Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés

L’objectif global de cette procédure est d’établir des cellules tétraploïdes prolifératives, exemptes d’une population diploïde, à partir de fibroblastes humains normaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la cancérogenèse, telles que la façon dont les cellules aneuploïdes se développent dans les premiers stades de la cancérogenèse. Le principal avantage de cette technique est que des cellules tétraploïdes prolifératives, exemptes d’une population diploïde, peuvent être établies par des procédures relativement simples.

Bien que certaines souches deviennent complètement tétraploïdes par un simple traitement avec du poison fuseau, la démécolcine, la plupart doivent être manipulées avec la méthode de secousse pendant ce traitement pour imiter une population diploïde. Pour commencer l’induction de la tétraploïdie sans la méthode de secousse, passez environ cinq fois 10 aux cellules cultivées dans une boîte de 100 millimètres. Incuber le plat dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après cela, traitez les cellules à croissance exponentielle avec un milieu contenant 0,1 microgramme par millilitre DC.Incuber dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 % à 37 degrés Celsius pendant quatre jours. Remplacez ensuite le milieu contenant du DC par un milieu sans médicament. Incuber dans 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la prolifération reprenne.

Pour induire la tétraploïdie en utilisant la méthode de secousse, faites passer les cellules cultivées dans des flacons T-75, en vous assurant que chaque flacon contient au moins une fois 10 à 1/6 de cellules. Incuber les flacons dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, traitez les cellules avec un milieu contenant des DC pendant 16 à 18 heures pour les arrêter en mitose comme indiqué dans le protocole de texte.

Après l’incubation, vérifiez les cellules dans une fiole sous le microscope à contraste de phase inversé. Ensuite, secouez doucement chaque flacon pour commencer la collecte des cellules mitotiques faiblement adhérentes. Il faut éviter toute manipulation imprudente, telle que des secousses violentes ou le contact avec la surface du ballon par la pointe de la pipette.

Ne pas contaminer les cellules mitotiques avec des cellules d’interface collées. Lavez délicatement les flacons avec un fluide chaud et transférez les cellules dans des tubes à centrifuger. Utilisez un compteur de cellules atomiques pour compter le numéro de cellule.

Après le comptage des cellules, centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes. Réensemencez les cellules mitotiques collectées dans des boîtes de culture de 16 millimètres. Traitez ensuite les cellules plaquées avec un milieu contenant 0,1 microgramme par millilitre de courant continu.Incuber dans 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant trois jours.

Après cela, remplacez le milieu contenant du DC par un milieu sans médicament. Incuber dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la prolifération reprenne. Pour l’analyse de la ploïdie de l’ADN, lavez les cellules avec du PBS.

Ajoutez ensuite une solution contenant 0,05 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA dans les cellules. Incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après cela, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger.

Et neutralisez la trypsine en ajoutant un milieu contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Centrifugez les cellules dans le milieu à 300 fois g pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de PBS.

Puis centrifuger à nouveau à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS. Ajoutez quatre millilitres d’éthanol à 100 % goutte à goutte en mélangeant.

Laissez reposer la suspension à température ambiante pendant 30 minutes pour fixer les cellules. Après cela, centrifugez les cellules dans une solution fixatrice à 300 fois g pendant cinq minutes. Et remettre en suspension les cellules dans cinq millilitres de PBS.

Centrifugez la suspension à 300 fois g pendant cinq minutes. Traitez ensuite les cellules avec 475 microlitres de solution d’ARN de 0,5 milligramme par millilitre. Ajouter 25 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution de propidium iodé pour colorer les cellules.

Et puis mélangez. Laissez reposer la suspension à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, utilisez un cytomètre en flux avec un laser de 488 nanomètres et un filtre d’émission de canal rouge pour analyser le contenu en ADN des cellules.

Analysez également un échantillon de référence préparé à partir de cellules diploïdes authentiques pour évaluer la ploïdie des cellules cibles. Pour commencer, traitez les cellules à croissance exponentielle avec un milieu contenant 0,1 microgramme par millilitre de courant continu pendant quatre heures pour arrêter les cellules en métaphase. Après cela, récoltez au moins cinq fois 10 pour 1/5 de cellules par trypsinisation.

Suspendez les cellules récoltées dans un milieu contenant du FBS. Centrifugez la suspension à 300 fois g pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite cinq millilitres d’une solution de chlorure de potassium à 0,075 molaire.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois l’incubation terminée, centrifugez la suspension à 300 fois g pendant cinq minutes. Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de fixateur de Carnoy.

Ensuite, centrifugez la suspension à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans 0,5 millilitre de fixateur de Carnoy. Déposez 30 microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre.

Enfin, colorez et analysez les cellules via le comptage des chromosomes ou l’analyse du caryotype. Dans cette étude, des cellules tétraploïdes prolifératives, exemptes d’une population diploïde, sont cultivées à partir de fibroblastes humains normaux. Bien que certaines souches cellulaires puissent devenir complètement tétraploïdes par un traitement continu avec des cellules conductrices, la plupart des cellules doivent être traitées avec la méthode de secousse au cours du traitement par cellules souches pour éliminer une population diploïde.

Les résultats représentatifs de l’induction de la tétraploïdie dans trois souches de fibroblastes sont présentés ici. La souche TIG-1 devient presque entièrement tétraploïde par un simple traitement continu avec des DC. Cependant, ce traitement fait que les souches BJ et TIG-hT deviennent un mélange de populations diploïdes et tétrapodes. Par conséquent, l’isolement des cellules mitotiques par la méthode de secouage est nécessaire pendant le processus de traitement.

Un comptage chromosomique est effectué dans les cellules tétraploïdes établies. Comme on peut le voir, le nombre de chromosomes modaux est de 92 pour les cellules TIG-1 et BJ, et de 91 pour les cellules TIG-hT. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines si elle est correctement exécutée.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de secouer doucement les flacons lors de l’étape de secousse, afin de ne pas provoquer de contamination des cellules mitotiques par les cellules d’interface adhérentes.