Métaux d'imagerie dans le tissu cérébral par Laser Ablation - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS)

L'objectif général de cette méthode est de quantifier la distribution spatiale des métaux dans des sections de tissus à l'aide de la spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif avec ablation laser. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles en biologie fondamentale et en recherche sur les maladies, notamment dans les affections où la biochimie des métaux intervient dans la pathologie de la maladie. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à conserver les informations spatiales relatives aux métaux, habituellement perdues lors des méthodes traditionnelles d'analyse des métaux totaux.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des maladies neurodégénératives, car elle nous permet de surveiller les modifications des métaux dans les régions cérébrales présentant une mort cellulaire. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés lors de la mise en place de ces expériences longues et complexes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la conception de l'expérience et l'analyse des données peuvent être difficiles, chaque étape devant être exécutée dans un ordre précis.

Tout d'abord, placez un échantillon de tissu cérébral ainsi que toutes les normes de tissu appariées en matrice dans la chambre d'ablation laser. Assurez-vous que les échantillons se trouvent dans la profondeur de champ de la caméra LACCD. Fermez la porte de la chambre et serrez les vis avec les doigts.

Ensuite, dans le logiciel ICPMS, ouvrez la vanne du gaz porteur et réglez le débit à 1,2 litre par minute. Dans le logiciel LA, effectuez une purge de 30 minutes de la cellule d'ablation avec le gaz porteur. Pour une cellule d'ablation à deux volumes, déplacez le porte-échantillon vers chaque coin de la chambre toutes les dix minutes afin de réduire la quantité d'air résiduel dans la cellule.

Allumez le spectromètre de masse à plasma inductif (ICPMS) et laissez l'appareil chauffer pendant deux heures. Pendant le temps de préchauffage, utilisez le logiciel d'ablation laser pour tracer une ligne d'ablation d'environ trois millimètres de longueur à la surface du premier standard tissulaire. Cliquez sur la ligne d'ablation et réglez le diamètre par défaut du faisceau, la vitesse de balayage et le flux énergétique.

Dupliquez la ligne six fois, en espaçant les lignes d'un diamètre de faisceau. Répétez ce processus pour chaque standard. Ensuite, utilisez l'outil de ligne pour tracer la zone d'ablation sur l'échantillon, du coin supérieur gauche en traversant le point le plus large de l'échantillon, en utilisant les mêmes paramètres que pour les standards.

Dupliquer la ligne selon les besoins pour assurer une couverture complète de l'échantillon avec le même espacement que celui utilisé pour les étalons. Ensuite, tracer un ensemble de lignes pour l'analyse intermittente des étalons, au plus tard 20 heures après le balayage de l'échantillon, ou entre chaque échantillon. Ajouter un balayage des étalons à la fin de l'expérience.

En fonction de la longueur de la ligne et de la vitesse de balayage, déterminez le temps d'analyse pour les lignes d'échantillon et de référence. Créez ensuite un nouveau lot dans le logiciel ICPMS et sélectionnez l'analyse résolue en temps. Choisissez les valeurs du rapport masse sur charge d'intérêt et définissez les temps d'intégration pour chaque rapport, de sorte que le temps d'intégration total pour un cycle soit de 0,25 seconde.

Enregistrez le lot. Pour un lot standard, renseignez le temps d'analyse pour chaque ligne en ajoutant un temps tampon de 15 secondes pour tenir compte du temps de préchauffage du laser et des durées de lavage. Définissez une liste d'exécution des échantillons avec une acquisition pour chaque ligne standard.

Pour le lot d'échantillons, dupliquez le lot standard et ajustez en conséquence les durées et le nombre d'acquisitions selon le motif d'ablation des échantillons. Une fois que l'ICPMS a atteint sa température de fonctionnement, ajoutez le premier lot à la file d'attente et assurez-vous que le logiciel attend un déclenchement provenant de l'instrument LA. Ensuite, dans le logiciel LA, activez l'alimentation du laser et réglez les durées de préchauffage du laser et de rinçage.

Démarrer la séquence laser et vérifier que l'ICPMS commence correctement la collecte des données après l'ablation. Une fois les données collectées, extraire les données des étalons à partir des fichiers CSV. Effectuer les corrections de ligne de base et exclure le signal de fond.

Identifier les baisses de signal causées par des trous dans les échantillons témoins. Masquer ces zones à faible signal, puis exporter les données sous forme de feuille de calcul. Calculer un facteur de conversion de CPS en PPM pour chaque élément identifié.

Répétez ce processus pour chaque étalon. Ensuite, ouvrez le logiciel de construction d'images quantitatives et importez les données des échantillons à partir des fichiers CSV. Sélectionnez plusieurs zones du fond pour appliquer la correction du fond.

Sélectionnez l'outil d'édition de graphique, cliquez avec le bouton droit sur l'image, puis sélectionnez modifier l'apparence de l'image. Remplacez la première couleur à Z par une valeur négative élevée, puis cliquez sur terminé pour améliorer le signal de fond. Ensuite, dans l'onglet étalons, saisissez les facteurs de correction CPS PPM pour chaque étalon et cliquez sur exécuter.

Ouvrez le navigateur de données dans l'onglet données, cliquez avec le bouton droit sur un fichier d'image corrigé et cliquez sur Nouvelle image. Ouvrez la fenêtre de modification de l'apparence de l'image et définissez la table de couleurs et l'échelle. Utilisez l'utilitaire d'ajout d'annotation pour placer une échelle de couleur sur l'image.

Ajustez l'échelle de couleurs dans la fenêtre d'échelle de couleurs. Une fois l'image colorée et annotée, copiez et collez l'image dans un autre programme ou exportez l'image à partir du logiciel de création d'images. Pour activer les outils de région d'intérêt (ROI), sélectionnez le traitement d'image dans les packages d'analyse et choisissez une image.

Dans l'onglet image, cliquez sur ROI et commencez le tracé de la ROI. Sélectionnez la région d'intérêt, puis cliquez sur terminer la ROI. Dans l'onglet image, cliquez sur statistiques pour obtenir les données de la ROI.

Copiez et collez les données dans un tableur, en veillant à enregistrer chaque fois qu'une zone d'intérêt (ROI) est ajoutée. Répétez le processus selon les besoins. La teneur en métaux et leur distribution dans le cerveau d'une souris de type sauvage ont été étudiées à l'aide de cette technique.

Ici, les distributions du carbone, du magnésium et du phosphore sont indiquées en comptes par seconde. Des images quantitatives sont présentées pour le manganèse, le cuivre, le fer et le zinc. La distribution du carbone a été utilisée comme étalon interne.

Le fer était le plus abondant dans le mésencéphale et le gyrus denté. Le zinc était le plus abondant dans les régions corticales. Les informations provenant de ces images peuvent ensuite être utilisées pour suivre l'expression et la fonctionnalité des protéines liant les métaux. Une fois maîtrisé, un experiment s'étendant sur plusieurs jours peut être mis en place en moins d'une heure lorsqu'il est effectué correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de synchroniser vos lignes d'ablation et vos fichiers de données avec la spectrométrie de masse par plasma induit (ICPMS). Après cette procédure, des méthodes supplémentaires, telles que la coloration histologique sur des sections adjacentes, peuvent être réalisées afin d'obtenir des informations complémentaires, comme la colocalisation des métaux avec des protéines spécifiques. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous souhaitions examiner comment les concentrations métalliques variaient dans des modèles expérimentaux de la maladie de Parkinson.

Bien que cette méthode puisse être utilisée pour obtenir des informations sur la neurodégénérescence, elle peut également s'appliquer à différents types de tissus et à divers états pathologiques, y compris les tissus humains, ainsi qu'à une gamme de matrices biologiques. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d'étudier les variations des concentrations métalliques tant dans des échantillons humains que dans des modèles animaux de maladie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de mettre en place une expérience d'ablation laser couplée à la spectrométrie de masse avec source plasma induit (ICPMS).

N'oubliez pas que le travail avec des matériaux biologiques peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle appropriés, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.