Name: Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN- (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la régulation du tropisme des picornavirus par microARN via l'incorporation d'éléments de réponse dans le génome viral. Cette méthode améliore la sécurité et l'utilité des virus en recherche virologique.

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Al et Mary Agnes McQuinn, la Fondation Richard M. Schulze et une subvention de secours des NIH de la Mayo Clinic ont financé les travaux représentatifs décrits ici.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception, la composition et la localisation des éléments de réponse microARN dans le génome viral dicteront ciblant l&#39;efficacité et la spécificité. Optimisation de ceux-ci, il faudra essais et erreurs. Cependant, la conception rationnelle basée sur l&#39; analyse structurelle de l&#39; ARN et des études antérieures de la réplication virale et microARN signatures aides à la mise en œuvre de cette technique avec l&#39; optimisation minimale 10, 11,</...

Le développement d&#39;une méthode largement applicable, facile et efficace pour l&#39;ingénierie d&#39;un vecteur à tropisme restreint offre une opportunité majeure pour améliorer la sécurité, la compréhension biologique et une utilité thérapeutique des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour cibler tropisme viral comprenant traductionnelle, la transcription, et des techniques à base de traduction. Cependant, ces procédés ne sont généralement pas applicables à tous les systèmes de vecteurs, peut nécessiter des voies de signalisation défectueux dans des cellules ciblées ou nécessitent l&#39;insertion de grandes séquences codantes dans le génome viral. En outre, ces procédés peuvent conduire à une atténuation du virus, ce qui entrave considérablement leur activité thérapeutique et limitant un aperçu du système non modifié. Les microARN sont de petits (22-25 nucléotides), ARNs non codants qui interviennent dans le silençage génique dans des cellules eucaryotes. fonction microARN par des séquences cibles complémentaires (éléments de réponse) en ARN messagers de liaison (ARNm) resulti<html> ng dans la transcription déstabilisation, la dégradation ou la répression traductionnelle. Les microARN se lient normalement des éléments de réponse avec une complémentarité partielle et donnent de petites modifications dans l&#39; expression des gènes 1, 2, 3, 4, 5. Plus de modifications significatives dans l&#39; expression génique peut être obtenue en augmentant la complémentarité de l&#39;élément de réponse 6. Des milliers de micro - ARN matures ont été identifiés dans une variété d&#39;espèces et de nombreux motifs d&#39;expression différentiels d&#39;exposition dans une variété de types cellulaires et tissulaires 7, 8, 9. Ces signatures de microARN peuvent être exploitées pour la restriction spécifique à la cellule d&#39;amplification du virus en y incorporant des éléments de réponse parfaitement complémentaires dans le génome viral 10,= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13. L&#39;objectif global de cette technique de microRNA-ciblage est de contrôler le tropisme d&#39;un génome de vecteur sans atténuation supplémentaire. L&#39;utilité de cette méthode de régulation tropisme viral a été démontrée dans des vecteurs lentiviraux pour limiter l&#39; expression du transgène dans des tissus spécifiques 14, 15, 16. Cette technique a ensuite été appliquée à un large éventail de se répliquer et ne se répliquant pas des vecteurs viraux pour la thérapie génique accrue, ainsi que pour améliorer les profils de nombreux virus oncolytiques de sécurité en éliminant les effets toxiques indésirables dans les tissus normaux 10, 11, 12, 13, 17 . Il a également été utilisée pour générer sûre et eles vaccins vivants atténués EFFICACE ainsi que pour améliorer le virus et la fabrication de vaccins traite 18, 19, 20, 21. MicroARN-ciblage d&#39;un vecteur peut permettre à l&#39;atténuation dans des hôtes vaccinés ou systèmes ciblés, tout en maintenant les niveaux de croissance de type sauvage dans les systèmes de production. MicroARN-ciblage peut également être utilisé pour améliorer la biosécurité des virus à des fins de recherche en limitant la transmission dans une espèce (par exemple les humains) , tout en maintenant la transmission dans d&#39; autres hôtes 22. Enfin, microRNA-ciblage peut permettre des analyses en profondeur des cycles de vie viraux et des rôles spécifiques de types de cellules dans la pathogénie et l&#39; immunité en séparant la croissance virale 23, 24, 25, 26. Cette technique offre une alternative méthode qui est facilement mis en oeuvre et applicables à tous les systèmes de ciblage de virus. En outre, la collection sans cesse croissante de microARN matures avec des profils d&#39;expression différentielle dans des types cellulaires spécifiques rend cette technique très polyvalent. le ciblage basé sur microARN se sont révélées efficaces pour une variété de systèmes de virus sans compromettre le fonctionnement du système. Les principales limites de cette technique comprennent essai et l&#39;optimisation d&#39;erreur, le potentiel de mutations d&#39;échappement, et potentiels hors-cible des effets sur les transcriptions endogènes. Toutefois, ces limitations peuvent généralement être surmontés avec la conception des éléments de réponse optimisée et rationnelle. Les virus à ARN de sens positif ont tendance à être particulièrement sensible aux micro-ARN-cible due à l&#39;orientation de sens positif de leur génome et de la disponibilité des transcriptions à la machine de microARN au cours du cycle de réplication complètement cytoplasmique. Nous décrivons ici un protocole pour générer un picornavirus microRNA-ciblée et l&#39;expérimméthodes entales pour vérifier l&#39;efficacité et la spécificité de ce ciblage in vitro.

<table><tbody><tr><td>Encodage RE Oligonucléotides</td><td>IDT</td><td>PAGE-Purified</td><td>Ultramer Sequence Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Oligonucléotides codant un site de restriction unique</td><td>Séquence IDT</td><td>25nM</td><td>Designed by Investigator</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>De nombreux autres kits de PCR haute fidélité Polymerase Polymerase disponibles</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>System NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>sans RNase</td></tr><tr><td>5 M NH4 Acétate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Livré en MEGAclear</td></tr><tr><td>Kit Ethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Réactif de transfection</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Réactif de transfection</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu ; m filtre seringue</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Tubes à bouchon à vis</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Racleurs cellulaires</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA Imite</td><td>Dharmacon</td><td>Varied</td><td></td></tr><tr><td>MTT Essai de prolifération cellulaire</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Efficacité de sous-clonage DH5&alpha ; Cellules compétentes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>vecteurs pBlueScript II</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variable (par exemple 212205)</td><td>Il existe différents plasmides avec des promoteurs T7 ou T3 et des sites de clonage variables pour permettre le clonage et la transcription de l’ARN.</td></tr></tbody></table>

règlement de picornavirus tropisme base microarn-

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

La restriction cellulaire de la réplication virale sans atténuation concomitante peut être bénéfique pour le développement de vaccins, la thérapie génique, la virothérapie oncolytique et la compréhension des propriétés biologiques des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour réguler le tropisme viral, mais ils ont tendance à être spécifiques à une classe de virus et beaucoup entraînent une atténuation du virus. De plus, de nombreux virus, y compris les picornavirus, présentent des contraintes de taille qui ne permettent pas d’incorporer de grandes quantités de matériel génétique étranger nécessaire à certaines méthodes de ciblage. Les microARN sont de courts ARN non codants qui régulent l’expression des gènes dans les cellules eucaryotes en liant des séquences cibles complémentaires dans les ARN messagers, empêchant leur traduction ou accélérant leur dégradation. Différentes cellules présentent des signatures de microARN distinctes et de nombreux microARN servent de biomarqueurs. Ces modèles d’expression différentiels peuvent être exploités pour restreindre l’expression des gènes dans les cellules qui expriment des microARN spécifiques tout en maintenant l’expression dans les cellules qui ne le font pas. En ce qui concerne la régulation du tropisme viral, des séquences complémentaires à des microARN spécifiques sont incorporées dans le génome viral, généralement dans les régions non codantes 3', les ciblant pour la destruction en présence des microARN apparentés, empêchant ainsi l’expression et/ou la réplication des gènes viraux. Le ciblage par microARN est une technique qui, théoriquement, peut être appliquée à tous les vecteurs viraux sans altérer la puissance du virus en l’absence des microARN correspondants. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales associées à la génération d’un picornavirus ciblant les microARN et à l’évaluation de l’efficacité et de la spécificité de ce ciblage in vitro. Ce protocole est conçu pour un virus à réplication rapide avec un cycle de réplication lytique, cependant, la modification des points temporels analysés et des lectures de titrage spécifiques du virus utilisées aidera à l’adaptation de ce protocole à de nombreux virus différents.

Le tableau 1 représente les résultats typiques d&#39;une analyse de titrage pour un picornavirus et décrit comment calculer la dose infectieuse de culture tissulaire à 50%. Une représentation schématique du concept global de la réglementation sur la base microRNA-du tropisme viral décrit dans ce manuscrit est illustré à la figure 1. L&#39;orientation de microARN à l&#39; élément de réponse au cours des interactions intracellulaires, une bonne conception ...

Nous décrivons ici une méthode de régulation du tropisme du picornavirus en incorporant des séquences complémentaires à des microARN spécifiques dans le génome viral. Ce protocole peut être adapté à toutes les différentes classes de virus, avec des modifications en fonction de la durée et de la nature de leur cycle de vie.

Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN-

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

L'objectif général des expériences suivantes est d'évaluer l'efficacité et la spécificité de la régulation basée sur les microARN de la tropisme des picornavirus in vitro. Cela est réalisé en préparant des picornavirus codant des éléments de réponse aux microARN dans leur génome. Dans un deuxième temps, utiliser les virus pour infecter des cellules exprimant ou non les microARN correspondants.Ensuite, évaluer la cinétique de réplication virale, la propagation et la toxicité afin de déterminer l'efficacité et la spécificité du ciblage. Cette méthode de ciblage peut être utilisée dans le domaine de la virologie pour améliorer la sécurité, la production et l'utilité des virus, ou pour faciliter la recherche axée sur la compréhension des processus biologiques impliqués dans une infection virale. Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle nécessite une modification minimale du génome viral et qu'elle est très polyvalente, un nombre important de signatures de microARN cellulaires ayant déjà été identifié.Pour commencer cette procédure, ensemencez les cellules perméables dans une plaque de 96 puits avec du milieu de croissance complet. Ajoutez du milieu sans sérum et sans vi

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

Les microARN (miARN) sont des régulateurs importants de l'expression génique et ont été montrés à jouer un rôle dans de nombreux processus biologiques. Afin de mieux comprendre les interactions miARN-UTR, nous avons créé une collection pangénomique de journalistes UTR 3 luciférase jumelé avec un nouveau gène de la luciférase et réactif de dosage, le système LightSwitch.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

Les norovirus sont une cause majeure de gastro-entérite encore des techniques moléculaires pour leur caractérisation sont encore relativement nouvelle. Nous rapportons ici deux différentes approches de génétique inverse pour la récupération efficace des norovirus murin (MNV), le seul membre de ce genre qui peuvent être propagées en culture cellulaire.

Génétique inverse de récupération des norovirus murin médiation infectieuses

Source : Ruiz, A. J. et Russell, S. J. Régulation de la tropisme des picornavirus par ARN micro. J. Vis. Exp. (2017)Ce vidéo montre l'utilisation de mimiques de microARN synthétiques afin d'inhiber de manière sélective la réplication virale dans des cellules épithéliales cultivées. Elle met en évidence comment la silenciation du génome dirigé par les microARN peut bloquer la propagation du virus et confirmer la spécificité du ciblage par une analyse de l'infectiosité en aval.

Évaluation de l'inhibition de la propagation virale par le silençage génomique médié par des mimiques de microARN

Dans ce document, nous proposons une stratégie pour étudier l’effet d’un facteur de transcription d’intérêt sur le transcriptome du microARN en utilisant des données accessibles au public, des ressources de calcul et des données à haut débit provenant de réseaux de microARN après transfection de cellules avec de petits ARN en épingle à cheveux (sh)RNA ciblant un facteur de transcription d’intérêt.

Décrire un règlement dépendant du facteur de transcription de l&#39;microARN transcriptome

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

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ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

MicroARN À base de virus de la pomme de terre X Silençage (VbMS) dans la pomme de terre.

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

Amplification et reconnaissance de microARN par hybridation in situ d’acides nucléiques verrouillés en tant que nouvelle méthode de détection et de quantification

Découvrez la régulation du tropisme des picornavirus par microARN via l'incorporation d'éléments de réponse dans le génome viral. Cette méthode améliore la sécurité et l'utilité des virus en recherche virologique.

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