Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

Les objectifs généraux de cette procédure sont d’isoler et de caractériser une population de cellules T gamma delta intra-épithéliales non conventionnelles à partir d’un échantillon de brosse endocervicale humaine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la compréhension des événements immunitaires dans le compartiment intra-épithélial endocervical, afin d’aider à la conception de stratégies efficaces pour prévenir les infections. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un outil puissant et efficace pour l’étude des lymphocytes T gamma delta intra-épithéliales endocervicales, in vitro.

Laura Romero, une associée de recherche principale de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Immédiatement après le prélèvement, placez le tube contenant la cytobrosse sur de la glace. Dans l’heure qui suit le prélèvement, faites un tourbillon dans le tube contenant la cytobrosse pendant quatre impulsions de 10 secondes.

Ensuite, centrifugez le tube et retirez délicatement le pinceau sans déranger la palette. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu IMDM dans les cellules et placez le tube sur de la glace. Placez la cytobrosse sur une passoire de cellules de 100 millimètres dans un tube conique de 50 millilitres et lavez la brosse avec 20 millilitres d’IMDM frais.

Centrifugez le lavage. En remettant la palette en suspension dans un millilitre d’IMDM frais, et en pool avec le lavage avec les cellules dans le tube de collecte de la cytobrosse d’origine. Pour analyser les cellules endocervicales par cytométrie en flux, aliquote une à trois fois 10 à cinquième cellules dans 100 microlitres de tampon de fax par tube de cinq millilitres, et étiquetez les cellules avec les anticorps et le colorant de viabilité d’intérêt pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans un millilitre de tampon du kit. Après avoir fait tourner les cellules, décantez complètement le surnageant. Utilisez des billes et les anticorps de contrôle IgG appropriés pour régler les contrôles de compensation.

Ensuite, chargez le premier tube et placez la porte sur la population totale de cellules endocervicales dans un nuage de points côte à côte, suivi de l’exclusion des doublets de cellules. Exclure les cellules mortes en fonction de leur viabilité, en fonction de leur expression de colorant de viabilité, en tenant compte des cellules CD45 positives et CD3 positives vivantes. Les cellules positives gamma delta un et gamma delta deux sont définies comme les sous-populations de cellules positives CD3 qui expriment le TCR gamma delta.

Pour isoler les lymphocytes T gamma delta par isolation par billes magnétiques, rémettez en suspension jusqu’à une fois 10 à la septième cellules endocervicales fraîchement récoltées dans 40 microlitres de tampon du kit TCR gamma delta MicroBead. En suivant les instructions du fabricant pour le protocole de coloration en deux étapes, étiquetez les cellules avec l’anticorps anti-TCR gamma-delta-haptène, suivi de microbilles conjuguées FITC anti-haptènes pendant 15 minutes à quatre à huit degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans un millilitre de tampon du kit et décantez complètement le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de kit et appliquez la suspension de cellule directement sur une colonne de billes magnétiques placée dans l’aimant séparateur approprié, en recueillant le flux dans un nouveau tube. Lorsque toutes les cellules ont traversé la colonne, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon frais et regroupez les lavages avec les cellules collectées. Pour collecter les lymphocytes T gamma delta, transférez la colonne dans un tube conique et utilisez le piston de la colonne pour rincer les lymphocytes T de la colonne avec un millilitre de tampon frais.

Pour isoler les lymphocytes T gamma delta par tri cellulaire activé par fluorescence, étiquetez les cellules avec un colorant de viabilité, dans le panel d’anticorps, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, triez les cellules en fonction de leur colorant viable et de leur positivité CD45, CD3 et gamma delta. Une population unique de lymphocytes T exprimant le gamma delta V1 peut être facilement détectée dans des échantillons de cellules endocervicales humaines.

L’analyse phénotypique détaillée des cellules gamma delta un positives CD3 positives révèle que la majorité de ces cellules sont CD4 et CD8 négatives. La séparation magnétique des cellules endocervicales, comme nous venons de le démontrer, entraîne la purification d’une population pure à près de 98 % de ces cellules gamma delta du TCR. Ce niveau de pureté peut également être atteint par le tri cellulaire activé par fluorescence, validant l’utilisation de l’une ou l’autre technique pour l’isolement des cellules T gamma delta endocervicales.

Il est intéressant de noter que l’analyse des cellules intra-épithéliales endocervicales, les cellules T gamma delta, prélevées sur des patientes infectées par le VIH et des témoins de donneurs sains, démontre une légère réduction du nombre et de la viabilité de ces cellules importantes chez les personnes infectées par le VIH. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de traiter rapidement l’échantillon et de garder les cellules sur la glace tout au long de la procédure, afin de maintenir une bonne viabilité cellulaire.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le tri de cellules uniques combiné à une PCR multiplex à haut débit, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les voies inflammatoires et de signalisation dans le compartiment intra-épithélial endocervical. Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du VIH et des maladies infectieuses pour explorer de nouveaux marqueurs cellulaires de la vulnérabilité des muqueuses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des lymphocytes intra-épithéliales à partir d’un échantillon de brosse endocervicale humaine.