Name: Utilisation dun monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Découvrez l'essai monocouche de monocytes pour évaluer la phagocytose médiée par les récepteurs Fcγ en immunohématologie. Cette méthode in vitro utilise des monocytes primaires isolés du sang pour prédire les résultats transfusionnels chez les patients présentant des anticorps préformés.

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Les auteurs remercient la Société canadienne du sang pour l’attribution d’un programme de bourses d’études supérieures à T.N.T. Cette recherche a reçu le soutien financier du Centre d’innovation de la Société canadienne du sang, financé par le gouvernement fédéral (Santé Canada) et les ministères provinciaux et territoriaux de la Santé. Les opinions exprimées dans le présent document ne reflètent pas celles des gouvernements fédéral, provinciaux ou territoriaux du Canada.

Obtenir l&#39;approbation pour l&#39;utilisation d&#39;échantillons humains par l&#39;éthique de la recherche conseil / comité d&#39;examen institutionnel, et obtenir le consentement signé de tous les donneurs humains. Le MMA peut également être effectuée en utilisant des PBMC de souris d&#39;une manière similaire à l&#39;essai humain, après l&#39;approbation utilisation des animaux d&#39;éthique. MMA utilise des techniques de culture tissulaire aseptiques. NOTE: Voir Figure 1. NOTE: Bien que nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un bioconfinement armoire de niveau 2 au cours de l&#39;essai pour maintenir une technique aseptique, la méthode est seulement un &quot;court terme&quot; méthode de culture, il n&#39;y a pas vraiment assez de temps pour les bactéries de contaminer le dosage. Par conséquent, si un bioconfinement armoire de niveau 2 n&#39;existe pas, plutôt que d&#39;acheter un juste pour ce test, le test pourrait être effectué en dehors d&#39;une armoire bioconfinement, sur un banc ouvert. L&#39;utilisation d&#39;un incubateur à 37 ° avec 5% de CO 2, cependant, ne sont pas une option et doit être utilisé pourdes résultats optimaux. 1. mononucléaires du sang périphérique de cellules d&#39;isolement <ol><li> Obtenir du sang entier humain provenant d&#39;un donneur sain ou d&#39;un patient par l&#39;intermédiaire d&#39;une ponction veineuse en utilisant des tubes Vacutainer contenant de l&#39;acide citrate dextrose (ACD), un anticoagulant (jaune-tubes supérieurs). REMARQUE: Le sang entier peut être stocké dans l&#39; ACD à la température ambiante (18-22 ° C) pendant jusqu&#39;à 36 heures avant de procéder à l&#39;étape suivante 11. Normalement, 1-2 10 mL vacutainer tubes de sang total sont suffisants pour le dosage. </li><li> On dilue le sang entier 1: 1 v / v dans un milieu RPMI complet chaud (RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 20 mM d&#39;HEPES, et 0,01 mg / ml de gentamicine). </li><li> Isoler les cellules mononucléées du sang (PBMC) à partir du sang total dilué en utilisant la centrifugation en gradient de densité, tel que recommandé par le fabricant (voir la liste des matériaux). Couche du sang dilué très lentement sur le gradient de densité (réchauffé à la température ambiante, 18-22 ° C). REMARQUE: Réduire la quantité de mixing à l&#39;interface pour la séparation optimale du sang en superposant soigneusement le mélange de sang dans un goutte à goutte ou à l&#39;aide d&#39;une pipette. <ol><li> Laisser le mélange de sang à la couche lentement sur la partie supérieure du gradient de densité en plaçant la pointe de la pipette proche du gradient de densité et en permettant le mélange de sang à couler sur le côté du tube très lentement. </li><li> En fonction de l&#39;échelle de l&#39;expérience, la couche 10 ml de mélange de sang au-dessus de 3 ml de gradient de densité (dans un tube de 15 ml) ou de la couche 35 ml de mélange de sang au-dessus de 15 ml de gradient de densité (dans 50 ml tube). Typiquement, 10 ml de sang entier on obtient 10 millions de PBMC, avec une certaine variation donneur de donneur. Remarque: il est important qu&#39;il n&#39;y ait pas de mélange du mélange du sang avec le gradient de densité. Le mélange de sang devrait couche sur le gradient de densité et augmenter lentement jusqu&#39;à ce que tout le sang est au-dessus du gradient de densité. </li><li> Centrifuger le mélange en couches à 700 g pendant 30 min sans freins. Le centrmélange ifuged devrait se séparer en 5 couches (de haut en bas): plasma, buffy coat (contenant CMSP), matériau de gradient de densité, granulocytes et hématies. </li><li> Retirer et jeter la majorité du plasma et de récupérer soigneusement le contenu buffy coat (CMSP) dans un nouveau tube de 15 ml à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur et une ampoule d&#39;aspiration. REMARQUE: Le retrait de la couche leuco-plaquettaire est effectivement fait en appliquant une aspiration sur la pipette Pasteur tout en effectuant un mouvement circulaire autour de l&#39;extérieur de la couche, avec la pointe de la pipette contre le tube. </li></ol></li><li> On lave les PBMC isolées à trois reprises pH 7,3 tampon phosphate salin (PBS) par centrifugation à 350 g pendant 10 minutes (avec des freins pleins) entre les lavages. Reconstituer le culot PBMC dans un milieu complet RPMI. En fonction de la taille de la pastille, 3-7 ml de milieu est suffisante. </li><li> Comptez le PBMC en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. compter Seules les cellules qui ne sont pas colorées par le bleu trypan. Reconstitute PBMC à 1.750.000 cellules / ml dans un milieu RPMI complet. </li><li> Seed 400 pi (700.000 cellules) dans chaque puits d&#39;une lame de 8 chambre. Incuber la lame dans un 37 ° C, entièrement humidifiée incubateur de culture tissulaire (supplémenté avec 5% de CO2) pendant 1 heure pour permettre aux monocytes / macrophages adhèrent. </li></ol> 2. Pré-traitement des monocytes adhérées REMARQUE: Cette étape est nécessaire uniquement si la recherche de moyens pour inhiber ou améliorer la phagocytose. <ol><li> Pré-traitement adhéré monocytes avec tout médicament (s) ou le composé (s) d&#39;intérêt. Reconstituer le médicament (s) ou d&#39;un autre matériau d&#39;essai à la concentration souhaitée en utilisant un milieu RPMI complet. REMARQUE: par exemple, 200 pg / ml d&#39;IgIV est généralement utilisé pour produire une inhibition de 95-100% de la phagocytose lors de l&#39;utilisation des monocytes humains. </li><li> Aspirer et éliminer le surnageant contenant toutes les cellules non adhérentes de la glissière 8-chambre après 1 heure d&#39;incubation (après l&#39;étape 1.6). Remplacez-le par 400ul d&#39;un médicament ou d&#39;un autre traitement et incuber pendant 1 h à 37 ° C. <ol><li> Lors de l&#39;aspiration et le remplacement de solutions dans la glissière 8-chambre, assurez-vous de contrôler l&#39;écoulement des fluides de sorte que les cellules faiblement adhérentes ne décollent. En outre, travailler avec seulement 2-3 puits vides à la fois et éviter le dessèchement des puits. NOTE: En règle générale, chaque traitement est réalisé en triple exemplaire technique. </li></ol></li></ol> 3. Opsonisation de R 2 R 2 globules rouges NOTE: Le R 2 R 2 utilisé ici sont obtenus à partir de la collection Blood Center (Société canadienne du sang), mais ils sont également disponibles dans le commerce. Opsonisé R 2 R 2 globules rouges sont utilisés en tant que témoin positif pour la phagocytose à médiation par FcyR. Naïf R 2 R 2 doit être stocké dans une solution de Alsever (pour prolonger la durée de vie) à 4 ° C pendant 1 mois. La solution de Alsever est fait maison et composé de 0,8% P / v de citrate trisodique (dihydraté), 1,9% p / v de dextrose, 0,42% en poids / chlorure de sodium v ​​et 0,05% p / v d&#39;acide citrique (monohydraté). Si R 2 R 2 cellules ne sont pas disponibles, d&#39; autres cellules phénotypées Rh, tels que R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 r, r ou R 2, peuvent être utilisés. <ol><li> Lavage R 2 R 2 (CDE / CDE) de globules rouges dans du PBS d&#39; un montant total de trois fois en utilisant une centrifugation à 350 g pendant 5 min à chaque fois . NOTE: La quantité de globules rouges nécessaires dépend de la taille expérimentale et peut être rétro-calculé. Lavez-vous toujours une quantité excessive de globules rouges, car les globules rouges sont perdus lors de chaque lavage due à la lyse ou pendant l&#39;élimination du surnageant. Par exemple, dans une expérience de 5 traitements et 2 contrôles, toutes les conduites en triple techniques, il y a un total de 21 puits. 21 puits avec 400 pl / puits de 1,25% mélange RBC indique que 105 pi de emballés, opsonisé RBC sont nécessaires. 200 pi de RBC doit être d&#39;abord lavé et 150 &amp; #181, L doit être opsonisé pour s&#39;assurer qu&#39;il y ait une quantité suffisante de globules rouges pour l&#39;étape de phagocytose. </li><li> Opsoniser le lave R 2 R 2 culot avec 1: 1 v / v anticorps polyclonaux anti-D à partir de sérum humain et on incube pendant 1 h à 37 ° C, sous agitation intermittente. Remarque: si des anticorps polyclonaux anti-D ne sont pas disponibles, il est possible d&#39;utiliser des anticorps monoclonaux anti-D, qui sont disponibles dans le commerce ou anti-D qui est normalement utilisé pour la prophylaxie immunitaire Rh, qui peuvent être obtenus à partir des banques ou des transfusions sanguines prestations de service. les tests d&#39;optimisation doit être effectuée au début, lors de la mise en place du test, et chaque fois que la commutation beaucoup d&#39;anticorps polyclonaux un-titré ou le passage à un anticorps monoclonal. Cela permet d&#39;identifier la concentration ou le volume de l&#39;anti-D optimale requise pour un test de Coombs (IAT) Résultat entre 3+ et 4+ et un résultat de phagocytose de 70 à 90 entre les globules rouges phagocytés par 100 monocytes comptées. </li><li> Laver le opsonisentd R 2 R 2 un total de trois fois en PBS par centrifugation à 350 g pendant 5 min à chaque fois . REMARQUE: opsonisation avec succès R 2 R 2 peut être confirmée en effectuant une TMI indirecte. En bref, les anticorps anti-humains polyclonaux secondaires sont ajoutés pour lier des anticorps opsonisation primaires sur les surfaces de RBC, et le signal amplifié peut être observé sous la forme d&#39;hémagglutination. Un protocole du fabricant détaillée peut être trouvée dans le fichier des matériaux supplémentaires. </li><li> Reconstituer le lave R 2 R 2 pastille à 1,25% v / v en utilisant du milieu RPMI complet. REMARQUE: L&#39; excès opsonisé R 2 R 2 peut être stocké dans une solution de Alsever à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 4. La phagocytose à médiation par le récepteur Fc <ol><li> Aspirer le médicament ou le surnageant du milieu de la glissière 8-chambre et ajouter 400 ul de 1,25% v / v R 2 R 2 du mélange. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> à l&#39;arrièreer 2 h d&#39;incubation, retirez les chambres en utilisant les adaptateurs du fabricant. Tamponnez l&#39;excès de R 2 R 2 sur une serviette en papier. Assurez-vous que la lame ne se dessèche pas. </li><li> Remplir un bécher de 100 ml avec du PBS. Immerger et laver la lame en déplaçant lentement la lame avant et en arrière (environ 30-40 coups) pour éliminer la majorité des non-phagocyté R 2 R 2. </li><li> Retirer la lame du PBS. Tamponnez l&#39;excès de PBS en utilisant une serviette ou un tissu et de papier sécher à l&#39;air de la diapositive. </li><li> Fixer la lame séchée à l&#39;air dans 100% de methanol pendant 45 s. Ensuite, l&#39;air sec la lame fixe. NOTE: Les diapositives peuvent être fixés en utilisant une autre méthode qui est plus compatible pour la coloration aval, tels que la tache Grünwald-Giemsa 21 ou la tache Wright-Giemsa 22. </li><li> Monter la diapositive en utilisant un couvre-à-fait maison moyenne de Elvanol de montage (ou un autre support de montage disponible dans le commerce) et ajouter. NOTE: Elvanol milieu de montage est composé de 15% p / v polyvinyl résine d&#39;alcool et 30% v / v de glycerol dans du PBS. Le mélange est chauffé jusqu&#39;à ce que toute la résine soit dissoute et la glycérine est mélangé de façon homogène. Cela peut être remplacé par un autre support de montage dans le commerce. </li><li> Laisser le support sécher pendant la nuit avant la quantification. </li></ol> 5. Quantification de la phagocytose <ol><li> En utilisant un microscope à contraste de phase et un objectif 40X, quantifier manuellement la quantité d&#39;événements phagocytaires en comptant au moins 200 monocytes et le nombre de phagocyté R 2 R 2 au sein de ces monocytes. Avoir un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de R phagocyté 2 R 2. </li><li> Obtenir l&#39;indice phagocytaire moyenne en divisant le nombre de phagocyté R 2 R 2 par le nombre de monocytes et en multipliant par 100. exprimer les données sous forme de moyenne (indice de phagocytose) moyenne ± l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). </li&gt; </ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le MMA est une technique laborieuse qui exige une expertise à la fois dans la culture de tissus et la microscopie. Il y a plusieurs étapes essentielles pour assurer le succès: 1) la génération de la monocouche monocytes; 2) opsonisation des globules rouges, et 3) la quantification manuelle. La monocouche monocyte ne colle pas très fortement à la lame de la chambre, de sorte que le pH physiologique doit être maintenue tout au long de l&#39;essai 11 et un nombre suffisant de PBMC doit être semée. pipetage Vigoureuse, ce qui pourrait perturber les cellules adhérentes, devrait être évitée. Une approche est de toujours supprimer et ajouter des solutions du même coin de la chambre et de veiller à ce que le mouvement est lent et régulier. De même, lors de la dernière étape de lavage pour éliminer l&#39;excès de globules rouges, le mouvement devrait être lente et régulière. Cela garantit une perturbation minimale à la monocouche, tout en supprimant la majorité des hématies un-phagocyté. lavage inadéquat conduira à un fond élevé de globules rouges contaminants, ce qui rend qua manuelntification difficile. D&#39; autre part, les groupes R 2 R 2 , les globules rouges doivent être suffisamment opsonisées afin d&#39; obtenir un indice phagocytaire moyenne de 80 à 120 pour le contrôle de la phagocytose. Cette gamme de phagocytaire souhaité un équilibre entre la facilité de comptage (par exemple, monocytes avec plus de 5 phagocytées hématies sont difficiles à quantifier avec précision) et le maintien d&#39; une quantité adéquate de la phagocytose pour l&#39; analyse statistique. Le degré de opsonisation peut être confirmé par un IAT, et une lecture entre 3+ à 4+ est nécessaire. Le R 2 R 2 hématies doivent être jetés quand il y a excès de lyse pendant le lavage, lorsque le surnageant devient rouge foncé, ou quand une diminution significative de la phagocytose est observée dans des expériences en raison du vieillissement des cellules de stockage. Enfin, la quantification manuelle à l&#39;aide du microscope peut être difficile, surtout lorsque l&#39;on compare les chiffres entre le personnel de laboratoire et entre les expériences. En examinant le même domaine sur chaque puits, ou simplement en comptant plus de cellulesUn nombre plus uniforme peut être obtenue. formation Side-by-side avec un technicien expérimenté et l&#39;utilisation d&#39;un ensemble désigné de diapositives de formation est recommandé. Une critique majeure de la MMA est la subjectivité de l&#39;étape manuelle de quantification. Cependant, avec une formation adéquate, la cohérence peut être obtenue à travers différents compteurs. Une autre limitation est les différences donateurs à-donateurs intrinsèques monocytes capacités phagocytaires et en R 2 R 2 surface niveaux d&#39;expression de l&#39; antigène, ce qui est une source de variation de données lorsqu&#39;ils traitent avec des échantillons humains. D&#39;autres techniques alternatives sont disponibles pour l&#39;examen de la phagocytose FcyR médiée. La majorité des kits commerciaux utilisent la sortie fluorescente pour surveiller la phagocytose (par exemple, bioparticules, la protéine de fluorescence sensible au pH, ou des billes de latex fluorescentes IgG marqués). L&#39;utilisation de la sortie fluorescente n&#39;offre une quantification plus objective, mais on doit aussi conexaminer le disponibilité, le coût et la formation associée à l&#39;utilisation d&#39;un microscope à fluorescence ou d&#39;un cytomètre de flux, ainsi que la dépendance qui s&#39;ensuit sur des kits disponibles dans le commerce. Enfin, cet essai peut être modifié en fonction de la question de recherche. Par exemple, lors du test de l&#39; inhibition médicamenteuse de la phagocytose, les monocytes peuvent soit être pré-traitées ou co-incubées avec les médicaments et les globules rouges opsonisés ( par exemple, un test de compétition). La signalisation en aval des anticorps de sous-types différents, des anticorps chimères ou des constructions recombinantes peuvent également être testés. Avec les récentes percées dans le développement d&#39;un antigène nul universel de sang 24, le MMA pourrait être utilisé dans les écrans initiaux de ces hématies antigène nul avec divers anticorps pour déterminer s&#39;il est en effet une efficacité réduit dans le déclenchement de la phagocytose.

Le test de monocouche de monocytes (MMA) est un test in vitro développé à l’origine pour mieux prédire les résultats des transfusions sanguines chez les patients présentant des auto-anticorps ou des allo-anticorps dirigés contre les globules rouges (GR)1-5. En évaluant l’effet des anticorps anti-globules rouges dans la médiation de la phagocytose médiée par le récepteur Fcγ (FcγR) à l’aide de ce test in vitro, il est possible de prédire l’issue clinique in vivo. En effet, le MMA a été utilisé avec succès pour éviter la destruction immunitaire des globules rouges liés aux anticorps, malgré la transfusion de sang sérologiquement incompatible5. La procédure pré-transfusionnelle typique pour les tests de compatibilité, également appelée compatibilité croisée, implique des méthodes sérologiques qui comprennent le typage du sang du patient pour les antigènes ABO et Rh et le dépistage de la présence d’anticorps anti-globules rouges chez le patient6. Le sang compatible pour l’ABO/Rh est sélectionné et, si des anticorps sont présents, une tentative d’identification est faite afin que le sang pour la transfusion puisse être sélectionné davantage afin d’éviter ces antigènes. Un résultat de compatibilité croisée idéal se produit lorsque tout le sang du donneur est sérologiquement compatible avec le sang du patient, ce qui réduit le risque d’hémolyse post-transfusionnelle7. Cependant, ce système ne convient pas au petit groupe de patients qui sont devenus allo-immunisés à la suite de transfusions répétées ou d’une grossesse. Ces patients produisent des allo-anticorps contre des antigènes globulaires globulaires spécifiques. Certains produisent des anticorps contre des antigènes de très haute fréquence dans la population générale, et deviennent ainsi progressivement plus difficiles à croiser8,9. Pour ajouter à la complexité, tous les allo-anticorps ne sont pas cliniquement significatifs ; En d’autres termes, la liaison d’un allo-anticorps aux globules rouges détectés par un test sérologique n’entraîne pas nécessairement une hémolyse lorsque du sang incompatible avec l’antigène positif est transfusé. Le MMA a été développé à l’origine pour évaluer la signification clinique potentielle du sang sérologiquement incompatible dans un contexte de transfusion1-5.
Étant donné que l’hémolyse extravasculaire des globules rouges liés aux anticorps est connue pour être médiée par le système phagocytaire mononucléaire, les monocytes/macrophages primaires sont utilisés dans le développement de tests diagnostiques. Le premier test visant à étudier l’interaction des monocytes, des globules rouges et des anticorps a été publié en 1975, mais les conditions sous-optimales utilisées n’ont conduit qu’à la formation de rosettes (la liaison des globules rouges à la périphérie du monocyte), et aucune phagocytose n’a été observée10. Des modifications significatives ont été apportées au test par plusieurs groupes, ce qui a conduit à un test pour lequel le niveau de phagocytose des globules rouges liés aux allo-anticorps a pu être corrélé au résultat clinique de l’hémolyse1-5. Récemment, les conditions optimales de stockage des échantillons cliniques et l’optimisation supplémentaire des conditions de dosage ont été examinées afin d’améliorer l’utilité d’une compatibilité croisée clinique MMA à l’aide d’échantillons de patients autologues11.
Trois autres techniques de diagnostic ont été utilisées en plus de la MMA pour prédire les résultats des transfusions : le test de libération de 51Cr, le test de la rosette et le test de chimiluminescence (CLT). Dans le test de libération de 51Cr, le patient reçoit une injection de 51globules rouges de donneur marqués au Cr, et la demi-vie des globules rouges marqués est surveillée et est prédictive de la survie ou de la clairance post-transfusionnelle12,13. Comme cette méthode utilise des matières radioactives, elle est rarement pratiquée. Le test de la rosette consiste à mélanger et à incuber des monocytes avec des globules rouges et à quantifier le niveau de formation de la rosette (sans phagocytose)14. La signification clinique des anticorps in vivo implique une phagocytose active par les macrophages présents dans la rate et/ou le foie ; Ainsi, cette méthode ne fournit pas une lecture pertinente de la phagocytose. Le CLT utilise le luminol pour surveiller le sursaut oxydatif pendant la phagocytose monocytaire des globules rouges, car le luminol devient fluorescent en bleu lorsqu’il est oxydé dans le phagosome15. Cette méthode est bonne, mais la contamination par les neutrophiles peut fausser la lecture. Des comparaisons parallèles ont été effectuées pour évaluer la sensibilité, la praticité et la reproductibilité des quatre méthodes disponibles, et le CLT et le MMA ont été classés supérieurs16. Cependant, le CLT a été principalement utilisé dans l’évaluation de la maladie hémolytique du fœtus et du nouveau-né (HDFN), et le pH optimal du test de 8,0 pourrait compromettre le niveau de phagocytose11.
En plus de son utilité diagnostique et clinique, le MMA a été modifié à d’autres fins de recherche. En effet, le MMA peut non seulement servir de test fonctionnel pour corriger les divergences entre la sérologie et la biologie, mais il a également été utilisé pour étudier rétrospectivement la cause de l’hémolyse après un traitement par immunoglobulines intraveineuses (IgIV)17. Il a également été utilisé pour examiner la structure-fonction des inhibiteurs chimiques de la phagocytose18-20 médiée par FcγR et pour étudier la signalisation en aval de la phagocytose21 médiée par FcγR. Dans notre laboratoire, en plus d’utiliser un MMA humain, nous développons un MMA murin en utilisant des cellules mononucléées primaires du sang périphérique (PBMC) de souris et des globules rouges autologues. La raison d’être est de cribler des anticorps capables d’induire une phagocytose médiée par FcγR comme intermédiaire au développement d’un modèle murin d’anémie hémolytique auto-immune (AIHA) in vivo (données non publiées). Les différentes modifications se concentrent sur différents aspects de l’interaction de l’anticorps IgG et du FcγR qui induisent la phagocytose.

<table><tbody><tr><td>Citrate acide dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin Multicell&nbsp ;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr> <tr><td>Phosphate salin tamponné</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr> 8 <tr><td>chambres</td><td>lames Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE) globules</td> <td>rougesSociété canadienne du sang</td><td>Disponible dans le commerce (p. ex., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td>Anti-D polyclonal à partir de sérum humain Gamma Biologics DIN 02247724 Peut être remplacé par un anti-D monoclonal disponible dans le commerce ou par de l’immunoglobuline Rh 100 % méthanol Caledon 6700-1-42 Résine d’alcool polyvinylique <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Peut être remplacé par une monture disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>UltraPure glycérine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>En option pour IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

utilisation d&#39;un monocytes monocouche assay pour évaluer phagocytose fcy receptor médiée

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Bien qu’il ait été développé à l’origine pour prédire les résultats transfusionnels de sang sérologiquement incompatible, le test monocouche de monocytes (MMA) est un test in vitro très polyvalent qui peut être modifié pour examiner différents aspects de la phagocytose médiée par les anticorps et les récepteurs Fcγ (FcγR) dans des contextes de recherche et cliniques. Le test utilise des monocytes adhérents provenant de cellules mononucléées du sang périphérique isolées du sang total de mammifères. Le MMA a été décrit pour être utilisé dans des investigations humaines et murines. Ces monocytes expriment des FcγRs (par exemple, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB et FcγRIIIA) qui sont impliqués dans les réponses immunitaires. Le MMA exploite le mécanisme des interactions médiées par FcγR, en particulier la phagocytose, où les globules rouges (GR) sensibilisés aux anticorps adhèrent et/ou activent les FcγR et sont ensuite phagocytés par les monocytes. In vivo, ce sont principalement des macrophages tissulaires présents dans la rate et le foie qui effectuent une phagocytose médiée par FcγR des globules rouges opsonisés par des anticorps, provoquant une hémolyse extravasculaire. En évaluant le niveau de phagocytose à l’aide de la MMA, différents aspects du processus médié par le FcγR in vivo peuvent être étudiés. Parmi les applications de la MMA, citons la prédiction de la pertinence clinique des allo- ou auto-anticorps dans un contexte de transfusion, l’évaluation des médicaments candidats qui favorisent ou inhibent la phagocytose, et la combinaison du test avec la microscopie fluorescente ou l’immunoblot occidental traditionnel pour étudier les effets de signalisation en aval des médicaments ou des anticorps engageant le FcγR. Parmi les limites, citons la pénibilité de cette technique, qui prend une journée entière du début à la fin, et l’exigence d’une approbation éthique de la recherche pour travailler avec du sang de mammifère. Cependant, avec de la diligence et une formation adéquate, les résultats de la MMA peuvent être obtenus dans un délai de 24 heures.

En suivant les étapes cruciales dans la figure 1 et la procédure décrite ci - dessus, le MMA peut être réalisée de façon reproductible. IVIG a été utilisé comme exemple pour l&#39;inhibition de la phagocytose dans la figure 2. IVIG est connue pour se lier et bloquer les récepteurs Fc, inhibant ainsi le résultat en aval de la phagocytose. En dosant la quantité de IVIG utilisée, une inhibition dépendante de la dose est observée, dans lequel des concentrations supérieures à 200 ug / ml a donné lieu à près de 100% d&#39; inhibition et des concentrations inférieures à 0,5 pg / ml n&#39;a pas inhibé tout (figure 2A). Lorsque les indices de phagocytaires sont transformées et normalisées par rapport à R 2 R 2 en tant que contrôle positif 0% d&#39; inhibition, une courbe d&#39;inhibition avec une CI50 de 3 pg / ml peut être déterminée (figure 2B). En plus d&#39;effectuer le test régulièrement, Quantification de l&#39;essai peut parfois être difficile. Figure 3 est une collection de contraste de phase des images de microscopie de différentes diapositives MMA. Avec l&#39; expérience de la microscopie, on peut distinguer un monocytes d&#39;un RBC contaminant (Figure 3D), ou une vacuole d&#39;une RBC phagocyté (figure 3B). Grappes denses de cellules et / ou les débris doivent être évités pendant la quantification (figures 3E et F). En outre, il faut éviter de trop-opsonisation R 2 R 2 RBC, ce qui conduirait à une phagocytose accrue qui overcrowds l&#39;intérieur des monocytes et interfère avec une quantification précise (figure 3C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la MMA. Une description étape par étape des étapes cruciales dans le MMA: isoler PBMC à partir de sang entier, alimentant le monocyt adhérées avec opsonisé R 2 R 2, et le lavage des lames de chambre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figure 2. intraveineux IgG (IVIG) inhibe la phagocytose in vitro en utilisant le MMA. IgIV est connu pour inhiber la phagocytose et est utilisé comme contrôle d&#39;inhibition dans le MMA humain. (A) Titrage de IVIG a entraîné une inhibition dose-dépendante de la phagocytose par rapport à la non traité R 2 R 2 commande. Les résultats montrent la moyenne ± l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM) n = 3 expériences. L&#39;analyse statistique a été effectuée à l&#39; aide des étudiants t -test: ** p≤0.01 et *** p ≤ 0,001. (B) de la courbe d&#39;inhibition de l&#39; IVIG avec un IC 50 of 3 pg / mL (ligne pointillée). Les résultats montrent des données normalisées à R non traitées 2 R 2 (0% d&#39;inhibition); moyenne ± SEM de n = 3 expériences. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figure 3. Phase contraste des images de microscopie de diapositives de l&#39; échantillon sous un grossissement de 40X. (A) Le coulisseau parfait dans lequel les monocytes phagocytées 1-2 R 2 R 2 en moyenne (flèches noires avec un halo lueur distinctive), avec très peu de contamination, non phagocytés R 2 R 2 en arrière - plan (flèches blanches). Vacuoles (B) Comme le montre cette diapositive, monocytes ont parfois agrandies (flèches blanches), qui peuvent être confondus avec des phagocyté R 2 R 2. (C &lt;/ strong&gt;) Lorsque R 2 R 2 ont été sur-opsonisées, plus de 4-5 phagocyté R 2 R 2 par monocytes (flèches noires) rendent le comptage exact difficile, puisque le R 2 R 2 sont entassés dans le monocytes et de cellules distinctes les frontières ne peuvent être distingués. (D) de lavage inadéquate de la lame conduit à abondante R 2 R 2 contamination (flèches blanches), qui pourrait être confondu avec hématies adhéré. (E) Parfois, les monocytes et les globules rouges contaminants peuvent former des amas. Clusters indiquent également la contamination bactérienne, qui devrait être évité. (F) monocytes peut former des agrégats plus gros, qui doivent être évités pendant la quantification. Utilisation de la sélection aléatoire des champs pour voir, le panneau A est ce qui est habituellement observé si le MMA a été effectué correctement. La barre d&#39;échelle est de 20 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici s&#39;il vous plait</a>pour voir une version plus grande de cette figure.

Le dosage monocouche de monocytes (MMA) est un dosage in vitro qui utilise des monocytes primaires isolés obtenus à partir de sang total périphérique de mammifère pour évaluer la phagocytose médiée par le récepteur Fcγ (FcγR).

Utilisation d&#39;un monocytes monocouche Assay pour évaluer phagocytose Fcy Receptor médiée

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

L’objectif global de ce test fonctionnel in vitro est d’évaluer divers aspects de la phagocytose médiée par la FC. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunohématologie et de la médecine transfusionnelle sanguine, telles que la signification clinique des auto-anticorps et des allo-anticorps contre les globules rouges. Cette technique fournit un test biologique fonctionnel qui peut être réalisé in vitro pour prédire le résultat de la transfusion chez les patients ayant des anticorps préformés contre les globules rouges.Cindy Tong, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. N’oubliez pas que travailler avec du sang humain peut être dangereux et que des précautions telles que le port de blouses et de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir obtenu un à deux échantillons de sang total de 10 millilitres d’un donneur sain dans des tubes vacutainer contenant du citrate acide dextrose par ponction veineuse, les tubes sont placés dans une enceinte de biosécurité de classe II et le sang est dilué dans un rapport de un pour un dans un milieu complet chaud.Ensuite, pipetez lentement les cellules sanguines sur les côtés d’un tube à centrifuger sur le gradient de densité à température ambiante, en prenant soin de ne pas mélanger les couches. Séparez les cellules par centrifugation. Ensuite, jetez la couche supérieure de plasma et utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer le PBMC contenant la couche leucocytaire dans un nouveau tube de 15 millilitres.Lavez les PBMC isolés trois fois dans du PBS, en remettant les cellules en suspension dans trois à sept millilitres de milieu après la troisième centrifugation. Après le comptage, diluez les cellules à 1,75 fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration dans un milieu complet et ensemencez 400 microlitres de cellules dans chaque puits d’une lame à huit chambres pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 avec une humidité complète. Pour opsoniser les globules rouges R2R2, lavez d’abord les globules rouges trois fois dans du PBS.Diluer la pastille R2R2 après la troisième centrifugation dans un rapport de un à un avec des anticorps polyclonaux anti-D du sérum humain pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius avec mélange intermittent. À la fin de l’opération, retirez les cellules de l’incubateur, puis lavez-les trois fois de plus dans du PBS comme nous venons de le démontrer. Remettez la pastille en suspension à 1,25 % de volume à volume dans un milieu RPMI complet.Ensuite, remplacez le surnageant de chaque puits de la lame à huit chambres par 400 microlitres de cellules R2R2 opsonisées pendant deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez les adaptateurs de lames pour retirer les chambres, en tamponnant l’excédent de R2R2 avec une serviette en papier. Maintenant, remplissez un bécher de 100 millilitres de PBS et trempez lentement chaque lame 30 à 40 fois dans la solution saline pour éliminer la majorité du R2R2 non phagocyté.Après séchage, fixez les lames dans du méthanol à 100 % pendant 45 secondes et laissez sécher les cellules avant de monter les échantillons avec des lamelles. Le lendemain, chargez chaque lame sur un microscope à contraste de phase avec une lentille d’objectif 40X et comptez manuellement au moins 200 monocytes et le nombre de R2R2 phagocytés dans chaque monocyte à l’aide d’un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de cellules R2R2 phagocytées par échantillon. L’immunoglobuline intraveineuse se lie aux récepteurs FC et les bloque, inhibant la phagocytose de manière dose-dépendante, avec une inhibition de près de 100 % observée à partir de 200 microgrammes de concentrations d’immunoglobuline intraveineuse par millilitre et avec une inhibition presque nulle observée à des concentrations inférieures à 0,5 microgramme de l’inhibiteur.Lorsque les indices phagocytaires sont normalisés au témoin positif R2R2 comme une inhibition de 0 %, une courbe d’inhibition avec une CI 50 de trois microgrammes par millilitre peut être déterminée. Avec l’expérience, la microscopie à contraste de phase peut être utilisée pour distinguer les monocytes des globules rouges contaminants et les vacuoles des globules rouges phagocytés. Les amas de cellules denses et les débris doivent être évités lors de la quantification, ainsi que l’opsonisation excessive des globules rouges R2R2, ce qui peut entraîner une phagocytose accrue qui surcharge l’intérieur des monocytes et interfère avec une analyse phagocytaire précise.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six à huit heures si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunocytochimie ou l’immunofluorescence à l’aide de la microscopie confocale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’expression des protéines phagocytaires, les interactions entre les globules rouges et la compartimentation. Grâce à son développement initial et à son optimisation ultérieure, cette technique éclairera la façon dont les chercheurs dans les domaines de la médecine transfusionnelle et de la biologie cellulaire explorent les systèmes d’opsonisation.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de monocouche de monocytes pour évaluer les types d’interaction d’anticorps qui provoquent la phagocytose.

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