Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d'un gel

L’objectif global de cette procédure est d’acquérir des observations à long terme d’un système racinaire de plante à l’aide de la microscopie à feuille de lumière. Pour y parvenir, il est essentiel d’avoir une méthode de préparation d’échantillon douce, des conditions de croissance contrôlées et une technique d’imagerie qui n’altère pas le développement des plantes, comme la microscopie à feuillet de lumière. Pour commencer, les plantes sont cultivées à la surface d’une couche de gel de deux millimètres d’épaisseur.

Le gel avec un plant d’Aribidopsis est ensuite découpé, ramassé et transféré sur le porte-échantillon du microscope. À l’intérieur du microscope, la plante pousse dans sa position verticale naturelle. Les racines poussent dans un milieu liquide, tandis que les feuilles restent à l’air.

Un système d’éclairage n’éclaire que les vantaux. La surface de l’eau est couverte afin de garder les racines dans l’obscurité. L’un des principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’intégration de la racine à l’intérieur du gel, est que nous sommes habitués à faire pousser des plantes à la surface d’un gel.

Par conséquent, nous pouvons nous en tenir au même protocole de culture qu’auparavant. Et deuxièmement, la racine est en contact direct avec le milieu liquide, qui peut être échangé contre des traitements médicamenteux, par exemple. Versez 30 millilitres de milieu MS demi-fort fraîchement autoclavé contenant 1,5 pour cent de phytogel dans une boîte de Pétri carrée pour créer une couche d’environ 2 millimètres.

Semez des graines stériles côte à côte avec un espace d’au moins un centimètre entre les deux. Ensuite, enveloppez la plaque avec un ruban adhésif à micro-pores. Cultivez la plaque dans votre incubateur de croissance verticalement jusqu’à 10 jours.

Dans cette expérience, nous utilisons des plantes âgées de six jours pour observer le développement des racines latérales. Nous fournissons un modèle pour l’impression 3D du porte-échantillon. Nous avons testé différents matériaux.

Les résines transparentes étaient les plus appropriées en termes de rigidité et de résistance à l’eau. Une description détaillée des dimensions pour usiner un porte-échantillon à partir d’un matériau solide est décrite dans le manuscrit. Coupez le gel autour de la plante à l’aide d’un scalpel.

Ensuite, prélevez le bloc de gel sur lequel la plante pousse et transférez-le soigneusement au porte-échantillon. Faites fondre 1 % d’aggros à 80 degrés Celsius et refroidissez-le à 33 degrés Celsius. Collez le bloc de gel sur le porte-échantillon et collez soigneusement la plante sur le gel.

Utilisez un stéréomicroscope pour vérifier la position de la plante et assurez-vous que la région d’intérêt n’est recouverte d’aucun gel. Afin d’éviter que la plante ne se dessèche, faites glisser le porte-échantillon sur une pointe de pipette de 1 000 microlitres dans la mesure du possible. Placez le support sur une boîte à pipette et préparez d’autres échantillons si nécessaire.

Notre microscope est un microscope classique à rotation ouverte sans modifications majeures. Nous avons mis en place un système d’éclairage pour la culture des plantes à l’intérieur du microscope. Les LED rouges et bleues sont disposées en anneau.

Des paires de LED peuvent être allumées et éteintes individuellement pour un éclairage directionnel. Le spectre du système d’éclairage correspond à celui de nos chambres de culture. La quasi-totalité de l’éclairage provenant des LED est bloquée par le filtre d’émission pour GFP.

Nous n’avons pas pu détecter de lumière parasite atteignant la caméra. Par conséquent, la lumière peut être maintenue allumée pendant l’imagerie. L’intensité lumineuse peut être ajustée, allant de 30 à 250 micromoles par mètre carré par seconde.

Vissez ou collez l’anneau LED sur la face inférieure du bras de la platine de rotation ouvert. Remontez-le sur le microscope et branchez les fils. Assemblez le système de profusion.

Connectez les tubes à la chambre d’échantillonnage dans un arrangement unidirectionnel. Ajustez la vitesse à un millilitre par minute. Ajoutez des carrés de trois millimètres d’une feuille de plastique noire stérile et répartissez-les à la surface de l’eau.

Insérez l’échantillon dans le microscope. Vérifiez qu’il n’y a pas de feuilles de plastique collées au porte-échantillon. Fermez la chambre avec deux couvercles en feuille d’aluminium noir.

Allumez la lumière et ajustez l’intensité lumineuse. Éteignez la lumière de la pièce et commencez l’enregistrement. Cette méthode permet d’enregistrer la croissance racinaire sur plusieurs heures jusqu’à plusieurs jours, représentée ici par la croissance d’une racine latérale.

Les images d’un empilement z d’un seul point temporel montrent de bonnes propriétés de section optique. Nous avons capturé l’ensemble du processus de formation des racines latérales en 3D, ce qui nous permet d’étudier la dynamique de ce processus. L’examen d’une seule tranche de cet enregistrement montre une bonne résolution, même au plus profond de la racine.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension claire de la méthode de préparation des échantillons de plantes pour la microscopie à feuille de lumière. En suivant ce protocole, nous sommes maintenant en mesure d’examiner la localisation des protéines intracellulaires ou les modèles d’expression génique au cours de l’organogenèse, des tropismes végétaux ou de l’adaptation des plantes. Cela nous aidera à comprendre la régulation spatio-temporelle du développement des plantes.