Name: Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Apprenez à collecter le milieu conditionné par des cellules souches embryonnaires de souris sans sérum ni nourricier. Cette méthode révèle les propriétés anti-sénescence des facteurs solubles pour des applications thérapeutiques sans cellules.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Cette recherche a été soutenue par le programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A2060930) et le Programme Medical Research Center (2015R1A5A2009124) par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future. Cette recherche est également soutenu par un démarrage Subvention de fonctionnement de The Hospital for Sick Children (HK Sung). Nous tenons à remercier Laura Barwell et Sarah JS Kim pour leur excellente aide à la rédaction de ce manuscrit et le Dr Andras Nagy pour fournir la ligne G4 MESC.

REMARQUE: Un schéma du sérum et le protocole de collecte de CM sans chargeur-est représenté sur la figure 1. 1. Matériaux (Préparation du MEF, Medium, Plaques et Solutions) <ol><li> Préparer 500 ml de milieu de culture les MEF. Supplément milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de FBS (qualité ESC), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine. </li><li> Isoler MEFs à partir d&#39; embryons suivant un protocole de routine établie 13 et les maintenir dans le milieu MEF. </li><li> Préparer 500 ml de milieu pour la culture des mESCs. DMEM est complété avec 15% de FBS et 2 mM de L-glutamine, de 100 um d&#39;acides aminés non essentiels (NEAA), 100 pM de β-mercaptoéthanol, 100 unités / ml de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine. </li><li> Préparer les plaques gélifiés (5 plaques gélatinisés / 1 MESC plaque) par revêtement 10 cm boîtes de culture de cellules avec 5 ml d&#39;une solution de gélatine à 0,1%. Laisser incuber pendant au moins 10 min<html> à température ambiante. </li><li> Préparer 500 ml de milieu sérique réduit pour une condition sans sérum de mESCs. Supplément réduit Sérum médias avec 1,2 g de bicarbonate de sodium (pH 7,0). Filtrer à travers une bouteille-top filtre de 0,2 um. </li><li> Préparer la β-galactosidase par la sénescence associée (SA β-gal) de solution de coloration pour la détection de cellules sénescentes: 1 mg / ml de X-gal (dissous dans du diméthylformamide, DMF), l&#39;acide citrique 40 mM / tampon phosphate de sodium (pH 6,0) , 5 mM de ferricyanure de potassium, 5 mM de ferrocyanure de potassium, 150 mM de NaCl et 2 mM de MgCl2 14. ATTENTION: (dangereux) DMF est une solution toxique et corrosif. Porter un vêtement de protection individuelle (par exemple, nitrile ou de latex des gants, une blouse et des lunettes) lors de la manipulation solution. Utilisez une hotte. </li><li> Préparer 500 ml de milieu à la culture humaine fibroblastes dermiques (HDFS, NHDF-Ad-Der-fibroblaste). Supplément DMEM avec 10% de FBS et 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Culture de la souris cellules souches embryonnaires (figure 1A et 2A) REMARQUE: Effectuer toutes les étapes dans une hotte de sécurité biologique de culture cellulaire. <ol><li> Traiter les MEFs avec 20 ml de milieu contenant du MEF 10 pg / ml de mitomycine C dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Aspirer le moyen de MEF. Laver les cellules avec du PBS trois fois. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA (TE 1 x) et on incube pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Au bout de 3 minutes, neutraliser le TE avec 6 ml de milieu MEF et centrifugation pendant 3 minutes à 300 x g. </li><li> Remettre en suspension dans 5 ml de milieu MEF. Déterminer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire obtenue en utilisant une coloration au bleu trypan et un hémocytomètre. Plaque (FAE nourricières inactivées) à une densité de 2 x 10 6 cellules par 10 cm de boîte de culture cellulaire en milieu MEF. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Remplacez le support MEF avec le milieu MESC 24 heures après l&#39;étalement du chargeur (sur lale jour suivant). </li><li> Plate les mESCs (G4 hybride F1 de cellules ES) à une densité de 2 x 10 6 cellules sur le chargeur avec un milieu MESC. Incuber pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: L&#39;effet anti-vieillissement de MESC-CM est probablement plus forte lorsque le numéro de passage inférieur mESCs sont utilisés 15-17. Nous avons acquis une ligne G4 MESC du Dr Andras Nagy à l&#39;Institut Lunenfeld-Tanenbaum recherche, Hôpital Mount Sinai, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. </li><li> Gardez les cellules à une densité relativement élevée et le passage à un état sous-confluentes 70-80%. Remplacez le support avec un milieu MESC frais tous les jours. </li></ol> 3. Collection de Serum et libre Feeder-milieu conditionné (figure 1B et 2B) REMARQUE: Effectuer toutes les étapes dans une hotte de sécurité biologique de culture cellulaire. <ol><li> Rincer la plaque MESC avec 5 ml de PBS. Ajouter 1 ml de TE (2,5 fois) et on incube pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Après 3 min, neutraliser le TE avec 2 ml de MESC medium et centrifuge pendant 3 min à 300 x g. </li><li> Remettre en suspension dans 5 ml de milieu MESC et plaque 1 ml dans chaque boîte de culture revêtues de gélatine (5 plaques gélifiés / 1 MESC plaque) dans un milieu MESC. Culture à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu&#39;à 80-85% de confluence soit atteinte. </li><li> Laver mESCs avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules (8 ml par 10 cm plaque) pour 10 min par lavage, pour un total de trois lavages. Incuber en milieu sérique réduit pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: L&#39;étape de lavage est importante pour éviter la contamination de FBS. Il est important de suivre le temps d&#39;incubation 18,19. </li><li> Collecter MESC-CM dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge pendant 20 min à 2500 x g. Recueillir la solution de surnageant (CM), après la centrifugation. Filtrer à travers une bouteille-top filtre de 0,2 um. </li></ol> 4. Effets de la souris les cellules souches embryonnaires conditionné moyenne (MESC-CM) REMARQUE: Les effets de la MESC-CM ont été validés par plusieurs méthodes, telles queSA dosage β-gal, l&#39;analyse du cycle cellulaire, et la qRT-PCR. <ol><li> SA β-gal Assay (figure 3A) <ol><li> HDFS de semences à une densité de 2 x 10 4 cellules par puits dans des plaques 6 puits dans un milieu HDF. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après une incubation d&#39;une nuit, la moitié défausse du milieu HDF et ajouter MESC-CM et moyen de contrôle. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. moyen de contrôle est dérivé d&#39;un milieu exempt de sérum (sérum réduit Media) dans un plat revêtu de gélatine en l&#39;absence de mESCs. </li><li> Laver les cellules avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules (2 ml par plaque de 6 puits) pour 30 sec par lavage, pour un total de deux lavages. Ajouter 3,7% de paraformaldehyde (PFA) pour la fixation. Incuber pendant 5 min à température ambiante. ATTENTION: (dangereux) paraformaldéhyde est une solution toxique et corrosif. Porter un vêtement de protection individuelle (par exemple, nitrile ou de latex des gants, une blouse et des lunettes) lors de la manipulation de la solution.Utilisez une hotte. </li><li> Aspirer la solution de fixation. Laver les cellules fixées avec du PBS deux fois, comme décrit à l&#39;étape 4.1.3. </li><li> Ajouter la solution SA β-gal coloration (1-2 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Incuber pendant 17,5 heures à 37 ° C. NOTE: Il ne doit pas être incubé dans un incubateur à CO2. </li><li> Aspirer la solution de coloration β-gal SA et laver les cellules avec du PBS deux fois, comme décrit à l&#39;étape 4.1.3. </li><li> Ajouter la solution éosine pour la contre-coloration. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Laver les cellules avec du PBS deux fois, comme décrit à l&#39;étape 4.1.3. </li><li> cellules d&#39;image à grossissement 100X en utilisant un microscope et capter la lumière des images en utilisant un appareil photo numérique fixé pour une analyse ultérieure. NOTE: Le nombre total de cellules peut être compté d&#39;une manière aveugle et le pourcentage de cellules positives bleu SA β-gal peut être calculée. </li></ol></li><li> Cellule d&#39; analyse du cycle (figure 3B) <ol><li> HDFS de semences à une densité de8 x 10 4 cellules par puits dans une boîte de culture cellulaire de 6 cm dans un milieu HDF. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Après une incubation d&#39;une nuit, la moitié défausse du milieu HDF et ajouter MESC-CM et moyen de contrôle. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Trypsiniser les cellules, comme décrit dans l&#39;étape 3.1, et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Laver les cellules avec une solution PBS froide (PBS avec 0,5 mM CaCl2 et 2% de FBS, 1 ml par tube de 1,5 ml) deux fois et centrifuger pendant 3 min à 2500 x g. Remettre en suspension dans 100 pi de solution PBS froide. </li><li> Fixer les cellules en supprimant 200 pi d&#39;éthanol froid tout tourbillonnement. Conserver à 4 ° C pendant au moins 1 h. </li><li> Laver les cellules avec une solution de PBS froid deux fois, comme décrit à l&#39;étape 4.2.3. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 250 ul de tampon de citrate de sodium (1,12%, pH 8,5) contenant 50 pg / ml de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 250 pl de citrate de sodiumun tampon contenant 50 pg / ml d&#39;iodure de propidium. Incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Mesurer les cellules 10.000 dans chaque échantillon à l&#39; aide de cytométrie de flux 20. </li></ol></li><li> qRT-PCR (figure 3C) <ol><li> HDFS de semences et d&#39;ajouter MESC-CM, comme décrit dans les étapes 4.1.1 et 4.1.2. </li><li> Isoler l&#39;ARN total à partir des hdfs en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ARN selon le protocole du fabricant. Quantifier l&#39;ARN total extrait à l&#39; aide d&#39; un spectrophotomètre 21. </li><li> Synthétiser l&#39; ADNc en ajoutant 1 pg de l&#39;ARN total à 20 ul d&#39;un mélange réactionnel contenant des oligo (dT) et des amorces M-transcriptase inverse de MLV, selon le protocole du fabricant 20. </li><li> Mesurer l&#39;amplification de l&#39;ADNc avec une machine de PCR en temps réel, en utilisant Green PCR Master Mix et des amorces spécifiques de gènes (Supplément tableau 1). Normaliser les données avec l&#39;expression de GAPDH. Utilisez le protocole de PCR suivant: initial dedénaturation pendant 10 min à 95 ° C; 45 cycles de 15 sec à 95 ° C, 20 s à 55 ° C, et 35 sec à 72 ° C; et l&#39;étape de la courbe de fusion pendant 15 sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C, 30 s à 95 ° C, et 5 sec à 60 ° C 15. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+stem%2Fprogenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608(2012).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+contribution+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+to+liver+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice.</a> Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li>
<li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+treating+ischemic+disease+using+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+without+direct+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation.</a> Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).</li>
<li>Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+critical+limb+ischemia%3A+microvascular+therapies+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age.</a> Circulation. 118, 9-16 (2008).</li>
<li>Lazarous, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+in+patients+with+intermittent+claudication%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial.</a> J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).</li>
<li>Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+and+hurting%3A+molecular+mechanisms%2C+functions%2C+and+pathologies+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence.</a> Mol Cell. 36, 2-14 (2009).</li>
<li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+fed+late+in+life+extends+lifespan+in+genetically+heterogeneous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.</a> Nature. 460, 392-395 (2009).</li>
<li>Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+sirtuins+viable+targets+for+improving+healthspan+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan.</a> Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).</li>
<li>Martin-Montalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+improves+healthspan+and+lifespan+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metformin improves healthspan and lifespan in mice.</a> Nat Commun. 4, 2192(2013).</li>
<li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF%2FFGF+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour le succès de la collecte de sérum et de MESC-CM sans alimentation, les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Le facteur le plus important est l&#39;utilisation précoce mESCs de passage pour la collecte des MESC-CM. Auparavant, il a été montré que le passage précoce MESC-CM a de meilleurs effets anti-âge par rapport à mESCs de passage tardif. Le nombre de passage mESCs a été rapporté à affecter leur potentiel de développement 16 et 17 pluripotence. <p class="jove_con...

L&#39;objectif de ce protocole est de recueillir des souris embryonnaires cellules souches (MESC) moyenne Climatisé (MESC-CM) à partir des conditions de culture sans sérum et sans alimentation et de caractériser ses fonctions biologiques. En général, les cellules souches embryonnaires (CSE) ont un grand potentiel pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire en raison de leur pluripotence et la capacité d&#39;auto-renouvellement 1-3. Cependant, la transplantation directe de cellules souches a plusieurs limitations, telles que le rejet immunitaire et la formation de tumeurs 4,5. Par conséquent, une approche sans cellule peut fournir une stratégie thérapeutique alternative pour la médecine régénérative et les interventions de vieillissement 6,7. La sénescence est considérée comme une contrepartie cellulaire au vieillissement des tissus et des organes, caractérisé par un état permanent d&#39;arrêt de la croissance, la physiologie cellulaire altérée, et les comportements. Le vieillissement est le principal facteur de risque pour les maladies courantes, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires, type 2 diabète, et la neurodégénérescence 8. Une des caractéristiques évidentes du vieillissement est la baisse du potentiel de régénération des tissus, qui est causée par le vieillissement de cellules souches et de l&#39; épuisement 9. De nombreuses études ont montré d&#39; importantes molécules pharmacologiques, tels que la rapamycine 9, le resvératrol 10, et de la metformine 11, et les facteurs systémiques sang, à savoir GDF11 12, qui ont la capacité de retarder constamment le vieillissement et de prolonger la durée de vie. Dans la présente étude, MESC-CM a été récolté sans sérum (sérum fœtal bovin, FBS) et alimentation (fibroblastes de souris embryonnaires, MEF) couches d&#39;exclure la contamination des facteurs sériques et les facteurs sécrétoires de MEF. Ces conditions ont permis une CM et sans sérum d&#39;alimentation qui a permis par conséquent l&#39;identification précise des facteurs sécrétoires MESC spécifiques. Ce protocole proposé est très efficace, relativement rentable et facileopérer. Cette technique donne un aperçu de la caractérisation des facteurs solubles MESC dérivés qui peuvent arbitrer un effet anti-sénescence, qui peut être utilisé pour le développement d&#39;une approche thérapeutique acellulaire sûre et potentiellement avantageuse vers les interventions pour les maladies liées au vieillissement associées et autres régénérative traitements.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#30044333</td><td>20 %, ES de qualité cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>#15140</td><td>50 unités/ml de pénicilline et 50&nbsp ; mg/ml streptomycine</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>#25030</td><td>2&nbsp ; mM</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Invitrogen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp ; et micro ; M</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp ; et micro ; </td></tr><tr><td>M Facteur inhibiteur de la leucémie&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 unités/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>3,70 %</td></tr> <tr><td>Diméthylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ferricyanure de potassium</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Ferrocyanure de potassium</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp ; et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>Iodure de propidium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp ; et micro ; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV reverse transcript-tase</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR master mix&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>#4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&nbsp ;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Filtre pour bouteille</td><td>Corning</td><td>#430513</td><td>0.2 &mu ; L</td></tr></tbody></table>

collection de serum et libre feeder-mouse embryonic stem cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

La capacité des cellules souches embryonnaires (CSE) et des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à générer divers types de cellules a ouvert de nouvelles voies dans le domaine de la médecine régénérative. Cependant, malgré leurs avantages, le potentiel tumorigène des CSE et des CSPi a longtemps été un obstacle pour les applications cliniques. Il est intéressant de noter qu’il a été démontré que les CSE produisent plusieurs facteurs solubles qui peuvent favoriser la régénération des tissus et retarder le vieillissement cellulaire, ce qui suggère que les CSE et les CSPi peuvent également être utilisées comme méthode d’intervention acellulaire. Par conséquent, la méthode de récolte d’un milieu conditionné à des cellules souches embryonnaires de souris (mESC-CM) avec une contamination minimale des composants sériques (sérum fœtal bovin, FBS) et des cellules nourricières (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) a été fortement demandée. Ici, la présente étude démontre une méthode optimisée pour la collecte de mESC-CM dans des conditions sans sérum et sans mangeoire, et pour la caractérisation de mESC-CM à l’aide de lectures multiples associées à la sénescence. Ce protocole fournira une méthode pour collecter des facteurs sécrétoires spécifiques des CSEm purs sans contamination du sérum et des mangeoires.

A l&#39; origine, mESCs sont maintenus sur un dispositif d&#39; alimentation en milieu MEF MESC avec du FBS et d&#39; autres suppléments (Figures 1A et 2A). CM ont été recueillies auprès de mESCs réduit Sérum médias sans couche d&#39;alimentation, FBS, ou d&#39; autres suppléments (figures 1B et 2B). Cette condition de culture nous permet de recueillir MESC spécifique milieu conditionné sans contamination potentielle par...

Ce protocole fournit une méthode pour la collecte de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) de moyenne Climatisé (MESC-CM) dérivé de sérum (sérum fœtal bovin, FBS) - et d&#39;alimentation (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) conditions sans gluten pour une cellule approche -free. Il peut être applicable pour le traitement du vieillissement et de maladies associées au vieillissement.

Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Les objectifs généraux de ce protocole sont de collecter un milieu conditionné à partir de cellules souches embryonnaires de souris dans des conditions de culture sans sérum et sans feeder et de caractériser les fonctions biologiques de ce milieu. Cette procédure fournit des informations sur l’activité anti-sénescence des facteurs solubles sécrétés à partir de cellules souches embryonnaires de souris pour le développement d’une approche thérapeutique sûre et sans cellule pour les maladies liées à l’âge. La démonstration de cette procédure sera faite par le Dr Yun-Ui Bae, professeur de recherche de mon laboratoire.Dans une cagoule de sécurité biologique, traitez une culture cellulaire de fibroblaste embryonnaire de souris ou MEF avec 20 millilitres de milieu MEF complété par de la mitomycine C dans une boîte de culture cellulaire de 15 centimètres pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS et détachez-les avec trois millilitres de trypsine EDTA pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Neutraliser la trypsine avec six millilitres de milieu MEF frais lorsque les cellules se sont soulevées

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l'activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l'auto-renouvellement et la pluripotence.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

Cette vidéo présente une méthode pour générer des précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Le protocole implique la culture des cellules souches dans des milieux contenant des inhibiteurs de petites molécules spécifiques, qui facilitent la prolifération et l’agrégation des cellules souches en corps embryoïdes (EB). Par la suite, les EB sont dissociés avec des enzymes et plaqués sur des puits de plaque de culture recouverts de protéines...

Génération de précurseurs d’interneurones corticaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Cette vidéo présente une méthode de génération in vitro de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de cellules souches embryonnaires de souris (mESC). Les CSEm sont cultivées en suspension pour former des corps embryoïdes (EB), qui sont ensuite guidés pour se différencier en NPC via un traitement à l’acide rétinoïque dans une culture adhérente.

Technique de génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Sérum utilisé dans les cultures d'embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d'expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Les cellules souches embryonnaires de souris peuvent être différenciées en cellules T in vitro à l’aide du système de co-culture OP9-DL1. Le succès de cette procédure nécessite une attention particulière à l’entretien des réactifs/cellules et des étapes clés sensibles à la technique. Nous discutons ici de ces paramètres critiques et fournissons un protocole détaillé pour encourager l’adoption de cette technologie.

Dérivation des cellules T In Vitro De la souris les cellules souches embryonnaires

Ce protocole décrit en détail la méthode de génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires à l’aide d’une méthode monocouche sans sérum. Ces progéniteurs peuvent être utilisés pour dériver des types de cellules neurales matures ou pour étudier le processus de spécification neuronale et se prêtent à la mise à l’échelle de formats multipuits pour le criblage de composés.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Structure-fonction des études chez la souris à l&#39;aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d&#39;échange

Cet article décrit un protocole pour efficacement dérivent et la culture de lignées de cellules souches pluripotentes embryonnaires de souris au stade de blastocyste.

Dérivation de lignées de cellules souches provenant d’embryons préimplantatoires souris

Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

Apprenez à collecter le milieu conditionné par des cellules souches embryonnaires de souris sans sérum ni nourricier. Cette méthode révèle les propriétés anti-sénescence des facteurs solubles pour des applications thérapeutiques sans cellules.

Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule (Vidéo) | JoVE Journal

/search?query=PCR%20quantitative%20apr%C3%A8s%20transcription%20inverse

Collection de Serum et libre Feeder-Mouse Embryonic Stem Cell conditionné moyenne pour une approche sans cellule

Explorer plus de vidéos