Utilisation d'un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

L’objectif global de ce test fonctionnel in vitro est d’évaluer divers aspects de la phagocytose médiée par la FC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunohématologie et de la médecine transfusionnelle sanguine, telles que la signification clinique des auto-anticorps et des allo-anticorps contre les globules rouges. Cette technique fournit un test biologique fonctionnel qui peut être réalisé in vitro pour prédire le résultat de la transfusion chez les patients ayant des anticorps préformés contre les globules rouges.

Cindy Tong, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être dangereux et que des précautions telles que le port de blouses et de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir obtenu un à deux échantillons de sang total de 10 millilitres d’un donneur sain dans des tubes vacutainer contenant du citrate acide dextrose par ponction veineuse, les tubes sont placés dans une enceinte de biosécurité de classe II et le sang est dilué dans un rapport de un pour un dans un milieu complet chaud.

Ensuite, pipetez lentement les cellules sanguines sur les côtés d’un tube à centrifuger sur le gradient de densité à température ambiante, en prenant soin de ne pas mélanger les couches. Séparez les cellules par centrifugation. Ensuite, jetez la couche supérieure de plasma et utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer le PBMC contenant la couche leucocytaire dans un nouveau tube de 15 millilitres.

Lavez les PBMC isolés trois fois dans du PBS, en remettant les cellules en suspension dans trois à sept millilitres de milieu après la troisième centrifugation. Après le comptage, diluez les cellules à 1,75 fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration dans un milieu complet et ensemencez 400 microlitres de cellules dans chaque puits d’une lame à huit chambres pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 avec une humidité complète. Pour opsoniser les globules rouges R2R2, lavez d’abord les globules rouges trois fois dans du PBS.

Diluer la pastille R2R2 après la troisième centrifugation dans un rapport de un à un avec des anticorps polyclonaux anti-D du sérum humain pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius avec mélange intermittent. À la fin de l’opération, retirez les cellules de l’incubateur, puis lavez-les trois fois de plus dans du PBS comme nous venons de le démontrer. Remettez la pastille en suspension à 1,25 % de volume à volume dans un milieu RPMI complet.

Ensuite, remplacez le surnageant de chaque puits de la lame à huit chambres par 400 microlitres de cellules R2R2 opsonisées pendant deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez les adaptateurs de lames pour retirer les chambres, en tamponnant l’excédent de R2R2 avec une serviette en papier. Maintenant, remplissez un bécher de 100 millilitres de PBS et trempez lentement chaque lame 30 à 40 fois dans la solution saline pour éliminer la majorité du R2R2 non phagocyté.

Après séchage, fixez les lames dans du méthanol à 100 % pendant 45 secondes et laissez sécher les cellules avant de monter les échantillons avec des lamelles. Le lendemain, chargez chaque lame sur un microscope à contraste de phase avec une lentille d’objectif 40X et comptez manuellement au moins 200 monocytes et le nombre de R2R2 phagocytés dans chaque monocyte à l’aide d’un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de cellules R2R2 phagocytées par échantillon. L’immunoglobuline intraveineuse se lie aux récepteurs FC et les bloque, inhibant la phagocytose de manière dose-dépendante, avec une inhibition de près de 100 % observée à partir de 200 microgrammes de concentrations d’immunoglobuline intraveineuse par millilitre et avec une inhibition presque nulle observée à des concentrations inférieures à 0,5 microgramme de l’inhibiteur.

Lorsque les indices phagocytaires sont normalisés au témoin positif R2R2 comme une inhibition de 0 %, une courbe d’inhibition avec une CI 50 de trois microgrammes par millilitre peut être déterminée. Avec l’expérience, la microscopie à contraste de phase peut être utilisée pour distinguer les monocytes des globules rouges contaminants et les vacuoles des globules rouges phagocytés. Les amas de cellules denses et les débris doivent être évités lors de la quantification, ainsi que l’opsonisation excessive des globules rouges R2R2, ce qui peut entraîner une phagocytose accrue qui surcharge l’intérieur des monocytes et interfère avec une analyse phagocytaire précise.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunocytochimie ou l’immunofluorescence à l’aide de la microscopie confocale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’expression des protéines phagocytaires, les interactions entre les globules rouges et la compartimentation. Grâce à son développement initial et à son optimisation ultérieure, cette technique éclairera la façon dont les chercheurs dans les domaines de la médecine transfusionnelle et de la biologie cellulaire explorent les systèmes d’opsonisation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de monocouche de monocytes pour évaluer les types d’interaction d’anticorps qui provoquent la phagocytose.