Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

Les objectifs généraux de ce protocole sont de collecter un milieu conditionné à partir de cellules souches embryonnaires de souris dans des conditions de culture sans sérum et sans feeder et de caractériser les fonctions biologiques de ce milieu. Cette procédure fournit des informations sur l’activité anti-sénescence des facteurs solubles sécrétés à partir de cellules souches embryonnaires de souris pour le développement d’une approche thérapeutique sûre et sans cellule pour les maladies liées à l’âge. La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Yun-Ui Bae, professeur de recherche de mon laboratoire.

Dans une cagoule de sécurité biologique, traitez une culture cellulaire de fibroblaste embryonnaire de souris ou MEF avec 20 millilitres de milieu MEF complété par de la mitomycine C dans une boîte de culture cellulaire de 15 centimètres pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS et détachez-les avec trois millilitres de trypsine EDTA pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Neutraliser la trypsine avec six millilitres de milieu MEF frais lorsque les cellules se sont soulevées du bas de la plaque.

Après avoir collecté les cellules par centrifugation, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu MEF et plaque deux fois 10 à six MEF inactivés par boîte de culture de 10 centimètres dans un milieu MEF frais. Cultivez les cellules nourricières pendant 24 heures. Remplacez ensuite le milieu MEF par un milieu de cellules souches embryonnaires de souris et ensemencez deux fois 10 cellules souches embryonnaires de souris dans les mangeoires pour au moins 48 heures de co-culture.

Dans une hotte de sécurité biologique, rincez une plaque de cellules souches embryonnaires de souris avec cinq millilitres de PBS et détachez les cellules avec de la trypsine plus de l’EDTA comme nous venons de le démontrer. Après avoir collecté les cellules par centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellules souches dans cinq millilitres de milieu de cellules souches fraîches et déposer un millilitre de cellules par boîte dans un milieu de cellules souches embryonnaires fraîches sur cinq boîtes de culture cellulaire enrobées de gélatine. Remettez les cellules dans l’incubateur jusqu’à ce que les cultures atteignent 80-85 % de confluence.

Ensuite, rincez les cellules dans au moins huit millilitres de PBS par plaque pendant trois lavages de 10 minutes suivis d’une incubation de 24 heures dans un milieu sérique réduit. Après pas plus de 24 heures, transférez le surnageant dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation. Suivi d’une filtration à travers une passoire de 0,2 micromètre.

Pour tester les effets du milieu conditionné par des cellules souches embryonnaires par un test de bêta-galactosidase associée à la sénescence, ensemencez des fibroblastes dermiques humains dans une plaque à six puits dans un milieu de fibroblastes dermiques humains. Après une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, remplacez la moitié du milieu par un milieu frais conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris pour une autre culture de 72 heures. Le troisième jour de culture, rincez les cellules dans deux millilitres de PBS par puits pendant deux lavages de 30 secondes.

Ensuite, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde à 3,7 % pendant cinq minutes à température ambiante dans une hotte. Après la fixation, lavez les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS, comme nous venons de le démontrer, et étiquetez les cellules avec un à deux millilitres de solution de bêta-gal SA pendant 17 heures et demie à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. À la fin de la période de coloration, laver les cellules deux fois avec du PBS comme cela vient d’être démontré.

Ensuite, contre-teintez avec de l’Eosen pendant cinq minutes à température ambiante. Après une autre série de lavages PBS, imagez les cellules à un grossissement de 100 fois par microscopie optique. Pour l’analyse du cycle cellulaire, ensemencez huit fois 10 au quatrième fibroblaste dermique humain par puits dans une boîte de culture cellulaire de six centimètres dans un milieu de fibroblaste dermique humain frais pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain matin, remplacez la moitié du milieu par un milieu conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris et retournez les cellules dans l’incubateur. Après 24 heures, récoltez les cellules par dissociation de la trypsine EDTA suivie de deux lavages dans un millilitre de solution PBS. Remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de solution PBS froide après le deuxième lavage.

Ensuite, fixez les cellules avec l’application goutte à goutte à 200 microlitres d’éthanol froid tout en vortexant. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure. Ensuite, lavez-les dans une solution fraîche de PBS.

Après la deuxième centrifugation, traitez la pastille avec 250 microlitres de tampon de citrate de sodium complété par de la RNase pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, étiquetez les cellules avec 250 microlitres de tampon de citrate de sodium contenant de l’iodure de propidium pendant 20 minutes. Ensuite, évaluez les étapes du cycle cellulaire de chaque échantillon par cytométrie en flux.

Pour l’analyse quantitative par PCR de la transcriptase inverse, utilisez un kit d’extraction d’ARN pour isoler l’ARN total à partir de fibroblastes dermiques humains traités par des cellules souches embryonnaires de souris selon le protocole du fabricant. Utilisez un spectrophotomètre pour quantifier la totalité de l’ARN extrait. Ensuite, formuler un mélange réactionnel contenant les amorces d’oligodésoxythymidine et la transcriptase inverse M-MLV selon le protocole du fabricant.

Ajoutez ensuite un microgramme de l’ARN total dans le tube PCR contenant le mélange réactionnel. Enfin, mesurez l’amplification de l’ADNC à l’aide d’un appareil de PCR en temps réel à l’aide du mélange maître de PCR vert et des amorces de gènes appropriées. Les cellules souches embryonnaires de souris cultivées dans des conditions normales de culture de cellules souches embryonnaires de souris sur une couche de cellules nourricières MEF présentent une forme ovale et un aspect brillant.

Tandis que les cellules souches embryonnaires de souris cultivées dans des conditions de culture sans sérum et sans nourrissage présentent une morphologie aplatie et irrégulière. Le traitement du fibroblaste dermique humain sénescent avec un milieu conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris diminue le nombre de cellules positives à la bêtagalactosidase associées à la sénescence. De plus, l’analyse du cycle cellulaire de ces cellules révèle que le traitement en milieu conditionné par des cellules souches embryonnaires de souris augmente considérablement le nombre de cellules dans les phases S et G2/M tout en réduisant le nombre de cellules dans la phase G0/G1.

De plus, le traitement en milieu conditionné à base de cellules souches embryonnaires de souris diminue l’expression des gènes associés à la sénescence et des cytokines secrétaires associées au phénotype sénescent. Lors de cette procédure, il est très important de se rappeler de collecter le sérum et le milieu libre après 24 heures, car une longue incubation augmente la possibilité d’autolyse cellulaire ou d’apoptose par famine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter du sérum et un milieu conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris sans mangeoire pour une approche sans cellule.

N’oubliez pas que travailler avec un réactif tel que le paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la manipulation de ce réactif dans une hotte, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.