Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer le comportement malin et invasif des cellules cancéreuses dans un modèle d’embryon de poisson-zèbre. Cette méthode aide les chercheurs à déterminer si les cellules cancéreuses peuvent envahir un système circulatoire fonctionnel, modélisant ainsi une étape clé de la cascade métastatique. Le principal avantage de cette technique est que le modèle d’embryon de poisson-zèbre fournit cette évaluation et un délai d’exécution plus court que des expériences similaires souvent menées sur des souris.

Le docteur Eric Glasgow, qui dirige l’installation centrale de poisson-zèbre à l’Université de Georgetown, fera la démonstration de la procédure. Après avoir préparé les cellules cancéreuses, les réactifs et les embryons de poisson-zèbre selon le protocole de texte, fixez le système de distribution de micro-injection à une source d’air sous pression et allumez la source d’alimentation. Testez la pression en appuyant sur la pédale.

Une brève impulsion d’air doit être émise par le porte-aiguille. Ajoutez 20 millilitres de solution de tricaïne 2X dans une plaque d’injection et placez la plaque sur un agitateur pour l’équilibrer. Répétez ensuite l’équilibrage avec une deuxième aliquote de Tricaïne 2X.

Ensuite, utilisez une pipette en plastique pour transférer un groupe d’embryons dans une petite boîte contenant une solution de tricaïne 2X. À l’aide d’un embout de chargement de gel, remplissez l’aiguille de micro-injection avec des cellules cancéreuses. Placez l’aiguille dans un bocal de stockage d’électrodes avec l’extrémité pointue vers le bas afin que les cellules se déposent près de la pointe.

Transférez 20 à 30 embryons anesthésiés dans une plaque d’injection en recueillant des embryons avec beaucoup de tricaïne 2X dans une pipette en plastique. Laissez les embryons se fixer sur l’extrémité de la pipette, puis expulsez doucement les embryons dans l’auge de la plaque d’injection, en répartissant les embryons sur toute la longueur de l’auge. Alignez les embryons avec la tête vers le haut et le ventre face à la paroi raide de l’auge.

Fixez l’aiguille au porte-aiguille du micromanipulateur. Ensuite, positionnez la plaque d’injection sous le stéréoscope avec la paroi à 60 degrés vers la gauche et concentrez-vous sur l’embryon supérieur à un grossissement de 25X. Positionnez le micromanipulateur de manière à ce que, lorsqu’elle est déployée, l’aiguille perce l’embryon.

Étendez ensuite l’aiguille à l’œil jusqu’à ce qu’elle touche presque l’embryon. Maintenant, tout en regardant au microscope, alignez l’aiguille contre l’embryon. Pour injecter les cellules, percez l’auge de l’embryon à travers le sac vitellin.

Appuyez sur la pédale en plaçant l’extrémité juste au-dessus, mais pas dans, le sinus précardiaque. La force de l’injection expulsera les cellules dans le sinus cardiaque. Alternativement, l’injection de cellules dans le sac vitellin permet d’étudier différentes facettes de l’invasion vasculaire comme décrit dans le manuscrit.

À l’aide de la main droite, étendez et rétractez l’aiguille d’injection. Avec la main gauche, faites des ajustements fins pour positionner l’embryon suivant. Lorsque toute la plaque est injectée, remettez l’aiguille dans le bocal de stockage des électrodes.

Pour transférer les embryons dans la boîte de récupération, inclinez la plaque d’injection pour tirer les embryons vers le bas, en lavant tous les embryons de l’auge et en utilisant la pipette en plastique pour les recueillir. Laissez les embryons se déposer au fond de la pipette, puis transférez-les dans la boîte de récupération avec une quantité minimale de tricaïne. Incuber la boîte de récupération à 28 degrés Celsius pendant une heure, avant de séparer les embryons viables des embryons morts et des débris.

Incuber le plat à 33 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être marqué. Après avoir anesthésié un lot d’embryons à noter, selon le protocole textuel, placez une larve anesthésiée sur une lame de microscope de dépression dans une goutte de Tricaïne. Orientez les larves latéralement pour une imagerie optimale de la région caudale.

Placez la lame sur un microscope à fluorescence composée avec un objectif 10X. Marquez les larves en comptant le nombre de cellules cancéreuses qui ont réussi à envahir le système vasculaire en se concentrant de haut en bas dans la région de la queue pour discerner clairement les cellules intactes. Faites fondre une solution de tricaïne d’agarose à 1,5 % et portez-la à 37 degrés Celsius.

Après avoir anesthésié les embryons comme auparavant, transférez un embryon dans une goutte de solution de tricaïne sur la surface d’imagerie. À l’aide d’une pipette en verre, retirez l’excès de solution de tricaïne, en retenant l’embryon sur la surface d’imagerie. Ensuite, superposez une goutte de solution d’agarose fondue sur l’embryon.

En travaillant rapidement, avant que l’agarose ne polymérise, utilisez un outil délicat comme une brosse à cils pour orienter l’embryon latéralement pour l’imagerie, en prenant soin de vous assurer que l’embryon est aplati le long de la surface d’imagerie. Lorsque la goutte d’agarose s’est polymérisée, plongez-la dans une solution de tricaïne. Enfin, soumettez l’embryon de poisson-zèbre vivant à une imagerie microscopique.

Sur les sept lignées cellulaires de cancer du sein testées pour leur capacité vasculaire invasive chez les embryons de poisson-zèbre, la lignée cellulaire MDA-MB-231 a présenté le plus grand nombre de cellules cancéreuses extravasées par embryon lorsqu’elle a été évaluée, 96 heures après l’injection. Il a également été observé que les cellules BT-474 envahissaient facilement la région caudale des embryons tandis que d’autres lignées cellulaires telles que les cellules MCF-7, SK-BR-3 et T-47D étaient peu invasives. Dans un asay modifié qui utilise un site d’injection différent, une expérience de compétition a été réalisée où deux populations de cellules MDA-MB-231, qui diffèrent par leur capacité vasculaire invasive, ont été injectées simultanément dans le sac vitellin d’embryons en développement.

Après l’évaluation, il a été déterminé que les cellules MDA-MB-231 propagées dans des conditions de culture confluentes avant l’injection, présentaient une réduction de l’intravasation dans la circulation et, par conséquent, une présence réduite dans la région caudale des embryons. Une fois maîtrisées, les injections d’embryons de poisson-zèbre peuvent être effectuées en quatre heures si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des critères rigoureux et cohérents lors de l’évaluation de l’extravasation des cellules cancéreuses.

À la suite de cette procédure, les résultats peuvent être validés dans un modèle murin. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer les injections et de marquer l’extravasation, ce qui vous permettra de tester la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans les embryons de poisson-zèbre.