&#39;influence et le dysfonctionnement de Tau reste largement inconnu. Notre objectif est de décrypter la réglementation Tau par PTM au niveau moléculaire. Pour approfondir la compréhension des aspects moléculaires de Tau, nous devons relever les défis techniques. Tout d&#39;abord, Tau est une protéine intrinsèquement désordonnés (IDP) lorsque isolé en solution. De telles protéines manquent structure tridimensionnelle bien définie dans des conditions physiologiques et nécessitent des méthodes particulières biophysiques pour étudier leur fonction (s) et les propriétés structurelles. Tau est un paradigme pour la classe croissante des personnes déplacées, souvent trouvé associé àpathologies telles que les maladies neurodégénératives, ce qui augmente l&#39;intérêt de comprendre les paramètres moléculaires qui sous-tendent leurs fonctions. En second lieu, la caractérisation de la phosphorylation de tau est un défi analytique, avec des 80 sites potentiels de phosphorylation le long de la séquence la plus longue isoforme Tau 441 acides aminés. Un certain nombre d&#39;anticorps ont été développés contre des épitopes de la protéine tau phosphorylée et sont utilisés pour la détection de tau dans les neurones pathologique ou le tissu cérébral. les événements de phosphorylation peuvent avoir lieu sur au moins 20 sites ciblés par les kinases de proline dirigée, la plupart d&#39;entre eux dans la proximité de la région riche en proline. Le qualitative (quels sites?) Et quantitative (ce stoechiométrie?) La caractérisation est difficile , même par les plus récentes techniques MS 5. spectroscopie RMN peut être utilisée pour étudier des protéines qui sont hautement désordonnés des systèmes dynamiques constitués d&#39;ensembles de conformères. spectroscopie RMN à haute résolution a été applied pour étudier la structure et la fonction de la protéine Tau. En outre, la complexité du profil de phosphorylation de Tau a conduit au développement d&#39;outils moléculaires et de nouvelles méthodes d&#39; analyse par RMN pour l&#39;identification des sites de phosphorylation 6 - 8. RMN comme méthode d&#39;analyse permet d&#39;identifier des sites de phosphorylation de tau de manière globale, la visualisation de toutes les modifications à site unique en une seule expérience, et la quantification de l&#39;étendue de l&#39;incorporation de phosphate. Ce point est essentiel, car bien que les études de phosphorylation sur Tau abondent dans la littérature, la plupart d&#39;entre eux ont été réalisées avec des anticorps, laissant un grand degré d&#39;incertitude sur le profil complet de phosphorylation et donc l&#39;impact réel des événements de phosphorylation individuels. y compris les kinases PKA recombinants, glycogène synthase kinase 3β (GSK3), la kinase dépendante de la cycline 2 / cycline A (CDK2 / CycA), la kinase dépendant de la cycline 5 (CDK5) / p25 acteprotéine ivator, extracellulaire régulée par un signal kinase 2 (ERK2) et microtubules affinité régulation kinase (MARK), qui présentent une activité de phosphorylation vers Tau, peuvent être préparés sous une forme active. En outre, les mutants Tau qui permettent de générer des isoformes de protéines Tau spécifiques avec des motifs de phosphorylation bien caractérisés sont utilisés pour déchiffrer le code de phosphorylation de Tau. Spectroscopie RMN est ensuite utilisée pour caractériser des échantillons Tau enzymatiquement modifiés 6 - 8. Bien que la phosphorylation in vitro de Tau est plus difficile que pseudo-phosphorylation , par exemple par mutation de Ser / Thr choisi en acide glutamique (Glu) des résidus, cette approche a ses mérites. En effet, ni les chocs, ni interaction paramètres structurels de phosphorylation peuvent toujours être imitées par les acides glutamique. Un exemple est le motif de tour observé autour phosphosérine 202 (pSer202) / 205 phosphothréonine (pThr205), qui ne sont pas reproduits avec des mutations Glu 9. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Ici, la préparation du marquage isotopique des investigations RMN Tau sera décrit d&#39;abord. La protéine tau phosphorylée par ERK2 est modifié sur de nombreux sites décrits comme des sites pathologiques de phosphorylation, et représente donc un modèle intéressant de Tau hyperphosphorylée. Un protocole détaillé de Tau dans la phosphorylation in vitro par ERK2 kinase recombinante est présentée. L&#39; ERK2 est activé par la phosphorylation par la protéine kinase activée par mitogene / ERK kinase (MEK) 10-12. En plus de la préparation de la modification, de la protéine Tau marqué isotopiquement, la stratégie utilisée pour l&#39;identification RMN du PTM est décrite.

<table><tbody><tr><td>Plasmide d’expression recombinant T7 pET15B</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) transformation compétente E. coli bactéries</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Maintenir à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Bouillon LB autoclave, Lennox&nbsp ;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Croissance bactérienne Medium Compléments</td></tr><tr><td>vitaminiques MEM 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Croissance bactérienne Medium Supplément</td></tr><tr><td>15N, 13C-ISOGRO complete medium poudre</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Bacterial Growth Medium Supplement</td></tr><tr><td>15NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>13C6-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>Protéase comprimés&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Garder à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>1 comprimé dans 1 ml est une solution 40x qui peut être conservée à -20 &deg ; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Homogénéisateur (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>La lyse est réalisée à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pierce&trade ; Protéine non colorée MW Marker</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>active MEK1 kinase humaine, GST Étiqueté</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Maintenir à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>AKT&Auml ; Système de chromatographie pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (colonne de 5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Colonnes de chromatographie échangeuse de cations</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Dessalage GE</td><td>Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Colonne de dessalage des protéines</td></tr><tr><td>MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Colonne de dessalage des protéines</td></tr><tr><td>Tris D11, 97 % D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Tampon RMN deutéré</td></tr><tr><td>5 mm Microtube symétrique SHIGEMI D2O (ensemble de 5 tuyaux intérieurs et extérieurs)&nbsp ;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>RMN Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol kit-seringue électronique kit de démarrage</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetage</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII avec une sonde cryogénique à triple résonance</td><td>Spectromètre RMN Bruker</td><td></td><td>pour l’acquisition de données</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance avec une sonde cryogénique à triple résonance</td><td>Spectromètre RMN Bruker</td><td></td><td>pour l’acquisition de données</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition et de traitement pour les expériences</td></tr><tr><td>RMN Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard et D. G. Kneller)</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données RMN</td></tr></tbody></table>

spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l&#39;identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Les agrégats de la protéine neuronale Tau se trouvent à l’intérieur des neurones des patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Le développement de la maladie s’accompagne d’une phosphorylation accrue et anormale de Tau. Dans le cadre de l’étude moléculaire des fonctions et des dysfonctionnements de Tau dans la maladie, la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est utilisée pour identifier les multiples phosphorylations de Tau. Nous présentons ici des protocoles détaillés de production recombinante de Tau chez les bactéries, avec enrichissement isotopique pour les études RMN. Les étapes de purification qui tirent parti de la stabilité thermique de Tau et de son point isoélectrique élevé sont décrites. Le protocole de phosphorylation in vitro de Tau par ERK2 activé recombinant permet de générer des phosphorylations multiples. L’échantillon de protéines est prêt pour l’acquisition de données à la sortie de ces étapes. La configuration des paramètres pour commencer l’enregistrement sur le spectromètre est prise en compte. Enfin, la stratégie d’identification des sites de phosphorylation de Tau modifiée, basée sur des données RMN, est expliquée. L’avantage de cette méthodologie par rapport à d’autres techniques utilisées pour identifier les sites de phosphorylation, telles que l’immunodétection ou la spectrométrie de masse (MS), est discuté.

La figure 3A montre un pic majeur d&#39;absorption à 280 nm observée au cours du gradient d&#39;élution. Ce pic correspond à une protéine Tau purifiée comme on le voit sur le gel d&#39;acrylamide au-dessus du chromatogramme. La figure 3B montre un pic d&#39;absorption bien séparés à 280 nm et un pic de conductivité, en veillant à ce que le dessalage de la protéine est efficace. La figure 4 montre un gel de protéine de décalage observée par analyse SDS-PAGE 16 caractéristique de l...

Nous décrivons ici une méthode pour identifier les phosphorylations multiples d’une protéine intrinsèquement désordonnée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), en utilisant la protéine Tau comme étude de cas. La protéine Tau recombinante est enrichie isotopiquement et modifiée in vitro par une kinase avant l’acquisition et l’analyse des données.

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l&#39;identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

L’objectif global de cette méthodologie est d’identifier la phosphorylation multiple d’une protéine intrinsèquement désordonnée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire en utilisant la protéine tau comme étude de cas. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la régulation moléculaire liée à la maladie, telles que l’impact de la phosphorylation sur l’interaction de la protéine avec son partenaire moléculaire. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons identifier la phosphorylation spécifique d’un site dans une protéine désordonnée et la relier à des changements structurels et fonctionnels.Cette méthode peut fournir des informations sur la fonction. Il peut également être appliqué à d’autres protéines telles que les restes désordonnés de la protéine d’ADN du virus aPtc Les applications de cette technique s’étendent à la thérapie par le développement de protéines, inhibiteurs d’interaction protéique. Cette méthode sera démontrée par Clément Danis, Clément Després, Luiza Bessa et Hamida Merzougui, les doctorants de notre groupe.Pour commencer, mélangez doucement 50 microlitres de cellules BL21 compétentes avec 100 nanogrammes d’ADN pl

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Cette vidéo montre l’utilisation des techniques de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) pour identifier les phosphorylations multiples dans une protéine. La phosphorylation d’une protéine à un acide aminé spécifique provoque le déblindage de l’amide hydrogène voisin, qui génère la différence spectrale.

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour identifier les phosphorylations multiples dans les protéines

Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d'interaction.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

La phosphorylation des protéines est une caractéristique centrale de la façon dont les cellules interprètent et répondent à l’information dans leur milieu extracellulaire. Ici, nous présentons un protocole de criblage à haut débit utilisant des kinases purifiées à partir de cellules de mammifères pour identifier rapidement les kinases qui phosphorylent un ou plusieurs substrats d’intérêt.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit

Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d'expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.

Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

Structures des assemblages supramoléculaires protéine à résolution atomique sont de grande importance en raison de leur rôle crucial dans une variété de phénomènes biologiques. Ici, nous présentons un protocole pour effectuer des études structurales à haute résolution sur des ensembles de protéines macromoléculaire insoluble et non cristalline par magie-angle spinning spectroscopie RMN à l’état solide (MAS SSNMR).

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) intervient dans la phase G2 du cycle cellulaire et régule les nombreuses voies cellulaires. Ici, nous présentons un protocole de test in vitro kinase Cdk1, qui permet l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques pour l’établissement de cibles cellulaires de cette kinase importante.

Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) peut caractériser la dynamique des protéines structurelles d’une manière spécifique aux résidus. Nous fournissons un protocole pratique pour l’enregistrement d’expériences de relaxation RMN 15N R1 et R2 et d’expériences à effet Overhauser hétéronucléaire {1H}-15N, sensibles à l’échelle de temps de la picoseconde à la nanoseconde.

Expériences de relaxation RMN 15N pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines de la picoseconde à la nanoseconde

Découvrez une méthode de spectroscopie RMN pour identifier les phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées, avec la protéine Tau comme étude de cas. Cette technique permet de lier les modifications structurales aux fonctions moléculaires.

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Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l'identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

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