Name: La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez la méthode ChIP-exo pour identifier les interactions protéine-ADN avec une résolution proche du nucléotide. Cette technique combine immunoprécipitation, exonucléase et séquençage haut débit.

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Nous remercions le laboratoire Venters et les membres du département de physiologie moléculaire et de biophysique pour les discussions utiles. Un merci spécial à Frank Pugh pour ses conseils, son mentorat et ses nombreuses discussions perspicaces sur les nuances de ChIP-exo alors que j’étais boursier postdoctoral dans son laboratoire.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Nous présentons un protocole de génomique fonctionnelle pour déterminer l&#39;emplacement de liaison précise pour chromatine protéines interagissant dans, d&#39;une manière pangénomique impartiale à proximité de la résolution de paires de bases. L&#39;étape la plus critique pour atteindre base près de la résolution de mappage de la paire est un traitement par une exonucléase de l&#39;ADN ChIP enrichi tandis que le reste immunoprécipité sur la résine magnétique. Ostensiblement, des complexes de protéines pourraient...

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour étudier les mécanismes de régulation des gènes en enrichissant sélectivement des fragments d&#39;ADN qui interagissent avec une protéine donnée dans les cellules vivantes. Méthodes de fragments d&#39;ADN ChIP enrichi de détection ont évolué comme la technologie améliore, de la détection d&#39;un seul locus (standard ChIP-qPCR) pour hybridation sur microréseaux d&#39;oligonucléotides (ChIP-chip) à séquençage à haut débit (ChIP-seq) 1. Bien que ChIP-seq a vu une large application, l&#39;hétérogénéité de la chromatine et les interactions d&#39;ADN non spécifiques ont entravé la qualité des données conduisant à des faux positifs et la cartographie imprécise. Pour contourner ces limitations, le Dr Frank Pugh a développé la méthode ChIP-exo 2. Le trait saillant de ChIP-exo est qu&#39;il intègre un 5 &#39;à 3&#39; exonucléase, Footprinting efficacement des emplacements de liaison du facteur de transcription. Par conséquent, la méthode ChIP-exo obtient une résolution plus élevée, une plus grande plage dynamique de detection, et le bruit de fond inférieur. Bien que ChIP-exo est techniquement plus difficile à maîtriser que ChIP-seq, il est largement adopté comme études visent à mieux comprendre à haute résolution ultra uniques en utilisant des systèmes biologiques divers 3-8. En effet, ChIP-exo a été appliquée avec succès à des bactéries, des levures, la souris, le rat et les systèmes cellulaires humains. Comme preuve de principe, ChIP-exo a été initialement utilisé pour identifier le motif de liaison précis pour une poignée de facteurs de transcription de levure 2. La technique a également été utilisée dans la levure pour étudier l&#39;organisation du complexe de pré-initiation de transcription, et à déchiffrer la structure subnucleosomal de diverses histones 9,10. Plus récemment, nous avons tiré parti ChIP-exo pour résoudre TFIIB adjacente et Pol II événements à des promoteurs humains de liaison, et montré que la transcription divergente répandue découle de complexes d&#39; initiation distincts 11. Le flux de travail présenté ici est optimisé et streamlined pour les mammifères ChIP-exo (Figure 1). Tout d&#39; abord, les cellules vivantes de cultures primaires ou de tissus sont traités avec du formaldéhyde pour préserver dans les interactions protéine-ADN in vivo grâce à une réticulation covalente. Les cellules sont lysées et la chromatine cisaillées à environ 100 - 500 paires de bases de fragments de taille. ChIP puis enrichit sélectivement des fragments d&#39;ADN réticulés à la protéine d&#39;intérêt. A ce stade, les bibliothèques de copeau suivants sont préparés typiquement, ce qui limite inhérente à la résolution de détection de la taille moyenne des fragments de quelques centaines de paires de bases. Cependant, ChIP-exo surmonte cette limitation en coupant le droit 5 frontières &#39;ADN du site de réticulation de protéine-ADN avec lambda exonucléase et gauche. bibliothèques de séquençage sont ensuite construits à partir de exonucléase ADN digéré comme détaillé ci-dessous. Les frontières imbriquées 5 &#39;résultantes représentent une empreinte in vivo de l&#39;interaction protéine-ADN (figure 1, étape 14), et sont détectées par séquençage à haut débit. Although la méthodologie ChIP-exo est plus impliqué que ChIP-seq, les transitions entre la plupart des étapes nécessite le lavage des billes simple, qui minimise la perte d&#39;échantillonnage et de la variabilité expérimentale. Il est important, puisque ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq, tout échantillon qui a du succès avec ChIP-seq devrait également avoir du succès avec ChIP-exo. L&#39;empreinte des interactions protéine-ADN avec des résultats ChIP-exo dans une structure de données fondamentalement distinctes de ChIP-seq in vivo. Bien que les appelants ChIP-seq communs peuvent être appliquées à des données ChIP-exo, pour obtenir des appels de pointe les plus précis, nous recommandons des outils bioinformatiques spécifiquement conçus avec la structure unique de données ChIP-exo à l&#39;esprit. Ceux - ci comprennent Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla et ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37 % formaldéhyde, sans méthanol, 10 ampoules de 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Section 3</td></tr><tr><td>Cocktail complet d’inhibiteurs de protéase (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Sections 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Section 5</td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Section 5</td></tr><tr><td>Protéines MagSepharose G Xtra billes</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Section 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Rack magnétique latéral</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Sections 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Sections 7, 22</td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Section 9</td></tr><tr><td>ADN polymérase I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Section 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Tampon de réaction 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Sections 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixeur C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Sections 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Sections 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Sections 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>Polynucléotide Kinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Sections 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Sections 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Sections 10, 20</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase&nbsp ;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Sections 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi ;-29 ADN polymérase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Sections 12, 19</td></tr><tr><td>10x &phi ;-29 Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Sections 12, 19</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Section</td></tr><tr><td>14 10x Tampon Lambda</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Section 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonucléase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Section 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Section 16</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Section 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Section 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (nettoyage) billes&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Section 22</td></tr><tr><td>Q5 Démarrage à chaud ADN polymérase&nbsp ;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Section 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Section 25</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Optical Clear Qubit Tubes&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Section 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de dosage haute sensibilité</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Section 26</td></tr></tbody></table>

la méthode chip-exo: identification de protéine-adn interactions avec les environs de base paire de précision

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil indispensable dans les domaines de l&#39;épigénétique et la régulation des gènes qui isole les interactions spécifiques protéine-ADN. ChIP couplé à un séquençage à haut débit (ChIP-seq) est couramment utilisé pour déterminer la localisation génomique des protéines qui interagissent avec la chromatine. Cependant, ChIP-seq est entravée par résolution relativement faible de la cartographie de plusieurs centaines de paires de bases et le signal de fond élevé. La méthode ChIP-exo est une version raffinée de ChIP-seq qui améliore sensiblement à la fois la résolution et le bruit. La distinction clé de la méthodologie ChIP-exo est l&#39;incorporation de lambda exonucléase digestion dans le flux de travail de préparation de la bibliothèque Footprint efficacement la gauche et droite 5 frontières &#39;ADN du site de réticulation de protéine-ADN. Les bibliothèques de copeau exo sont ensuite soumis à un séquençage à haut débit. Les données obtenues peuvent être mis à profit pour fournir des aperçus uniques et ultra-haute résolution dans l&#39;organisation fonctionnelle of génome. Ici, nous décrivons la méthode ChIP-exo que nous avons optimisé et rationalisé pour les systèmes de mammifères et de prochaine génération plate-forme de séquençage par synthèse.

Les figures suivantes illustrent des résultats représentatifs du protocole ChIP-exo présenté ici. Contrairement aux méthodes ChIP-seq traditionnels avec quelques étapes enzymatiques, ChIP-exo nécessite onze réactions enzymatiques séquentiellement dépendantes (Figure 1). Ainsi, il faut prendre soin à chaque étape pour faire en sorte que chaque composant de réaction est ajouté à son maître de mélange réactionnel respectif. Nous vous recommandons de générer une feuille de c...

Ici, nous présentons un protocole permettant d’obtenir une résolution proche de la paire de bases des interactions protéine-ADN. Ceci est obtenu par un traitement à l’exonucléase de fragments d’ADN enrichis sélectivement par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-exo) suivi d’un séquençage à haut débit.

La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

L’objectif global de cette technologie de génomique fonctionnelle est d’identifier les emplacements génomiques précis qu’une protéine donnée occupe dans les cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la régulation des gènes et de l’épigénétique, telles que la façon dont la machinerie de transcription s’assemble et fonctionne dans le contexte de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle révèle l’emplacement génomique exact des interactions entre l’ADN des protéines à une prérésolution proche de la base avec un bruit de fond exceptionnellement bas.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le protocole est complexe et nécessite une attention particulière aux détails. Pour soniser les lysats nucléaires, commencez par placer des adaptateurs de résine dans des tubes de polystyrène de 15 millilitres contenant des extraits nucléaires. Sonicez les lysats dans un bain d’eau glacée à puissance moyenne pendant 30 secondes et 30 secondes pour un total de deux séances de 15 minutes.Pour vérifier les résultats de sonication, transférez deux échantillons de 10 microlitres de chaque tube dans des tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, inversez les réticulations en combinant le premier échantillon de 10 microlitres avec 10 microlitres de TE-RNase A et 0,2 microlitre de protéinase K.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite quatre microlitres de colorant d’ADN xylène 6X.Pour le deuxième échantillon de 10 microlitres, préservez les réticulations en ajoutant deux microlitres de colorant d’ADN xylène 6X. Exécutez les deux échantillons sur un gel d’agarose à 1,5 % à 140 volts pendant environ 30 à 45 minutes jusqu’à ce que le colorant bromophénol de ce dernier soit aux trois quarts du gel. Si la sonication a réussi, transférez les lysats soniqués dans deux tubes d’un millilitre contenant 150 microlitres de Triton X-100 à 10 % et un vortex à mélanger.Granulez la chromatine insoluble et les débris en faisant tourner les lysats soniqués à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite les surnageants dans de nouveaux tubes de deux millilitres. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius indéfiniment.Pour chaque réaction d’immunoprécipitation de la chromatine ou de ChIP, combinez 1,5 millilitre d’extraits soniqués avec des conjugués de billes d’anticorps dans des tubes de 1,5 millilitre. Incuber les tubes sur un mini rotateur de tubes à une vitesse de neuf à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Vérifiez après quelques minutes pour vous assurer que les échantillons ne fuient pas et qu’ils se mélangent correctement.Le lendemain, faites tourner très brièvement les tubes pour recueillir le liquide dans les bouchons et placez les tubes sur une grille magnétique pendant une minute. Aspirez ensuite l’extrait. Ajoutez 0,75 millilitre de tampon RIPA dans chaque tube.Retirez ensuite les tubes de la grille magnétique et retournez-les plusieurs fois pour les mélanger. Après un bref essorage, replacez les tubes sur l’aimant et aspirez le surnageant. Après le dernier lavage, ajoutez 0,75 millilitre de Tris HCL de 10 millimolaires dans chaque tube.Retirez les tubes du support magnétique et retournez les échantillons plusieurs fois pour les mélanger. Après un bref essorage, replacez les tubes sur la grille et aspirez le surnageant. Après avoir effectué les réactions de polissage et de détail selon le protocole de texte, remplissez les calculs de mélange principal de ligature.Préparez ensuite le mélange de ligature dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace et pipetez pour mélanger la solution. Avec les tubes d’échantillon sur le support magnétique, ajoutez 48 microlitres de mélange maître de ligature P7 et deux microlitres d’un indice d’adaptateur différent à chacune des résines d’échantillon. Incuber les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 25 degrés Celsius pendant deux heures.Après avoir lavé les échantillons et effectué la réparation de l’entaille Phy 29 et les réactions kinases conformément au protocole de texte, remplissez les calculs du mélange maître d’exonucléase lambda et effectuez le mélange d’exonucléase lambda dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres de mélange d’exonucléases lambda à chaque échantillon de résine tout en restant sur le support magnétique. Ensuite, incubez les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après avoir aspiré le dernier lavage comme décrit dans le protocole de texte, effectuez la réaction nucléase RecJf en remplissant les calculs du mélange principal RecJf et en faisant le mélange RecJf sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres du mélange RecJf à chaque échantillon de résine sur le support magnétique. Ensuite, incubez les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après avoir aspiré le dernier lavage, préparez le tampon d’élution ChIP et le master mix de protéinase K et ajoutez 200 microlitres de la solution à chaque échantillon de résine. Incuber les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 65 degrés Celsius pendant la nuit avec un couvercle chauffant pour éviter la condensation. Le lendemain, faites tourner brièvement les échantillons et placez les tubes sur le support magnétique pendant une minute.Transférez ensuite 200 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de tampon TE. Après l’extraction de l’ADN, l’extension primaire P7 et les réactions ATL, remplissez les calculs du master mix de la table de ligature de l’adaptateur P5 et faites le master mix de ligature sur de la glace. Ajoutez 20 microlitres de mélange de ligature à chaque échantillon et pipetez pour mélanger.Ensuite, incubez les échantillons dans un thermocycleur à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Effectuer la purification et la quantification de l’ADN selon le protocole textuel. Comme montré ici, il vaut la peine de passer du temps à optimiser les conditions de sonication pour obtenir des extraits de chromatine de haute qualité qui produisent des fragments d’ADN entre 100 et 500 paires de bases.Et le test de déplacement de mobilité électrophorétique est utilisé pour vérifier que les extraits soniqués contiennent des réticulations d’ADN protéique intactes, évidentes comme un super décalage de fragments d’ADN. Pour évaluer le signal de fond, une ChIP simulée est systématiquement réalisée sans anticorps dans la réaction. Une exo-banque ChIP de haute qualité produira très peu de contexte dans l’échantillon fictif par rapport à une préparation de bibliothèque ChIP-seq.Voici l’évaluation d’une banque ChIP-exo par un bioanalyseur. L’analyse précise garantit la distribution de la taille de la bibliothèque et détecte les dimères d’adaptateur contaminants qui fonctionnent à 125 paires de bases. Ce panel illustre la distribution régulière de cinq premiers N de l’étiquette ChIP-exo séparés par brins pour la polymérase II, le TFIIB et le TBP au niveau du gène RPS12 humain dans les cellules K562 en prolifération.Cette figure montre les modèles moyens de ChIP-exo par rapport aux sites de démarrage transcriptionnel des gènes codant pour les protéines. Les principaux pics de TBP, TFIIB et polymérase II dans le graphique composite reflètent l’organisation génomique des complexes d’initiation de la transcription humaine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régulation des gènes pour explorer les détails moléculaires de la structure subnucléaire en asymétrie chez la levure. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage d’expression de la recherche de RNase peuvent être effectuées pour répondre à des questions telles que l’influence d’un facteur donné sur l’expression d’un gène voisin. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de remplir soigneusement les tables de mixage principales pour toutes les étapes enzymatiques.N’oubliez pas que travailler avec des agents cancérigènes et autres agents caustiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure. Après cette vidéo de visionnage, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’une bibliothèque ChIP-exo de haute qualité.

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Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines sur des régions spécifiques de l’ADN génomique des cellules précurseurs d’oligodendrocytes via l’immunoprécipitation sélective de fragments de chromatine liés aux protéines. Cette méthode permet d’étudier l’interaction de plusieurs protéines régulatrices, y compris les facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes.

Immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les sites de liaison aux protéines cibles sur l’ADN génomique

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Cet article vidéo décrit une méthode de puces à ADN sur la base in vitro afin de déterminer les gènes cibles et des sites de liaison pour deux régulateurs de réponse du système de composants.

ADN purifié par affinité Chip (DAP-puce) Méthode pour déterminer les cibles génétiques pour bactérienne Deux systèmes de réglementation composants

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Cet article présente les étapes essentielles de immunoprecipitation d’immunostaining et de chromatine. Ces protocoles sont couramment utilisés pour étudier les processus cellulaires liés aux dommages à l’ADN et pour visualiser et quantifier le recrutement des protéines impliquées dans la réparation de l’ADN.

Visualisation et quantification des dommages à l’ADN spécifiques au site à base d’endonucléase

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

CUT&amp;RUN et ses variantes peuvent être utilisés pour déterminer l’occupation des protéines sur la chromatine. Ce protocole décrit comment déterminer la localisation des protéines sur la chromatine à l’aide d’uliCUT&amp;RUN unicellulaire.

Localisation du facteur unicellulaire sur la chromatine à l’aide d’un clivage d’entrée ultra-faible sous les cibles et libération à l’aide de la nucléase

Une méthode ChIRP à base d’UV pour identifier les interactions directes entre lncRNA et protéine.

Une méthode chIRP à base d’UV pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncRNA : des cellules cultivées au testicule de souris

Découvrez la méthode ChIP-exo pour identifier les interactions protéine-ADN avec une résolution proche du nucléotide. Cette technique combine immunoprécipitation, exonucléase et séquençage haut débit.

La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

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