La méthode ChIP-exo: Identification de protéine-ADN Interactions avec les environs de Base Paire de précision

L’objectif global de cette technologie de génomique fonctionnelle est d’identifier les emplacements génomiques précis qu’une protéine donnée occupe dans les cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la régulation des gènes et de l’épigénétique, telles que la façon dont la machinerie de transcription s’assemble et fonctionne dans le contexte de la chromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle révèle l’emplacement génomique exact des interactions entre l’ADN des protéines à une prérésolution proche de la base avec un bruit de fond exceptionnellement bas.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le protocole est complexe et nécessite une attention particulière aux détails. Pour soniser les lysats nucléaires, commencez par placer des adaptateurs de résine dans des tubes de polystyrène de 15 millilitres contenant des extraits nucléaires. Sonicez les lysats dans un bain d’eau glacée à puissance moyenne pendant 30 secondes et 30 secondes pour un total de deux séances de 15 minutes.

Pour vérifier les résultats de sonication, transférez deux échantillons de 10 microlitres de chaque tube dans des tubes de 1,5 millilitre. Ensuite, inversez les réticulations en combinant le premier échantillon de 10 microlitres avec 10 microlitres de TE-RNase A et 0,2 microlitre de protéinase K.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite quatre microlitres de colorant d’ADN xylène 6X.

Pour le deuxième échantillon de 10 microlitres, préservez les réticulations en ajoutant deux microlitres de colorant d’ADN xylène 6X. Exécutez les deux échantillons sur un gel d’agarose à 1,5 % à 140 volts pendant environ 30 à 45 minutes jusqu’à ce que le colorant bromophénol de ce dernier soit aux trois quarts du gel. Si la sonication a réussi, transférez les lysats soniqués dans deux tubes d’un millilitre contenant 150 microlitres de Triton X-100 à 10 % et un vortex à mélanger.

Granulez la chromatine insoluble et les débris en faisant tourner les lysats soniqués à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférez ensuite les surnageants dans de nouveaux tubes de deux millilitres. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius indéfiniment.

Pour chaque réaction d’immunoprécipitation de la chromatine ou de ChIP, combinez 1,5 millilitre d’extraits soniqués avec des conjugués de billes d’anticorps dans des tubes de 1,5 millilitre. Incuber les tubes sur un mini rotateur de tubes à une vitesse de neuf à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Vérifiez après quelques minutes pour vous assurer que les échantillons ne fuient pas et qu’ils se mélangent correctement.

Le lendemain, faites tourner très brièvement les tubes pour recueillir le liquide dans les bouchons et placez les tubes sur une grille magnétique pendant une minute. Aspirez ensuite l’extrait. Ajoutez 0,75 millilitre de tampon RIPA dans chaque tube.

Retirez ensuite les tubes de la grille magnétique et retournez-les plusieurs fois pour les mélanger. Après un bref essorage, replacez les tubes sur l’aimant et aspirez le surnageant. Après le dernier lavage, ajoutez 0,75 millilitre de Tris HCL de 10 millimolaires dans chaque tube.

Retirez les tubes du support magnétique et retournez les échantillons plusieurs fois pour les mélanger. Après un bref essorage, replacez les tubes sur la grille et aspirez le surnageant. Après avoir effectué les réactions de polissage et de détail selon le protocole de texte, remplissez les calculs de mélange principal de ligature.

Préparez ensuite le mélange de ligature dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace et pipetez pour mélanger la solution. Avec les tubes d’échantillon sur le support magnétique, ajoutez 48 microlitres de mélange maître de ligature P7 et deux microlitres d’un indice d’adaptateur différent à chacune des résines d’échantillon. Incuber les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 25 degrés Celsius pendant deux heures.

Après avoir lavé les échantillons et effectué la réparation de l’entaille Phy 29 et les réactions kinases conformément au protocole de texte, remplissez les calculs du mélange maître d’exonucléase lambda et effectuez le mélange d’exonucléase lambda dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres de mélange d’exonucléases lambda à chaque échantillon de résine tout en restant sur le support magnétique. Ensuite, incubez les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir aspiré le dernier lavage comme décrit dans le protocole de texte, effectuez la réaction nucléase RecJf en remplissant les calculs du mélange principal RecJf et en faisant le mélange RecJf sur de la glace. Ajoutez 50 microlitres du mélange RecJf à chaque échantillon de résine sur le support magnétique. Ensuite, incubez les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après avoir aspiré le dernier lavage, préparez le tampon d’élution ChIP et le master mix de protéinase K et ajoutez 200 microlitres de la solution à chaque échantillon de résine. Incuber les échantillons dans un ThermoMixer à trois fois g à 65 degrés Celsius pendant la nuit avec un couvercle chauffant pour éviter la condensation. Le lendemain, faites tourner brièvement les échantillons et placez les tubes sur le support magnétique pendant une minute.

Transférez ensuite 200 microlitres de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de tampon TE. Après l’extraction de l’ADN, l’extension primaire P7 et les réactions ATL, remplissez les calculs du master mix de la table de ligature de l’adaptateur P5 et faites le master mix de ligature sur de la glace. Ajoutez 20 microlitres de mélange de ligature à chaque échantillon et pipetez pour mélanger.

Ensuite, incubez les échantillons dans un thermocycleur à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Effectuer la purification et la quantification de l’ADN selon le protocole textuel. Comme montré ici, il vaut la peine de passer du temps à optimiser les conditions de sonication pour obtenir des extraits de chromatine de haute qualité qui produisent des fragments d’ADN entre 100 et 500 paires de bases.

Et le test de déplacement de mobilité électrophorétique est utilisé pour vérifier que les extraits soniqués contiennent des réticulations d’ADN protéique intactes, évidentes comme un super décalage de fragments d’ADN. Pour évaluer le signal de fond, une ChIP simulée est systématiquement réalisée sans anticorps dans la réaction. Une exo-banque ChIP de haute qualité produira très peu de contexte dans l’échantillon fictif par rapport à une préparation de bibliothèque ChIP-seq.

Voici l’évaluation d’une banque ChIP-exo par un bioanalyseur. L’analyse précise garantit la distribution de la taille de la bibliothèque et détecte les dimères d’adaptateur contaminants qui fonctionnent à 125 paires de bases. Ce panel illustre la distribution régulière de cinq premiers N de l’étiquette ChIP-exo séparés par brins pour la polymérase II, le TFIIB et le TBP au niveau du gène RPS12 humain dans les cellules K562 en prolifération.

Cette figure montre les modèles moyens de ChIP-exo par rapport aux sites de démarrage transcriptionnel des gènes codant pour les protéines. Les principaux pics de TBP, TFIIB et polymérase II dans le graphique composite reflètent l’organisation génomique des complexes d’initiation de la transcription humaine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régulation des gènes pour explorer les détails moléculaires de la structure subnucléaire en asymétrie chez la levure. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage d’expression de la recherche de RNase peuvent être effectuées pour répondre à des questions telles que l’influence d’un facteur donné sur l’expression d’un gène voisin. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de remplir soigneusement les tables de mixage principales pour toutes les étapes enzymatiques.

N’oubliez pas que travailler avec des agents cancérigènes et autres agents caustiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure. Après cette vidéo de visionnage, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’une bibliothèque ChIP-exo de haute qualité.