Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

Les objectifs généraux de cette procédure sont d'isoler et de caractériser une population inhabituelle de cellules intraépithéliales, les lymphocytes T gamma delta, à partir d'un échantillon de brosse endocervicale humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la compréhension des événements immunitaires au sein du compartiment intraépithélial endocervical, afin de faciliter la conception de stratégies efficaces pour prévenir les infections. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit un outil puissant et efficace pour l'étude des lymphocytes T gamma delta intraépithéliaux endocervicaux, in vitro.

La procédure sera démontrée par Laura Romero, une chargée de recherche sénior de mon laboratoire. Immédiatement après le prélèvement, placez le tube contenant le cytobrossage sur de la glace. Dans l'heure suivant le prélèvement, vortexez le tube contenant le cytobrossage pendant quatre impulsions de 10 secondes chacune.

Ensuite, centrifuger le tube et retirer soigneusement la brosse sans perturber la palette. Puis, ajouter un millilitre de milieu IMDM aux cellules et placer le tube sur de la glace. Placer la cytobrosse au-dessus d'un tamis cellulaire de 100 millimètres dans un tube conique de 50 millilitres, et rincer la brosse avec 20 millilitres de milieu IMDM frais.

Centrifuger le lavage. Resuspendre le culot dans un millilitre de milieu IMDM frais, puis rassembler ce lavage avec les cellules présentes dans le tube initial de collecte au cytobrossage. Pour analyser les cellules endocervicales par cytométrie en flux, aliquoter de une à trois fois 10 à la puissance 5 cellules dans 100 microlitres de tampon fax par tube de cinq millilitres, puis marquer les cellules avec les anticorps et le colorant de viabilité d'intérêt pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.

À la fin de l'incubation, laver les cellules dans un millilitre de tampon fourni avec le kit. Après centrifugation des cellules, éliminer complètement le surnageant. Utiliser des billes et les anticorps témoins IgG appropriés pour régler les contrôles de compensation.

Ensuite, chargez le premier tube et définissez la fenêtre sur la population totale de cellules endocervicales dans un nuage de points de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale, puis excluez les doublets cellulaires. Excluez les cellules mortes selon leur expression du colorant de viabilité, en ciblant les cellules vivantes positives pour CD45 et positives pour CD3. Les cellules positives pour gamma delta un et gamma delta deux sont définies comme les sous-populations de cellules positives pour CD3 exprimant le TCR gamma delta.

Pour isoler les cellules T gamma delta par isolation magnétique, resuspendez jusqu'à 1 × 10⁷ cellules endocervicales fraîchement recueillies dans 40 µL de tampon du kit MicroBeads TCR gamma delta. Conformément aux instructions du fabricant pour le protocole de marquage en deux étapes, étiquetez les cellules avec l'anticorps anti-TCR gamma delta marqué par un haptène, puis avec les MicroBeads conjugués à la FITC anti-haptène pendant 15 minutes à une température de 4 à 8 °C. À la fin de l'incubation, lavez les cellules dans 1 mL de tampon du kit et décantez complètement le surnageant.

Ressuspendre les cellules dans 500 microlitres de tampon fourni avec le kit, puis appliquer la suspension cellulaire directement sur une colonne de billes magnétiques placée dans l'aimant séparateur approprié, en récupérant l'écoulement dans un nouveau tube. Une fois que toutes les cellules ont traversé la colonne, laver la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon frais, puis rassembler les lavages avec les cellules récupérées. Pour collecter les cellules T gamma delta, transférer la colonne dans un tube conique et utiliser le piston de la colonne pour éluéer les cellules T à l’aide d’un millilitre de tampon frais.

Pour isoler les cellules T gamma delta par tri cellulaire activé par fluorescence, marquez les cellules avec un colorant de viabilité, dans le panel d'anticorps comme vient de l'être démontré. Ensuite, triez les cellules selon leur viabilité, et leur positivité pour CD45, CD3 et gamma delta. Une population unique de cellules T exprimant gamma delta V1 peut être facilement détectée dans des échantillons cellulaires humains d'endocol utérin.

L'analyse phénotypique détaillée des cellules positives pour CD3 et gamma delta une fois sélectionnées révèle que la majorité de ces cellules sont négatives pour CD4 et CD8. La séparation par billes magnétiques des cellules endocervicales, comme vient de l'être démontré, permet d'obtenir une population purifiée à près de 98 % de ces cellules TCR gamma delta. Ce degré de pureté peut également être atteint par tri cellulaire activé par fluorescence, ce qui valide l'utilisation de l'une ou l'autre technique pour l'isolement des lymphocytes T gamma delta endocervicaux.

Curieusement, l'analyse des cellules intraépithéliales endocervicales et des cellules T gamma delta, prélevées chez des patientes infectées par le VIH et des témoins donneurs sains, montre une légère diminution du nombre et de la viabilité de ces cellules importantes chez les individus infectés par le VIH. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de traiter rapidement l'échantillon et de maintenir les cellules sur de la glace tout au long de l'ensemble du protocole afin de préserver une bonne viabilité cellulaire.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que le tri de cellules uniques combiné à une PCR multiplex à haut débit et haute sensibilité, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les voies inflammatoires et de signalisation au sein du compartiment intraépithélial endocervical. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du VIH et des maladies infectieuses pour explorer de nouveaux marqueurs cellulaires de la vulnérabilité muqueuse. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des lymphocytes intraépithéliaux à partir d'un échantillon de brosse endocervicale humain.