Name: Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish ( Danio rerio) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez comment évaluer l'invasion vasculaire des cellules cancéreuses dans des embryons de zebrafish (Danio rerio) par micro-injection et microscopie à fluorescence. Cette méthode accélère l'étude de la métastase.

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Nous remercions Peter Johnson de la centrale de microscopie de l’Université de Georgetown pour son aide dans l’imagerie des embryons de poisson-zèbre. La ressource partagée en microscopie et en imagerie et la ressource partagée en poisson zèbre sont partiellement financées par la subvention P30-CA051008 du NIH/NCI. Ce travail a également été soutenu par les NIH/NCI CA71508 (AW) et CA177466 (AW).

Déclaration d&#39;éthique: embryons de poisson zèbre ont été générés selon un protocole IACUC approuvé. Ces expériences ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Comité sur les soins et l&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de Georgetown. 1. Organiser Embryons pour injection et créer Stock Solutions <ol><li> Générer des larves de poisson zèbre nécessaire pour évaluer la cellule cancéreuse invasion vasculaire. <ol><li> Mettre en place par paire ou d&#39;un groupe en croix accouplement avec Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa b692; ednrb1 b140 poissons. NOTE: Nous avons généré Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafish, en croisant Tg (kdrl: grcfp) ZN1 25, qui expriment récif protéine fluorescente verte de corail dans les cellules endothéliales, avec une ligne qui manque des cellules pigmentaires, mitfa b692; ednrb1 b140, développé au Centre international Resource Zebrafish. </li><li> Coœufs de llect, propre, et de supprimer les embryons fécondés ou déformés , le lendemain 22. </li><li> Incuber embryons à 28,5 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;injection avec des cellules cancéreuses, de se produire lorsque les embryons de poisson zèbre sont de 2 jours après la fécondation (2 dpf). </li></ol></li><li> Faire des plaques d&#39;injection. <ol><li> Faire fondre 25 ml de 1,5% d&#39; agarose dans dH 2 O pour chaque plaque. </li><li> Verser 12 ml de l&#39;agarose dans un 100 mm x 15 mm boîte de Pétri et laisser durcir. </li><li> Re-fondre puis verser les agarose restants dans la plaque. </li><li> Immédiatement positionner un moule en verre découpée (3 mm x 7,2 cm de large x 7,5 cm de longueur) de sorte qu&#39;il soit à un angle de 30 degrés par rapport à l&#39;agarose et est positionné au centre de la plaque. NOTE: Cela va créer une paroi abrupte de 60 ° et une rampe inclinée à 30 °. </li><li> Tape le moule en verre en place et laisser durcir agarose. </li><li> Retirez délicatement le moule en verre et faire attention à ne pas déchirer l&#39;agarose. REMARQUE: Les moules peuvent être stockées dans dH2Û à 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrer plaque d&#39;injection avec de l&#39;eau de poisson (0,3 g / L de sel de mer). <ol><li> plaque deux fois avec de l&#39;eau distillée de rinçage. </li><li> Equilibrer plaque en ajoutant 10 ml d&#39;eau de poisson à la plaque et placer sur un agitateur pendant 10 min. </li><li> Equilibrer plaque une deuxième fois avec l&#39;eau du poisson. </li></ol></li><li> Split 2 jours après la fécondation (dpf) embryons dans des groupes d&#39;injection en les transférant dans des boîtes contenant de l&#39; eau du poisson 22. </li><li> Préparer des plats de récupération pour chaque groupe à utiliser après l&#39;injection. Assurez-vous que le bac de récupération contient de l&#39;eau 10 ml de poisson, plus de la pénicilline (25 ug / ml) et streptomycine (50 pg / ml). </li><li> Préparer la solution de tricaïne 2x en ajoutant 4 ml de tampon tricaïne stock (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) à 50 ml d&#39;eau du poisson plus de la pénicilline et de la streptomycine. </li><li> Dissoudre 15 mg bas point de fusion d&#39;agarose dans 10 ml de solution de tricaïne 2x pour générer un milieu anesthésique de montage qui immobilisera embryons vivants pour imaging. NOTE: Montage milieu est constitué de 1,5% d&#39;agarose. </li><li> Tirez des aiguilles de microinjection. <ol><li> Placer un tube capillaire en verre dans une pipette de traction verticale. Tirez pipettes à long coniques en utilisant 20 courant mAmp et un élément chauffant 2-bobine. </li></ol></li></ol> 2. Les cellules cancéreuses Étiquetage avec lipophile Fluorescent Dye <ol><li> Maintenir les cellules cancéreuses dans leurs conditions de culture recommandées. REMARQUE: Ces lignes ont été maintenues dans du DMEM + 10% de FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 et SK-BR-3. Ces lignes ont été maintenues dans RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 et T-47D. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant l&#39; incubation. </li><li> Générer une suspension monocellulaire en dissociant une culture adhérente des cellules cancéreuses. <ol><li> Laver les cellules d&#39;abord avec du PBS, puis traiter avec une solution de trypsine-EDTA 0,05%. REMARQUE: le temps d&#39;exposition trypsine dépendra de la lignée cellulaire. </li><li> Neutraliser la solution de trypsine avec soirhum contenant des milieux de culture cellulaire après que les cellules se détachent. </li></ol></li><li> Centrifuger la suspension cellulaire trypsine neutralisée pendant 5 min à 200 x g, puis remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de culture frais pour le comptage des cellules. </li><li> Compter la suspension cellulaire en utilisant un compteur automatique et préparer 1 million de cellules dans 200 ul de milieu de culture cellulaire. <ol><li> Vérifier la viabilité des cellules avec trypan exclusion de colorant bleu avant l&#39;injection dans des embryons de poisson zèbre. NOTE: Les populations cellulaires seulement viables devraient être injectées dans des embryons de poisson zèbre, comme l&#39;injection de cellules mortes ne reflétera pas vrai invasion vasculaire. </li></ol></li><li> Ajouter 2 pi de colorant lipophile rouge à la suspension de cellules de cancer pour une dilution de 1: 100, bien mélanger, puis incuber le mélange à 37 ° C pendant 20 min. REMARQUE: La concentration du temps de colorant et le marquage peut avoir besoin d&#39;être optimisé pour chaque lignée cellulaire. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 1 ml de milieu frais dans le tube et puis centrifuger pendant 5 min à200 x g. </li><li> Laver le colorant fluorescent résiduel des cellules cancéreuses. <ol><li> Aspirer le surnageant du culot cellulaire, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de culture frais, et centrifuger pendant 5 min à 200 x g. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage une seconde fois: aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu frais, puis centrifuger à nouveau pendant 5 min à 200 x g. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage troisième fois: aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu frais, puis centrifuger à nouveau pendant 5 min à 200 x g. </li></ol></li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire contenant 1 million de cellules cancéreuses marquées dans 500 pi de milieu frais. NOTE: 0,5 mM d&#39;EDTA peut être ajouté aux médias pour empêcher l&#39;agglutination des cellules. </li></ol> 3. Les cellules cancéreuses Injecter dans le Sinus pré-cardiaque d&#39;embryons de poissons zèbres <ol><li> Fixer le système de distribution de micro-injection à une source d&#39;air sous pression et tourner sur ee microinjection source d&#39;alimentation du système de distribution. <ol><li> Pression d&#39;essai en appuyant sur la pédale. Une brève impulsion d&#39;air doit émettre à partir du porte-aiguille. </li></ol></li><li> Equilibrer les plaques d&#39;injection à deux reprises avec la solution 2x tricaïne. <ol><li> Pour chaque étape d&#39;équilibration, ajouter 20 ml de solution de tricaïne 2x à la plaque d&#39;injection et le placer sur agitateur pendant 10 min. </li></ol></li><li> Utilisez la pipette en plastique pour transférer un groupe d&#39;embryons à un petit plat contenant la solution 2x tricaïne. </li><li> Remblayer l&#39;aiguille d&#39;injection de microinjection avec les cellules cancéreuses à l&#39;aide d&#39;une pipette gel-chargement. <ol><li> Placez l&#39;aiguille dans un bocal de stockage d&#39;électrode à l&#39;extrémité pointue vers le bas afin cellules se déposent près de la pointe. </li></ol></li><li> Transférer 20 - 30 embryons anesthésiés à une plaque d&#39;injection, en recueillant les embryons avec beaucoup de tricaïne 2x dans une pipette en plastique. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Autoriser les embryons à régler dans la pointe de la pipette. </li><li> gentlemanly expulse les embryons dans le creux de la plaque d&#39;injection, l&#39;étalement des embryons sur toute la longueur de la goulotte. </li><li> Aligner les embryons avec des têtes tournées vers le haut et le ventre face à la paroi abrupte de l&#39;auge. NOTE: solution de Tricaine devrait couvrir à la fois la longueur de l&#39;auge et la surface d&#39;agarose plat, avec des embryons ne résidant dans l&#39;auge. Embryons sont maintenant prêts pour l&#39;injection. </li></ol></li><li> Injecter 50 - 100 cellules cancéreuses (2 - 5 nl) dans le sinus précardiaque des embryons de poisson zèbre à l&#39;aide du système de micro-injection de distribution. <ol><li> Fixer l&#39;aiguille au support d&#39;aiguille d&#39;un micromanipulateur. </li><li> Positionner la plaque d&#39;injection sous le stéréoscope avec la paroi de 60 degrés vers la gauche et se concentrer sur l&#39;embryon supérieure à 25x grossissement. </li><li> Positionner le micromanipulateur de telle sorte que, lorsqu&#39;il est étendu, l&#39;aiguille percera l&#39;embryon. </li><li> Prolongez l&#39;aiguille à l&#39;oeil jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit presque toucher l&#39;embryon. </li><li> Regarder sous le microscope, aligner l&#39;aiguille de sorte tchapeau, il percera l&#39;embryon après prolongation. </li><li> Pierce l&#39;embryon à travers le sac vitellin plaçant la pointe juste au, mais pas dans le sinus pré-cardiaque. </li><li> Injecter des cellules en appuyant sur la pédale. La force de l&#39;injection expulse les cellules dans le sinus cardiaque. Dégager l&#39;aiguille. </li><li> Utilisation de la main droite, étendre et rétracter l&#39;aiguille d&#39;injection. Avec la main gauche, effectuer des réglages fins à la position suivante embryon. </li><li> Retour de l&#39;aiguille dans le pot de stockage de l&#39;électrode lors de la configuration pour injecter une autre plaque. </li></ol></li><li> Transférer les embryons dans le plat de récupération une fois que la totalité de la plaque est injectée. <ol><li> Inclinez la plaque d&#39;injection pour mettre en commun les embryons au fond, le lavage des embryons restants sur l&#39;auge, et la collecte à la pipette en plastique. </li><li> Laisser les embryons se déposer dans le fond de la pipette. </li><li> Transférer les embryons au bac de récupération dans un volume minimal de tricaïne. </li></ol></li><li> incubate bac de récupération à 28 ° C pendant 1 heure. <ol><li> Séparer les embryons de poisson zèbre viables à partir d&#39;embryons morts et d&#39;autres débris. </li></ol></li><li> Incuber plat à 33 ° C jusqu&#39;au moment de la notation, typiquement 24-96 h. REMARQUE: Cette température est déterminée comme un compromis entre 37 ° C, la température idéale pour les cellules cancéreuses, et à 28,5 ° C, la température idéale pour le poisson zèbre. </li></ol> 4. La notation extravasation <ol><li> Anesthésier le lot d&#39;embryons à être marqué en les plaçant dans un plat avec une solution de tricaïne. </li><li> Placer une larve anesthésiés sur une lame de microscope à dépression dans une goutte de tricaïne. <ol><li> larves Orient latéralement pour l&#39;imagerie optimale de la région caudale. </li></ol></li><li> Comptez le nombre de cellules cancéreuses qui ont envahi avec succès de la vascularisation en se concentrant de haut en bas à travers la région de la queue de discerner clairement les cellules intactes. NOTE: Il est préférable d&#39;avoir au moins deux personnes impliquées dans tson processus, où l&#39;individu en marquant le poisson est aveugle à la condition expérimentale en cours d&#39;évaluation. <ol><li> Score des larves sur un microscope à fluorescence composé avec l&#39;objectif 10x. Utilisez l&#39;objectif 20x pour les appels difficiles. </li></ol></li></ol> 5. Embryons de montage sur des lames et ultérieure Fluorescence Imaging <ol><li> Faire fondre la solution d&#39;agarose / de tricaïne 1,5% et porter à 37 ° C. </li><li> Anesthésier l&#39;embryon à imager en le plaçant dans une solution de tricaïne. </li><li> Le transfert de l&#39;embryon dans une goutte de solution de tricaïne à la surface d&#39;imagerie. Vous pouvez éventuellement utiliser un plat ou lame de microscope à fond de verre. </li><li> Utiliser une pipette de verre pour éliminer la solution en excès tricaïne, tout en conservant l&#39;embryon sur la surface d&#39;imagerie. </li><li> Superposez une goutte de solution d&#39;agarose fondu sur l&#39;embryon. </li><li> Rapidement, avant l&#39;agarose polymérise, utilisez un outil délicat, comme une brosse à cils, pour orienter l&#39;embryon latéralement pour l&#39;imagerie, en donnant des soins supplémentairespour assurer l&#39;embryon est aplatie le long de la surface d&#39;imagerie. </li><li> Immerger la goutte d&#39;agarose maintenant polymérisé sous solution de tricaïne. </li><li> Soumettre l&#39;embryon de poisson zèbre en direct à l&#39;imagerie microscopique. </li></ol> 6. Modification: Injecter cellules cancéreuses dans le jaune Sac de Zebrafish Embryons <ol><li> Préparer le système et d&#39;injection plaques microinjection de se passer comme décrit précédemment dans la section (3) de ce protocole. </li><li> Etiqueter deux populations cellulaires contrastant avec des colorants fluorescents comme décrit précédemment dans la section (2) de ce protocole. </li><li> Injecter 5 à 10 nl de 2 x 10 ^ 7 cellules / ml dans le sac vitellin. Maintenir constant le volume d&#39;injection pour injecter le nombre de cellules identiques (100 - 200 cellules cancéreuses) de chaque population cellulaire NOTE: On peut utiliser des embryons de poisson zèbre transparent manquant vasculature fluorescent pour cet essai. entrée passive de particules dans le système vasculaire peut être contrôlé par l&#39;injection des perles fluorescentes (&lt;10 um) ou, modifiernativement, une lignée cellulaire qui n&#39;intravsate pas. </li><li> Récupérer les embryons injectés comme décrit précédemment dans la section (3) de ce protocole, puis l&#39;écran pour injections réussies. <ol><li> Utilisez un stéréoscope à l&#39;écran et le transfert des embryons viables qui ont été injectés avec succès à un nouveau plat. NOTE: Tous les embryons doivent avoir une masse de taille constante des cellules situées dans le jaune. Embryons sont rejetées si la taille de masse diffère ou si des cellules sont situées en dehors du jaune. </li><li> Transférer les embryons viables à un nouveau plat si les cellules cancéreuses sont clairement visibles dans le sac jaune. </li></ol></li><li> Incuber plat à 33 ° C jusqu&#39;au moment de la notation, typiquement 24-48 h. REMARQUE: Cette température est déterminée comme un compromis entre 37 ° C, la température idéale pour les cellules cancéreuses, et à 28,5 ° C, la température idéale pour le poisson zèbre. </li><li> Pour marquer intravasation, suivez les instructions décrites dans la section (4) de ce protocole, mais au lieu de compter le nombre de cANCER cellules qui ont envahi avec succès dans le système vasculaire de la région caudale. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Cette technique utilise le modèle zebrafish pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses (voir Figure 1). Ici , nous avons appliqué la technique à un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, afin de fournir une base sur laquelle d&#39; autres chercheurs peuvent alors construire leurs propres études (voir le tableau 1, figures 2 - 3). L&#39;observation que MDA-MB-231 cellules facilement envahi dans la région caudale d&#39;embry...

La maladie métastatique est une cause majeure de mortalité et de nombreux mécanismes qui permettent la diffusion des cellules cancéreuses restent à découvrir 1 cancer. Pour une cellule cancéreuse à métastaser avec succès, il doit tout d&#39;abord envahir à travers le stroma entourant la tumeur primaire, entrer (intravasate) dans le système circulatoire, à survivre dans le transit, la sortie (extravasation) à partir de la circulation, et enfin d&#39;établir une colonie viable sur le site de l&#39; organe distant 2. Intravasculaire et extravasation sont donc des étapes cruciales dans la cascade métastatique, mais toutes les cellules du cancer ne sont pas intrinsèquement aptes à perturber et à migrer à travers les jonctions endothéliales 3. En fait, il existe une série de pressions de sélection unique qui entourent la cellule cancéreuse une invasion vasculaire et le processus peut être encore influencée par une variété de facteurs endogènes et exogènes 4. Pour ces raisons, les techniques qui sondent le comportement agressif du cancer de stade avancé se concentrent souvent sur vasculaire capacité invasive comme un moyen de prédire la dissémination métastatique. Divers systèmes de modèles existent pour faciliter l&#39;étude des cellules cancéreuses envahissement vasculaire in vitro. Le plus utilisé dans des essais in vitro impliquent soit des systèmes Transwell pour évaluer la migration des cellules cancéreuses à travers une barrière endothéliale 5 ou de la technologie électrique Cell-Substrat Impedance Sensing (ECIS) pour surveiller en temps réel les perturbations d&#39;une monocouche endothéliale intacte par les cellules cancéreuses 6. Ces dosages manquent généralement de la dynamique des fluides et des facteurs de stroma qui seraient par ailleurs une incidence sur l&#39;attachement des cellules cancéreuses à une paroi endothéliale. Cette question est quelque peu contournée par des réseaux vasculaires irrigables qui découlent de la culture 3D de l&#39; endothélium à l&#39; appui des cellules stromales, et ces systèmes microfluidiques 3D représentent désormais l&#39;avant - garde des options actuelles in vitro 7,8. Pourtant, ces approches omettent le microenvironnement robuste d&#39;un système circulatoire fonctionnelet donc seulement en remplaçant une partie des modèles in vivo. Le plus largement utilisé dans le modèle in vivo de l&#39; invasion vasculaire est la souris, dans lequel des essais de métastases expérimentales sont généralement effectuées parce qu&#39;ils se produisent sur des échelles de temps relativement courtes et sont généralement indicatives de la capacité métastatique 9. Ces essais impliquent l&#39;injection directe de cellules cancéreuses en circulation, et donc de modéliser les étapes d&#39;extrémité des métastases, à savoir une extravasation et une cellule cancéreuse colonisation des organes. Les essais de métastases expérimentales diffèrent en fonction du site d&#39;injection des cellules cancéreuses et les organes finalement analysés. Dans le premier type d&#39;essai, les cellules cancéreuses sont injectées dans la veine caudale de la souris et l&#39; ensemencement des cellules cancéreuses dans les poumons est contrôlée 10,11. Le second test consiste à effectuer des injections intracardiaques pour semis direct métastatique vers le microenvironnement osseux 12 à 14, mais aussi le cerveau 15. Dans le troisième essai, le cancer du cells sont injectées dans la rate, afin de permettre la colonisation du foie 16 tandis que la quatrième voie de livraison dans l&#39;artère carotide transporte des cellules cancéreuses du cerveau 17,18. Indépendamment de la méthode de distribution des cellules cancéreuses, la colonisation d&#39;organes est le point final expérimental accepté et est généralement déterminée par luminescence, histologie, ou des techniques basées sur la PCR. Malgré les avantages physiologiques de la réalisation d&#39;essais de métastases expérimentales dans un hôte murin, ces expériences ont encore besoin de semaines à quelques mois pour terminer et à analyser. Le poisson zèbre (Danio rerio) modèle a récemment émergé comme un nouveau système pour étudier la progression du cancer 19,20, et permet l&#39;évaluation de la cellule cancéreuse invasion vasculaire dans un système circulatoire fonctionnelle sur une échelle de temps beaucoup plus courte en comparaison avec des souris 21-24. Le procédé utilise une souche zebrafish transparente qui a son endothélium marqué par un fluo des récifs coralliens verterescent rapporteur de la protéine entraînée par le promoteur kdrl, le récepteur du poisson zèbre pour endothélial vasculaire facteur de croissance 25. Dans le dosage, les cellules cancéreuses sont marquées avec un marqueur fluorescent rouge et injecté dans le sinus précardiaque de 2 jours embryons âgés. Environ entre 48-96 heures après l&#39;injection, les cellules cancéreuses qui ont envahi par les vaisseaux sanguins et dans la région caudale d&#39;embryons peuvent être marqués de manière efficace sur un microscope à fluorescence. Ici, nous appliquons la technique à un groupe de lignes couramment utilisées cellulaires du cancer du sein humain pour démontrer des différences marquées dans leur capacité invasive vasculaire. De plus, nous démontrons que la modification du site d&#39;injection dans le sac vitellin d&#39;embryons permet l&#39;étude des interactions cellulaires hétérogènes, comme des populations de cellules cancéreuses peuvent être marqués de façon différentielle avec des colorants fluorescents et injectés dans des embryons de poisson zèbre dépourvus de système vasculaire fluorescent. Dans ce dernier essai, les cellules cancéreuses qui ont envahi le jaune d&#39;oeuf et dans le intravasated vasculature sont marqués dans la région caudale 24-48 h après l&#39;injection. En raison de l&#39;efficacité et de commodité de ce modèle, les poissons zèbres sont de plus en plus utilisé pour tester rapidement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses sous un paramètre physiologique.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Plats de 100 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes jetables 5 3/4" Pastur, verre borosilicaté</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Plat de 60 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, à faible point de fusion</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, qualité moléculaire</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Verre capillaire, standard, 1,2 mm x 0,68 mm, 4"</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Extracteur de pipette vertical Hofstra</td><td>Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Pot de stockage d’électrodes, 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonate sel (Tricaïne, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Brosse à cils</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, chaleur inactivée</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipettes de transfert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Chargement Pipette</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Plats à fond en verre (12,0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Lame de dépression en verre</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Sel de mer instantané</td>, sel de mer <td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Ampoules en caoutchouc latex, 2 ml, paquet de 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Microscope confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de Pétri, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&nbsp ; </td><td></td>FB0875713</tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&nbsp ;</td><td>Les</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lignées cellulaires ont été maintenues en DMEM + 10 % FBS, avec l’attente de cellules BT-474 et HCC18-6, qui ont été maintenues en RPMI + 10 % FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans zebrafish (<em&gt; danio rerio</em&gt;)

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

L’invasion vasculaire et l’extravasation des cellules cancéreuses sont une caractéristique de la progression métastatique. Les modèles in vitro traditionnels d’invasion cellulaire cancéreuse de l’endothélium n’ont généralement pas la dynamique des fluides à laquelle les cellules envahissantes sont autrement exposées in vivo. Cependant, les systèmes in vivo tels que les modèles murins, bien que plus pertinents sur le plan physiologique, nécessitent des échelles de temps expérimentales plus longues et présentent des défis uniques associés à la surveillance et à l’analyse des données. Nous décrivons ici un test de poisson-zèbre qui cherche à combler cette lacune technique en permettant l’évaluation rapide de l’invasion vasculaire et de l’extravasation des cellules cancéreuses. L’approche consiste à injecter des cellules cancéreuses fluorescentes dans le sinus précardiaque d’embryons transparents de poisson-zèbre âgés de 2 jours dont le système vasculaire est marqué par un rapporteur fluorescent contrasté. Après l’injection, les cellules cancéreuses doivent survivre en circulation et s’extravaser ensuite des vaisseaux vers les tissus de la région caudale de l’embryon. Les cellules cancéreuses extravasées sont efficacement identifiées et notées dans les embryons vivants via l’imagerie par fluorescence à un moment précis. Cette technique peut être modifiée pour étudier l’intravasation et/ou la compétition entre un mélange hétérogène de cellules cancéreuses en changeant le site d’injection en sac vitellin. Ensemble, ces méthodes peuvent évaluer un comportement caractéristique des cellules cancéreuses et aider à découvrir des mécanismes indiquant une progression maligne vers le phénotype métastatique.

Ici nous avons testé la capacité invasive vasculaire des lignées cellulaires de cancer du sein couramment utilisés dans un modèle d&#39;embryon de poisson zèbre (figure 1). critères rigoureux ont été utilisés dans la notation extravasation pour ces différentes lignées cellulaires, où les événements positifs ont été seulement comptés si les cellules cancéreuses avaient clairement extravasation, cet être fait surtout de limiter les faux positifs qui pourraient découler de ...

Cette méthode utilise des embryons de poisson zèbre pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses. les cellules cancéreuses fluorescentes sont injectées dans le sinus précardiaque ou de sac vitellin d&#39;embryons en développement. cellule cancéreuse invasion vasculaire et une extravasation est évaluée par microscopie de fluorescence de la région de la queue 24-96 heures plus tard.

Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le comportement malin et invasif des cellules cancéreuses dans un modèle d’embryon de poisson-zèbre. Cette méthode aide les chercheurs à déterminer si les cellules cancéreuses peuvent envahir un système circulatoire fonctionnel, modélisant ainsi une étape clé de la cascade métastatique. Le principal avantage de cette technique est que le modèle d’embryon de poisson-zèbre fournit cette évaluation et un délai d’exécution plus court que des expériences similaires souvent menées sur des souris.Le docteur Eric Glasgow, qui dirige l’installation centrale de poisson-zèbre à l’Université de Georgetown, fera la démonstration de la procédure. Après avoir préparé les cellules cancéreuses, les réactifs et les embryons de poisson-zèbre selon le protocole de texte, fixez le système de distribution de micro-injection à une source d’air sous pression et allumez la source d’alimentation. Testez la pression en appuyant sur la pédale.Une brève impulsion d’air doit être émise par le porte-aiguille. Ajoutez 20 millilitres de solution de tricaïne 2X dans une plaque d’injection et placez la plaque sur un agitateur pour l’équilibrer. Répétez ensuite l’équ

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zPDX-Analyse de l’invasivité : étude du comportement invasif des cellules cancéreuses métastatiques dans les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre

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Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

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In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts In Vivo

Les modèles de xénogreffe de poisson zèbre permettent le dépistage des médicaments à haut débit et l’imagerie fluorescente des cellules cancéreuses humaines dans un microenvironnement in vivo. Nous avons mis au point un flux de travail pour le dépistage automatisé à grande échelle des médicaments sur des échantillons de leucémie dérivés du patient chez le poisson zèbre à l’aide d’une unité d’imagerie automatisée équipée d’un microscope à fluorescence.

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Décrit ici est une méthode pour utiliser des embryons de poisson zèbre pour étudier la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à cibler les cellules cancéreuses humaines in vivo. Cette méthode permet l’évaluation et la sélection de nanoparticules optimales pour les futurs essais chez les grands animaux et dans les essais cliniques.

In Vivo Ciblage des cellules cancéreuses humaines xénograftées avec des nanoparticules de silice fluorescente fonctionnelles chez le poisson zèbre

Ici, nous fournissons un protocole étape par étape, avec des conseils pour générer des xénogreffes et des directives pour l’analyse du comportement tumoral, l’immunofluorescence de montage entier et la quantification de l’imagerie confocale.

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Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour la génération et le dépannage de xénogreffes de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) humaine à partir de lignées cellulaires et de matériel de patient frais dans des embryons de poisson-zèbre immunodéprimés transitoirement, ainsi que des directives pour l’évaluation de la réponse médicamenteuse à l’aide de la cytométrie en flux. Le pipeline expérimental peut également être adapté aux tumeurs solides.

Prédiction rapide de la réponse médicamenteuse in vivo à l’aide de greffes de cellules leucémiques dans des embryons de poisson-zèbre

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Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (

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