Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

L’objectif global de ce protocole expérimental est d’évaluer rapidement plusieurs conditions de traitement affectant l’invasion périneurale dans le cancer épidermoïde de la tête et du cou avec des taux de réussite et de reproductibilité très élevés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oncologie de la tête et du cou, telles que quels sont les facteurs qui influencent l’invasion périneurale des cellules cancéreuses de la tête et du cou. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de tests peuvent être effectués rapidement et de manière reproductible à partir d’une souris dans un laps de temps relativement court.

Avant de commencer la procédure de dissection du ganglion de la racine dorsale, ou DRG, ajoutez un milieu frais à température ambiante à au moins 40 puits d’une plaque à 96 puits à fond en V. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux fins, faites une incision longitudinale le long de la colonne vertébrale de la racine de la queue à la tête de la souris. Et divisez transversalement le tissu sous la colonne vertébrale sacrée, en disséquant les deux côtés de la colonne vertébrale, jusqu’à la base du crâne.

Transférez l’échantillon sous le microscope et observez l’extrémité cervicale de la colonne vertébrale à faible puissance. La moelle épinière blanche est apparente au milieu d’un anneau osseux, qui est entouré de quantités variables de muscles périspinaux et de tissus mous. À l’aide de ciseaux à ressort microscopiques, fendez la face dorsale, ou supérieure, des deux à trois premiers corps vertébraux.

Ensuite, utilisez l’action du ressort des ciseaux pour ouvrir cette coupe osseuse initiale, afin de vous assurer que la dissection du corps vertébral se produit sur la ligne médiane. Continuez par petits incréments vers la colonne vertébrale sacrée, en coupant la colonne vertébrale en deux avec des coupures identiques sur la face ventrale ou inférieure des corps vertébraux. En plaçant une hémispine de côté, transférez l’autre moitié de la colonne vertébrale face vers le bas sur une plaque stérile avec la moelle épinière en place.

Et utilisez deux aiguilles de calibre 18 pour fixer les deux extrémités de l’hémispine sur la plate-forme de dissection en polystyrène. Ensuite, en commençant par l’extrémité cervicale plus étroite, décollez doucement la moelle épinière à partir d’environ quatre niveaux vertébraux. Dans la région où les nerfs sensoriels s’insèrent dans le DRG, saisissez doucement le fascia environnant avec des pinces microscopiques et utilisez des ciseaux à ressort microscopiques pour couper ce fascia et d’autres tissus nerveux afin de libérer le DRG.

Sous un grossissement accru, utilisez les ciseaux à ressort pour couper le nerf périphérique aussi près que possible du DRG afin de libérer le tissu et coupez les branches proximales. Ensuite, coupez le DRG de toutes les fibres nerveuses parasites ou des attaches fasciales et placez le tissu isolé dans un puits de la plaque inférieure en V de 96 puits. Pour préparer les gouttelettes de matrice semi-solide, transférez une plaque de fond de puits en verre de la glace sur un bloc de glace sous le microscope opératoire.

Placez l’extrémité d’une pipette de 10 microlitres maximum directement sur le verre à un angle de 45 degrés et versez soigneusement une gouttelette de matrice de 1,5 microlitre sur le verre. Éloignez lentement la pointe de la pipette du verre à mesure que la matrice s’engage avec la plaque. Déposez une gouttelette de matrice sur chacun des quatre coins de la plaque et transférez la plaque sur une surface à température ambiante pendant environ une minute.

Lorsque la matrice s’est légèrement raidie, remettez la plaque dans le bloc de glace et utilisez une pince microscopique fermée pour ramasser doucement le DRG avec la main gauche. À l’aide de la main droite, transférez soigneusement le tissu nerveux à la pointe d’une aiguille de calibre 21 et utilisez l’aiguille pour insérer doucement le DRG au milieu de la gouttelette matricielle. Le DRG doit se libérer facilement dans la matrice pour un positionnement central avec l’aiguille.

Après avoir inséré un morceau de DRG dans chacune des quatre gouttelettes, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Lorsque tous les DRG ont été intégrés, tenez les plaques une par une, légèrement inclinées et ajoutez lentement quatre millilitres de DMEM complétés par 10 % de FBS aux plaques, de sorte que le fluide n’entre en contact que progressivement avec les unités DRG matricielles. Remettez les plaques dans l’incubateur pendant 48 à 72 heures supplémentaires.

Lorsque les neurites atteignent au moins 75 % du chemin jusqu’au bord de la matrice, aspirez le milieu des puits sans retirer les unités DRG de la matrice. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, avec une gâchette lisse, placez deux gouttes de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de milieu sur chaque test DRG matriciel. Et remettez les plaques dans l’incubateur.

Au bout d’une heure, ajoutez délicatement quatre millilitres de DMEM avec 10 % FBS le long de la paroi latérale de la plaque à fond de verre, et remettez les plaques dans l’incubateur jusqu’à leur prochaine évaluation microscopique. Après leur dissection et leur placement dans les gouttelettes de la matrice, l’apparence du test devrait ressembler à la DRG intégrée à la matrice montrée ici. Notez que le DRG n’est pas parfaitement rond, mais qu’il est centré dans la gouttelette matricielle, ce qui permet la croissance des neurites à 360 degrés.

Immédiatement après le placage, les cellules cancéreuses squameuses de la tête et du cou forment un anneau circonférentiel autour de la matrice, s’étendant le long des neurites au cours des deux à trois jours suivants. Les cellules plaquées sur des gouttelettes de contrôle vierges contenant uniquement la matrice se divisent activement autour des matrices, mais ne pénètrent pas ou ne s’étendent pas au-dessus du dessus. Pour quantifier l’invasion périneurale des cellules cancéreuses, les images des tests sont divisées en quatre quadrants via une ligne verticale et une ligne horizontale.

Une série de points est ensuite notée pour chaque extension d’invasion périneurale observée dans chaque quadrant, ce qui permet de comparer les croissances des cellules cancéreuses le long des neurites entre différentes lignées cellulaires cancéreuses. Une fois maîtrisée, la technique d’isolement des ganglions de la racine dorsale peut être complète en moins de deux heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de minimiser la manipulation excessive des ganglions de la racine dorsale, car les blessures par écrasement sont la raison la plus courante de l’échec du test.

À la suite de cette procédure, les mécanismes de l’invasion périneurale peuvent être étudiés, ce qui pourrait conduire au développement de thérapies ciblées contre ce type d’invasion des tissus mous. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les ganglions de la racine dorsale d’une souris et de mettre en place un test pour examiner l’invasion périneurale.