Name: In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Découvrez la différenciation de cellules iTregs FOXP3+ à partir de cellules T CD4+ naïves humaines en utilisant un protocole contenant du TGF-β. Cette méthode permet la génération reproductible et le phénotypage des cellules régulatrices pour l'étude de l'immunologie.

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Nina Nagel est vivement remerciée pour son assistance technique pendant le tournage de la vidéo et la préparation expérimentale. Nous remercions Eva-Maria Weiss pour son aide avec le protocole de coloration intracellulaire FOXP3 et Elisabeth Suri-Payer et Nina Oberle pour l’établissement du protocole d’isolement nTreg. Matilda Eriksson et Peri Noori sont récompensées pour la direction du laboratoire. 
Financement : A.S. a été soutenu par une bourse intra-européenne Marie Curie dans le cadre du 7e programme-cadre de la Communauté européenne, la Fondation Dr. Åke Olsson et les fondations de recherche KI ; A.S. et J.T. ont été soutenus par une subvention CERIC (Centre d’excellence pour la recherche sur l’inflammation et les maladies cardiovasculaires), J.T. a été soutenu par Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Fondation Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance et le conseil départemental de Stockholm.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit permet l&#39;induction robuste de CD4 humaine + FOXP3 + iTregs de cellules naïves humaines T CD4 +. Elle comprend un nouveau protocole que nous avons récemment décrit, en utilisant une combinaison de TGF-β, l&#39; ATRA et de la rapamycine, pour l&#39; induction de iTregs in vitro avec fonction supérieure de suppression 22. Par rapport aux autres protocoles publiés, un autre avantage réside dans l&#39;induction de diverses populations iTreg en parallèle par différents pr...

Des cellules T régulatrices CD4 + CD25 + FOXP3 + (Treg) suppriment d&#39; autres cellules immunitaires et sont des médiateurs essentiels de la tolérance périphérique, la prévention de l&#39; auto - immunité et l&#39; inflammation excessive 1. L&#39;importance de Tregs est illustré par la maladie humaine syndrome immunodysregulation polyendocrinopathie entéropathie liée à l&#39;X (IPEX), dans laquelle la perte de Tregs due à des mutations dans le `master&#39; Treg facteur de transcription forkhead box P3 (FOXP3) conduit à une maladie auto-immune systémique sévère, létale à un âge précoce. Cependant, Tregs agir comme une épée à double tranchant dans le système immunitaire , car ils peuvent aussi nuire à l&#39; immunité anti-tumorale dans certains paramètres 2. manipulation thérapeutique du nombre et de la fonction Treg est donc soumis à de nombreuses investigations cliniques. Dans le cancer, l&#39; épuisement des Tregs peut être souhaitable et un certain succès des approches cliniques encourage la poursuite de la recherche 3. Dans les maladies auto-immunes et inflammatoires, en plus des effets thérapeutiques des Treg à plusiedes modèles de maladies de la souris relles, récents essais en homme de transfert Treg adoptive pour prévenir la maladie du greffon contre -host (GvHD) 4-7 et d&#39;évaluer la sécurité dans le traitement du diabète de type 1 8 a montré des résultats très prometteurs. D&#39; origine naturelle Tregs (nTregs) comprennent tTregs thymiques dérivées et pTregs périphériquement induites, avec des fonctions essentielles non redondantes dans le maintien de la santé 9 - 11. Cependant, les numéros nTreg sont limitées, en encourageant l&#39;approche complémentaire induisant Treg (iTregs) in vitro à partir de précurseurs naïfs des lymphocytes T 12. La stabilité morte de iTregs, probablement en raison d&#39; un manque de déméthylation dans ce qu&#39;on appelle la région déméthylé Treg spécifique (TSDR) dans le locus du gène FOXP3 13, reste une préoccupation et plusieurs études indiquent que in vivo induite par Tregs sont plus stables 14. À ce jour, FOXP3 reste la meilleure protéine marker pour Tregs mais il est absolument pas spécifique parce que les cellules conventionnelles humaines CD4 + CD25 T expriment transitoirement des niveaux intermédiaires de FOXP3 lors de l&#39; activation 15,16. Bien que des progrès significatifs ont été accomplis dans l&#39;élucidation de la régulation de l&#39;expression FOXP3, il reste encore beaucoup à découvrir en ce qui concerne l&#39;induction, la stabilité et la fonction de FOXP3 en particulier dans les cellules humaines. En dépit des différences à nTregs, in vitro induite FOXP3 + cellules T CD4 + peuvent être utilisés comme un système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de FOXP3 induction et comme un point de départ pour élaborer des protocoles à l&#39;avenir qui permettent de génération de iTregs qui sont plus semblables à vivo généré Tregs, qui pourrait être applicable pour les stratégies de transfert adoptif à l&#39;avenir. Il n&#39;y a pas `protocole standard&#39; d&#39;or pour induire iTregs humains, et les protocoles actuels ont été développés sur la base de conditions mimant Treg induisant in vivo: l&#39; interleukine 2 (IL-2) Et la transformation β du facteur de croissance (TGF-β) de signalisation sont cruciaux pour FOXP3 induction in vivo 17, et tout-trans de l&#39; acide rétinoïque (ATRA) - qui est produit in vivo par les cellules dendritiques associés à l&#39; intestin - est fréquemment utilisé pour améliorer FOXP3 induction in vitro 18-21. Nous avons développé des protocoles humains supplémentaires Treg induisant en utilisant butyrate 22, un acide gras à chaîne courte microbiote intestinal dérivé qui a été récemment montré pour augmenter murin Treg induction 23,24. Récemment , nous avons établi un nouveau protocole pour la production de iTregs ayant une fonction suppressive supérieure in vitro en utilisant une combinaison de TGF-β, l&#39; ATRA et la rapamycine 22, cette dernière étant une cible mammalienne cliniquement approuvé de la rapamycine (mTOR) , un inhibiteur qui est connu pour promouvoir entretien FOXP3 lors de l&#39; expansion humaine Treg 25,26. Cette méthode décrit le reproductiblela génération in vitro de cellules CD4 + humaines FOXP3 + iTregs en utilisant un ensemble de conditions différentes, ainsi que leur phénotypage ultérieure par cytométrie en flux et la réaction inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) pour révéler les profils d&#39;expression de FOXP3 et d&#39; autres signatures des molécules Treg telles spécifiques au protocole comme CD25, CTLA-4, EOS, ainsi que la répression de l&#39; IFN-γ et l&#39; expression SATB1 22. Les populations cellulaires générées peuvent être utilisées pour des analyses fonctionnelles relatives à l&#39;activité suppressive ou pour des études moléculaires, que ce soit en ce qui concerne les régulateurs généraux FOXP3 ou pour étudier les effets spécifiques à certains composés tels que le butyrate ou la rapamycine. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de conduite différenciation Treg est très pertinente pour les futures approches thérapeutiques de l&#39;auto-immunité ou d&#39;un cancer de cibler spécifiquement les molécules impliquées dans la production et la fonction Treg.

<table><tbody><tr><td>Acide rétinoïque tout-trans</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>anit-humain Foxp3-APC clone 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>microbilles CD25 anti-humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>CD25-PE anti-humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anticorps CD28 anti-humain, LEAF Purified&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD3 humain, LEAF Purified&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA anti-humain, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>CD45RO PE clone UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>clone CD4-PerCP SK3 ; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CTLA-4 anti-humain (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Violet brillant 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>IFN-g FITC clone 4S. B3 ; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution contenant de la Brefeldin A : GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>kit de synthèse d’ADNc : SuperScript VILO (transcriptase inverse) Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Densité de centrifugation : Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Inactivé thermiquement</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Teinture de viabilité fixable, eFluor 780&nbsp ; &nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 ou 65-0865-18&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Attention : contient du paraformaldéhyde. Peut également être acheté en kit combiné avec anticorps ; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone : 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr> Human <tr><td>Naïve CD4 T cell isolation kit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin de Streptomyces conglobatus >98 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>souris IgG1 K Contrôle d’isotype APC Clone : P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr> souris <tr><td>IgG1 K Contrôle d’isotype FITC 50 &#956 ; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>contrôle de l’isotype IgG2a de la souris, violet brillant 421, clone MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en plastique, emballée individuellement</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-myristate 13-acétate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycine</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humaine recombinante, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>TGF-bêta humain recombinant 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement de l’ARN : RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Butyrate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture de cellules T : milieu X-Vivo 15, avec gentamicine + phénolred</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Test, FOXP3 (meilleure couverture)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182 ; ID du test : Hs01085834_m1</td><td>Attention : contient du paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Test, RPL13A (meilleure couverture)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370 ; ID du test : Hs04194366_g1&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Attention : contient du paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human cd4 + foxp3 cellules + induced t régulatrices (de itregs) de naïf cellules t cd4 + en utilisant un protocole tgf-β contenant

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) font partie intégrante de la tolérance périphérique, supprimant les réactions immunitaires contre les auto-structures et prévenant ainsi les maladies auto-immunes. Des approches cliniques visant à transférer adoptivement les Tregs, ou à épuiser les Tregs dans le cancer, sont en cours et donnent des premiers résultats prometteurs. 
Étant donné que le nombre de Tregs naturels (nTregs) est très limité, il peut être avantageux d’étudier certaines caractéristiques des Tregs à l’aide de Tregs induits in vitro (iTregs). À ce jour, le meilleur marqueur protéique, bien qu’il ne soit pas absolument spécifique, pour délimiter les Tregs est le facteur de transcription FOXP3. Malgré l’importance des Tregs, y compris les rôles non redondants des Tregs induits de manière périphérique, les protocoles de génération d’iTregs sont actuellement controversés, en particulier pour les cellules humaines. Ce protocole décrit donc la différenciation in vitro des iTregs CD4+FOXP3+ humains à partir de lymphocytes T naïfs humains à l’aide d’une gamme de facteurs inducteurs de Treg (TGF-β plus IL-2 uniquement, ou leur combinaison avec de l’acide rétinoïque, de la rapamycine ou du butyrate) en parallèle. Il décrit également le phénotypage de ces cellules par cytométrie en flux et qRT-PCR. 
Ces protocoles aboutissent à l’expression reproductible de FOXP3 et d’autres gènes de signature Treg et permettent l’étude des mécanismes généraux de régulation de FOXP3 ainsi que des effets spécifiques au protocole pour délimiter l’impact de certains facteurs. Les iTregs peuvent être utilisés pour étudier divers aspects phénotypiques ainsi que les mécanismes moléculaires de l’induction des Tregs. Les études moléculaires détaillées sont facilitées par le nombre relativement important de cellules qui peuvent être obtenues. 
Une limitation de l’application des iTregs est l’instabilité relative de l’expression de FOXP3 dans ces cellules par rapport aux nTregs. Les iTregs générés par ces protocoles peuvent également être utilisés pour des tests fonctionnels tels que l’étude de leur fonction suppressive, dans lesquels les iTregs induits par le TGF-β plus l’acide rétinoïque et la rapamycine présentent une activité suppressive supérieure. Cependant, la capacité de suppression des iTregs peut différer de celle des nTregs et l’utilisation de contrôles appropriés est cruciale.

La figure 1 montre un schéma du dispositif expérimental. La figure 2 montre une coloration de contrôle de pureté représentant pour les cellules T CD4 + naïves magnétiquement isolées et nTregs. F igure 3A montre la cytométrie en flux stratégie de déclenchement et la figure 3B montre FOXP3 et CD25 représentant de cytométrie de flux Colorations le jour...

Ce protocole décrit la génération reproductible et phénotypage des cellules T régulatrices humaines induites (les iTregs) à partir de cellules T CD4 + naïves in vitro. Différents protocoles pour FOXP3 induction permettent l&#39;étude des phénotypes iTreg spécifiques obtenus avec les protocoles respectifs.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Les objectifs généraux de cette expérience sont d’induire des lymphocytes T régulateurs humains positifs à FOXP3 à partir de lymphocytes T CD4 naïfs in vitro, et d’analyser leur phénotype. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des lymphocytes T, telles que comment la différenciation régulatrice des lymphocytes T se produit-elle au niveau moléculaire ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la génération et le phénotypage reproductibles de cellules T régulatrices humaines positives à FOXP3.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la différenciation régulatrice des lymphocytes T, elle peut également être modifiée pour étudier d’autres sous-ensembles de lymphocytes T CD4 et d’autres cellules immunitaires d’intérêt. La démonstration visuelle de cette méthode est cruciale car les étapes d’isolation PBMC et de bits magnétiques sont faciles à comprendre lorsqu’elles sont montrées plutôt que décrites. Pour isoler les lymphocytes T du sang périphérique, commencez par ajouter 15 millilitres de milieu de gradient de densité de température ambiante dans cinq tubes de 50 millilitres par couche leucocytair

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