In Situ Détection et Quantification de la cellule unique de nanoparticules d’oxyde métallique à l’aide de l’analyse par microsonde nucléaire

Les nanoparticules sont de plus en plus utilisées dans l’industrie et la médecine en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques. Cependant, les préoccupations pour la santé humaine associées à l’exposition prolongée aux nanoparticules persistent. Ces risques peuvent être quantifiés en étudiant le comportement des nanoparticules à l’intérieur des cellules et les réponses métaboliques induites des cellules aux nanoparticules.

Cela est dû en partie au manque de méthodes permettant de détecter et de quantifier les nanoparticules internalisées dans une cellule sincle. Bien que de nombreux outils analytiques, notamment la microscopie et la spectrométrie de masse, puissent être utilisés pour estimer l’absorption cellulaire des nanoparticules, ceux-ci ne fournissent que des informations qualitatives au niveau microscopique. Au contraire, les méthodes in situ basées sur la spectroscopie atomique peuvent réduire la quantité d’artefacts d’imagerie résultant de la préparation des échantillons et peuvent permettre une observation directe des nanoparticules.

Pour en tirer parti, nous présentons une approche corrélative qui nous permet d’étudier les nanoparticules soit à l’état natif, soit en lit de laboratoire avec une étiquette fluorescente. Nous décrivons ici une méthode basée sur la combinaison de la microscopie à fluorescence et de l’analyse par microsonde nucléaire. Cela fournit des images de la densité cellulaire, de la distribution spéciale des éléments chimiques et de la quantité de nanoparticules par cellule.

À titre de démonstration, nous effectuerons des recherches sur des cellules exposées à des nanoparticules de dioxyde de titane pendant 24 heures en utilisant à la fois la microscopie à fluorescence et l’analyse de microsondes nucléaires. Pour ce protocole, un porte-échantillon personnalisé fabriqué avec le polymère PEEK est nécessaire. Il doit être adapté à la culture cellulaire et aux observations in vitro.

Couvrez le support avec une feuille de polycarbonate de deux microns d’épaisseur. La feuille de polycarbonate est collée sur la parabole PEEK avec une fine couche de solution Formvar. Une fois monté, le porte-échantillon doit être stérilisé.

Plusieurs supports d’échantillons stériles peuvent être entreposés, un par puits, dans une plaque stérile à douze puits jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’utilisation. Les cellules transfectées avec des plasmides GFP à rangées matricielles sont vérifiées par microscopie à fluorescence pour s’assurer que la transfection a bien fonctionné et qu’elles expriment la protéine fluorescente. Récoltez les cellules avec de la trypsine et incubez-les pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Arrêtez l’action de la trypsine en ajoutant un milieu de culture frais. Granulez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 1200 tours par minute à quatre degrés Celsius. Retirer le surnageant et ajouter un volume approprié de milieu de culture frais.

Comptez les cellules et effectuez une dilution avec un milieu de culture complet frais et thermostaté pour obtenir une suspension cellulaire de 500 cellules par microlitre. Plaquez une goutte de 40 microlitres au centre de la feuille de polycarbonate. Placez soigneusement l’échantillon dans l’incubateur cellulaire pendant deux heures.

Ajoutez délicatement deux millilitres de milieu de culture frais et laissez-les pendant 24 heures. Des nanoparticules d’oxyde de titane dimodifiées fluorescentes ont été conçues, synthétisées et greffées avec des fluorophores couramment utilisés afin de détecter, suivre et localiser les nanoparticules in vitro. Pour cette étape, une suspension de nanoparticules de dioxyde de titane dans de l’eau ultra-pure avec une concentration d’un milligramme par millilitre devrait déjà avoir été préparée.

Dispersez les nanoparticules en utilisant des impulsions de sonication intenses d’une minute à température ambiante. Diluer les nanoparticules dans un milieu de culture approprié pour obtenir une suspension d’exposition de quatre microgrammes par centimètre carré. Remplacez le milieu de culture cellulaire précédent par ce nouveau milieu contenant des nanoparticules et mélangez-le doucement pour obtenir une distribution homogène des nanoparticules.

Préparez un ensemble de cellules de contrôle de la même manière sans ajout de nanoparticules de dioxyde de titane. Incuber les populations cellulaires pendant 24 heures. À l’aide de paraformaldéhyde, ces échantillons peuvent être fixés et traités pour l’imagerie in situ et unicellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence.

La fixation physique cryogénique, cependant, préserve l’ultrastructure cellulaire et l’intégrité biochimique. La fixation par congélation plongeante arrête rapidement l’activité cellulaire en quelques millisecondes et évite l’utilisation de composés fixateurs. Pour cryogéniser les cellules, nous effectuons ce qui suit.

Préparez une plaque de transfert en aluminium en la refroidissant dans de l’azote liquide. Stockez la plaque dans une boîte remplie d’azote liquide, en gardant la surface de la plaque au-dessus du liquide dans la vapeur d’azote froide. Réfrigérer une quantité suffisante de 2-méthylbutane à 150 degrés Celsius.

Préparez un Falcon de 50 millilitres avec un milieu de culture et deux Falcon avec de l’eau ultra-pure. Assurez-vous qu’il y a du papier absorbant à proximité pour sécher l’échantillon avant de le congeler. Rincez les cellules une fois dans le milieu de culture, puis deux fois de plus dans de l’eau stérile et ultra-pure pour éliminer l’excès de sels restant dans le milieu de culture.

Séchez rapidement l’échantillon sur le papier absorbant. Congelez les cellules dans le 2-méthylbutane réfrigéré pendant 30 secondes et placez-les sur la plaque de transfert en aluminium réfrigérée. Il est essentiel que la boîte soit maintenue fermée autant que possible afin d’éviter que la vapeur d’eau ne se condense sur la surface de la plaque froide.

Après avoir congelé tous les échantillons, la lyophilisation est effectuée par la méthode suivante pour sublimer l’eau. Tout d’abord, effectuez une dessiccation primaire pendant 12 à 24 heures à basse pression et à basse température. Ensuite, en maintenant la pression basse, effectuez une phase de dessiccation secondaire pendant au moins 24 heures avec la température de la plaque augmentée à 40 degrés Celsius.

Après cryofixation, les échantillons peuvent être conservés à température ambiante pendant plusieurs jours dans des conditions stériles et sèches, à l’abri de la poussière et de l’humidité. L’analyse de microsondes nucléaires a été réalisée sur le site d’Ifera à Bordeaux, en France. Un accélérateur de particules singletron de 3,5 mégavolts délivre un faisceau d’ions légers dans la gamme d’énergie des mégaélectronvolts.

L’imagerie des éléments chimiques a été réalisée sur la ligne de faisceau des microsondes à l’aide de techniques analytiques complémentaires par faisceau d’ions. Les techniques utilisées par le biais d’une micro-PIXE, émission de rayons X induite par des particules, STIM, microscopie ionique à balayage, et d’une micro-RBS, spectrométrie de rétrodiffusion de Rutherford. Les échantillons sont positionnés à l’intérieur de la chambre d’analyse et irradiés sous vide avec différentes particules afin d’effectuer différentes analyses par faisceau d’ions.

STIM est utilisé pour enregistrer des cartes aériennes de densité des cellules en fonction des particules d’énergie libres passant à travers des régions de cellules de densités différentes. L’analyse micro-PIXE et micro-RBS permet la distribution spatiale et la quantification des éléments chimiques au niveau d’une seule cellule. Un microfaisceau de protons de 1,5 mégaélectronvolt est focalisé jusqu’à un diamètre d’environ 1 micromètre et il est balayé à travers les cellules d’intérêt, identifiées par STIM.

Les rayons X émis par les atomes présents dans l’échantillon, allant du sodium au titane, permettent de déterminer les concentrations élémentaires. Des protons rétrodiffusés sont collectés afin de mesurer le nombre total de particules entrantes nécessaires pour normaliser les intensités des rayons X. Il est essentiel de disposer d’étalons d’étalonnage certifiés pour la quantification des concentrations élémentaires afin d’étalonner la réponse du détecteur de rayons X.

Afin d’analyser les données des faisceaux d’ions, nous avons développé un nouveau plugin pour ImageJ. Tout d’abord, des cartes de densité STIM ont été calculées. Le contraste dans les images de microscopie à fer à transmission à balayage est dû aux différences locales de densité et permet la détection de structures cellulaires telles que le noyau et le cytoplasme.

Plusieurs cartes peuvent être traitées à la fois. Chaque carte correspond au milieu transmis par l’énergie des particules entrantes. La deuxième étape de l’analyse des données consiste à calculer les spectres cellulaires individuels.

L’analyse de l’émission de rayons X induite par les particules permet d’obtenir à la fois la composition chimique de l’échantillon et les cartes élémentaires des éléments chimiques. Les cartes d’éléments chimiques sont calculées après avoir trié les photons en fonction de la position du faisceau au moment de l’enregistrement et sélectionné une fenêtre d’énergie centrée autour d’un élément spécifique. Les cartes représentent généralement le nombre d’événements détectés à la position du faisceau et contiennent des données quantitatives.

Une pile de cartes chimiques, une pour chaque élément sélectionné, est calculée. Les régions d’intérêt pour chaque cellule sont trouvées à l’aide des données PIXE pour le phosphore. Les spectres correspondant à chaque cellule entière sont ensuite calculés en additionnant les spectres individuels dans la région d’intérêt de chaque cellule.

À partir de là, des données quantitatives sur les abondances chimiques dans chaque cellule peuvent être extraites à l’aide des logiciels d’analyse PIXE et IBS dédiés. Ici, nous montrons l’imagerie de fluorescence de cellules après fixation du paraformaldéhyde. La rangée du haut montre les cellules qui n’ont pas été exposées aux nanoparticules de dioxyde de titane, tandis que la rangée du bas l’a été.

Le canal bleu montre le noyau cellulaire, le canal vert montre les mitochondries et le canal rouge montre le titane. On peut clairement voir qu’aucun dioxyde de titane n’est présent dans les commandes. Depuis le canal fusionné à droite, on peut voir que les nanoparticules se trouvent exclusivement dans le cytoplasme et sont exclues des mitochondries.

Ce qui manque à cette méthode, cependant, ce sont des informations quantitatives sur la concentration de nanoparticules. L’analyse des microsondes nucléaires peut espérer y parvenir. Ces images ont toutes été prises à l’aide de diverses techniques d’analyse par microsonde.

Encore une fois, la rangée du haut montre les cellules de contrôle et la rangée du bas montre les cellules contenant des nanoparticules de titane. L’image la plus à gauche montre les mesures STIM de la densité des cellules cryogéniques. Les trois panneaux suivants montrent l’abondance de potassium, de phosphore et de titane présents dans les cellules obtenues par PIXE.

Encore une fois, aucun titane n’est visible dans les contrôles ni dans les noyaux cellulaires. Afin de quantifier, cellule par cellule, l’absorption du titane, nous définissons les régions d’intérêt en fonction des limites cellulaires indiquées dans le panneau le plus à droite et mesurons les abondances élémentaires dans ces régions. À partir de ces mesures PIXE, nous avons tracé la distribution des abondances élémentaires au niveau de la cellule unique pour les populations témoins et exposées.

La population témoin est représentée en blanc et la population exposée est représentée en jaune. La teneur médiane en titane présente ici est assez faible par rapport à la dose d’exposition de quatre microgrammes par centimètre carré. La gamme d’absorption du titane montre une grande variation à travers la population, de 0,2 microgramme par centimètre carré à 1,8 microgramme par centimètre carré.

Nous avons également remarqué une augmentation des ions intracellulaires libres tels que le potassium et le calcium dans les échantillons exposés aux nanoparticules, suggérant une altération de l’homéostasie cellulaire induite par la présence de nanoparticules de dioxyde de titane. L’analyse des microsondes nucléaires peut fournir des informations utiles sur le niveau subcellulaire et permet de quantifier les éléments chimiques qui composent un échantillon biologique. Ces techniques présentent de nombreux avantages.

Premièrement, dans la préparation d’échantillons qui ne nécessite pas de fixation chimique. Deuxièmement, la possibilité d’étudier des zones plus vastes avec la possibilité de se concentrer sur d’autres régions d’intérêt. Troisièmement, la quantification des éléments chimiques avec une sensibilité de quelques microgrammes par gramme.

Et quatrièmement, l’identification des compartiments cellulaires tels que le noyau, le nucléole et le cytoplasme. La détermination précise de ceux-ci, lors de l’étude de l’internalisation des nanoparticules dans les cellules individuelles, est essentielle pour la toxicologie quantitative des nanoparticules. Comme le montrent les cas étudiés ici, la capacité d’observer et de quantifier les nanoparticules au sein de cellules individuelles nous permet de mieux comprendre l’accumulation de valeur des éléments chimiques endogènes et exogènes, tels que les nanoparticules d’oxyde métallique.

Ce protocole met en évidence l’adéquation de l’analyse des microsondes nucléaires pour les études futures de l’interaction des nanoparticules avec les cellules vivantes. L’approche quantitative fournit des informations sur l’impact de ces nanoparticules en termes de détection, d’identification, de localisation et de quantification, et au niveau de la cellule unique pour les nanoparticules natives et chimiquement modifiées.