Imagerie en direct pour l'étude microtubules Instabilité dynamique dans les cancers du sein taxane-résistantes
20 février 2017
Dans cet article, nous rapportons un protocole décrivant une méthode in vivo pour mesurer l’instabilité dynamique des microtubules dans les cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel (MCF-7TXT). Dans cette méthode, un système d’imagerie par microscopie à déconvolution est utilisé pour détecter l’expression de la GFP-tubuline dans les cellules cibles.
L’objectif global de cette expérience est de mesurer l’instabilité dynamique des microtubules dans les cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire sur l’instabilité dynamique des microtubules dans des conditions physiologiques et à la suite de divers traitements médicamenteux. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle fournit un protocole simple, fiable et physiologiquement applicable pour l’étude de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes.
Avant de commencer la procédure, cultivez les cellules cancéreuses du sein dans un milieu de culture complet dans des boîtes de culture de 10 centimètres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone au degré de confluence approprié. La veille de l’expérience, rincez les lamelles de verre revêtues de poly L-lysine de 24 millimètres avec de l’alcool à 70 % et exposez-les à la lumière UV pendant la nuit. Le lendemain matin, placez un couvercle dans chaque puits d’une assiette à six puits.
Ensuite, lavez les cultures avec du PBS et détachez les cellules de chaque plat avec 0,5 millilitre de trypsine EDTA. Lorsque les cellules ont commencé à se soulever du fond de la plaque, neutralisez la trypsine avec cinq millilitres de milieu de culture frais et comptez les cellules. Ajoutez ensuite environ une fois 10 fois les cinquièmes cellules dans chaque lamelle, secouez doucement la plaque et remettez les cellules dans l’incubateur pendant au moins 36 heures.
Pour tester la dynamique des microtubules des cellules, mélanger plusieurs fois la solution mère de tubuline alpha marquée par GFP par inversion afin d’assurer une solution homogène sans vortex. Remplacez ensuite le milieu de culture dans chaque puits par deux millilitres de milieu frais contenant 40 microlitres de tubuline étiquetée. Agitez doucement la plaque pour permettre un mélange complet du marqueur avec le milieu de culture et remettez la plaque dans l’incubateur pendant encore 24 heures.
Le lendemain, remplacez le milieu de culture par un milieu frais contenant du docétaxel et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 30 minutes. Pendant que les cellules sont inhibées, allumez le microscope à fluorescence inversée et préchauffez le porte-échantillon à 37 degrés Celsius. Sélectionnez ensuite l’objectif à huile 60X 1.42 NA et montez la première lamelle sur le porte-échantillon.
Couvrez l’échantillon avec un millilitre de milieu frais contenant du docétaxel à 37 degrés Celsius et localisez un groupe de cellules plates présentant une intensité de fluorescence élevée de tubuline alpha marquée à la GFP avec des structures microtubules clairement visibles. Concentrez-vous sur la zone périphérique de l’une des cellules de l’amas et réglez le temps d’exposition approprié dans la fréquence d’acquisition de l’image. Exactement 50 minutes après l’ajout de la première aliquote de docétaxel, commencez à enregistrer la dynamique des microtubules pendant deux minutes, obtenant une photo toutes les deux secondes.
Lorsque toutes les images ont été acquises, imagez la cellule suivante comme nous venons de le démontrer, jusqu’à ce que des images pour cinq cellules au total des trois puits de chaque concentration de docétaxel aient été capturées. Lorsque toutes les images ont été acquises pour chaque concentration d’inhibiteur, ouvrez le programme de déconvolution, dans le système de microscope et cliquez sur le processus. Ensuite, sélectionnez déconvolver et faites glisser le fichier image vers la fenêtre de saisie.
Cliquez sur do pour déconvolverver l’image et ouvrez le fichier d’image déconvoluée dans le logiciel du microscope. Cliquez sur fichier et enregistrez en tant que film. Définissez le format vidéo sur AV et le style d’animation sur Forward.
Réglez la qualité de compression sur 100 % et la fréquence d’images sur cinq par seconde. Cochez ensuite la case Animer jusqu’au temps et cliquez sur le faire pour générer la vidéo. Dans cette expérience représentative, des cellules cancéreuses du sein normales et résistantes au docétaxel ont été traitées avec du docétaxel et imagées comme cela vient d’être démontré, mais les effets du traitement sur la croissance et le raccourcissement des microtubules, plus évidents dans les cellules non résistantes au docétaxel.
En effet, la mesure du taux de croissance et de raccourcissement des microtubules dans des conditions de traitement au docétaxel de 0,5 micromolaire révèle une forte inhibition de la dynamique de la tubuline des cellules parentales mais pas résistantes au docétaxel. Une fois maîtrisé, l’ensemble du processus peut être complété en 60 heures si les techniques sont exécutées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner des cellules plates, avec une intensité élevée de fluorescence de la tubuline GFP, et de réduire à la fois l’intensité de la fluorescence d’excitation et la durée de l’exposition pour éviter l’évanouissement de la fluorescence GFP.
Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et du cancer pour évaluer les effets de divers agents ciblant les microtubules sur les cellules normales et cancéreuses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer l’instabilité dynamique des microtubules dans des cellules vivantes dans diverses conditions.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole permettant de mesurer l'instabilité dynamique des microtubules dans des cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel, en utilisant la microscopie de déconvolution. La méthode se concentre sur l'expression de la tubuline GFP dans des cellules vivantes, offrant des informations sur le comportement des microtubules sous traitement médicamenteux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
- Techniques de microscopie
Contexte
- Les microtubules jouent un rôle crucial dans la structure et la fonction cellulaires.
- La résistance au docétaxel constitue un défi important dans le traitement du cancer du sein.
- La compréhension de la dynamique des microtubules peut guider les stratégies thérapeutiques.
- La tubuline GFP permet une visualisation en temps réel du comportement des microtubules.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour étudier la dynamique des microtubules dans des cellules vivantes.
- Étudier les effets de traitements médicamenteux sur l'instabilité des microtubules.
- Approfondir la compréhension de la biologie des cellules cancéreuses.
Méthodes utilisées
- Imagerie in vivo des microtubules à l'aide de la microscopie de déconvolution.
- Culture de cellules cancéreuses du sein résistantes au docétaxel (MCF-7 TXT).
- Expression de la tubuline-GFP pour la visualisation.
- Préparation de lamelles recouvertes de poly-L-lysine pour l'adhérence cellulaire.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de la dynamique des microtubules dans des cellules vivantes.
- Démonstration de l'instabilité des microtubules en réponse à un traitement médicamenteux.
- Mise en place d'un protocole applicable à divers types cellulaires.
- Apport de connaissances sur les mécanismes de résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses.
Conclusions
- Le protocole fournit un outil précieux pour l'étude de la dynamique des microtubules.
- Les résultats contribuent à la compréhension du comportement des cellules cancéreuses sous traitement.
- Les recherches futures pourront s'appuyer sur cette méthode pour explorer d'autres stratégies thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La mesure de l'instabilité dynamique des microtubules dans des cellules cancéreuses vivantes fournit un test physiologiquement pertinent pour évaluer les mécanismes de résistance aux agents ciblant les microtubules (MTA). Cette approche permet la validation de la cible en reliant le comportement des microtubules à la réponse au médicament, renforçant ainsi la fiabilité prédictive du criblage préclinique des MTA. La méthode contribue à réduire les risques associés aux thérapies à base de taxanes en identifiant précocement les phénotypes de résistance lors de la phase de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge l'hypothèse thérapeutique en quantifiant les taux de croissance et de raccourcissement des microtubules en présence de docétaxel.
- Valeur opérationnelle : Utilise une expression de tubuline marquée par la GFP dans des cellules vivantes afin de permettre un imagerie en temps réel et physiologiquement pertinente, sans artefacts liés à la fixation.
- Valeur prédictive : Distingue les phénotypes sensibles du docétaxel de ceux qui y sont résistants selon l'inhibition de la dynamique des microtubules, contribuant ainsi à l'évaluation de la pertinence de la cible.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Établit un protocole standardisé pour mesurer la dynamique des microtubules dans des cellules cancéreuses du sein adhérentes à l’aide de la microscopie de déconvolution.
- Résultats quantitatifs : Génère des données en laps de temps permettant de mesurer les taux de croissance et de raccourcissement des microtubules comme paramètres fonctionnels.
- Application au criblage : Permet d’évaluer les effets des agents anti-microtubules sur l’instabilité des microtubules dans des cellules vivantes, facilitant ainsi le criblage de composés ou de génotypes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise la résistance aux taxanes dans les cellules cancéreuses du sein dérivées de MCF-7, reflétant les mécanismes de résistance observés cliniquement.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les altérations de la dynamique des microtubules et l'arrêt mitotique induit par le docétaxel ainsi que la résistance à l'apoptose.
- Décisions ajustées au risque : Permet l'identification précoce des phénotypes de résistance, éclairant les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant dans les programmes de développement de traitements anticancéreux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs, en passant par l'évaluation préclinique, en particulier pour les agents ciblant les microtubules, dont le mécanisme de résistance est lié à des modifications de la dynamique des microtubules.
- Biologie de la découverte : Permet de tester l'hypothèse selon laquelle le comportement des microtubules détermine la réponse aux médicaments dans des cellules vivantes.
- Triage : Fournit un système prêt à l'emploi pour quantifier les modifications de l'instabilité des microtubules après une perturbation chimique ou génétique.
- Analytique : Permet de mesurer les vitesses de croissance et de raccourcissement des microtubules comme paramètres quantitatifs résolus dans le temps, afin de comparer différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les mesures d'instabilité dynamique à des résultats fonctionnels tels que l'arrêt mitotique et l'apoptose dans les cellules résistantes par rapport aux cellules sensibles.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'imagerie réutilisable, applicable à plusieurs classes d'agents anti-microtubules et à divers modèles cellulaires, au-delà du cancer du sein résistant au docétaxel.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en reliant la dynamique des microtubules au phénotype du médicament dans un contexte physiologique.
- Valeur opérationnelle : Propose un protocole fiable et standardisé pour l'imagerie de cellules vivantes, nécessitant peu d'équipements spécialisés en dehors de la microscopie à fluorescence.
- Valeur stratégique : Réduit l'ambiguïté mécanistique concernant la résistance aux agents antimicrotubulaires, permettant une détection précoce des risques et une meilleure efficacité du capital dans les programmes en oncologie.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation des candidats aux agents antimicrotubulaires ajustée au risque en identifiant les mécanismes de résistance avant les études in vivo.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes, en microscopie à fluorescence et en biologie des microtubules.
- Dépend de l'accès à un microscope à fluorescence inversé équipé d'un objectif à immersion huile, d'une chambre environnementale et d'un logiciel de désconvolution.
- Implique une standardisation du semis cellulaire, de l'expression de la tubuline-GFP et du moment des traitements médicamenteux dans l'ensemble des expériences.
- Suppose des adaptations selon les types cellulaires, les marqueurs des microtubules ou les modalités d'imagerie utilisées.
- Est limité par les risques de photoblanchiment, nécessitant un contrôle rigoureux de l'intensité d'excitation et de la durée d'exposition, comme indiqué dans le protocole.
