Name: Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Apprenez à dériver des fibroblastes méningés fibronectine-positifs à partir de cerveaux humains post-mortem. Cette technique robuste permet d'étudier la maladie de Parkinson et de cryoconserv.

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Le développement de ce protocole a été financé par des dons privés destinés au programme de don de cerveau de l’Institut Parkinson.

L&#39;enregistrement cerveau don comprend la documentation par le déclarant de leur intention de faire un don. L&#39;autorisation d&#39;autopsie pour la récupération des tissus est fournie par le plus proche parent dans la mesure permise par la loi. Les études de recherche à l&#39;aide de spécimens d&#39;autopsie recueillies sont examinées par le comité d&#39;examen institutionnel (IRB) pour assurer la conformité avec Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) règlements. REMARQUE: Les échantillons sont collectés par leptoméninge le dissecteur cerveau ou neuropathologue au cours d&#39;une dissection du cerveau et sont stockés dans des tubes de 50 ml contenant coniques 25-30 mL méningée milieu de croissance. L&#39;échantillon est conservé à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la préparation des échantillons. Le traitement doit être effectué le plus tôt possible que la viabilité des cellules diminue avec le temps post-mortem. 1. Mise en place avant de lancer la leptoméninge Dissection REMARQUE: Les étapes 01/01 à 01/03 sont à effectuer dans une enceinte de sécurité biologique. <ol><li> Préparer un milieu de croissance des méninges en combinant 375 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco, 100 ml de sérum bovin fœtal, 5 ml de 10 mM d&#39;acides aminés non essentiels, 5 ml de 200 mM de L-alanyl-L-glutamine ml de pyruvate de sodium 5 à 100 mM, 5 ml 10 000 U / ml de pénicilline / streptomycine et 5 ml 250 pg / ml d&#39;amphotéricine B dans 500 ml d&#39;unité de filtration. Filtrer et mélanger. Utiliser les médias pour un maximum de quatre semaines. </li><li> Placez tous les matériaux dans l&#39;enceinte de sécurité biologique avant de commencer la dissection: plats 4x Petri, 2x plaques 6 puits, 2x scalpels, 15-20 stérilisés couverture feuillets 15 mm, tampon phosphate salin (PBS), pipettes sérologiques, aspiration pipettes. </li><li> Ajouter 1 ml de solution stérile-autoclavé gélatine 0,1% à chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. Placer la plaque de côté pour 30-60 min. 2x préparer des plaques à 6 puits. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;échantillon leptoméninge REMARQUE: Les étapes 02.01 à 02.03 doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. <ol><li> Ajouter environ 10 ml de PBS10 cm plat et de culture de tissu stérile placer l&#39;échantillon meninges dans le plat. En utilisant des pinces, lavez doucement leptoméninge avec du PBS pour éliminer le sang. </li><li> Transférer les méninges dans un nouveau 10 cm boîte de culture de tissu contenant 10 ml de PBS frais et continuer à laver. Répéter au besoin pour enlever autant de sang que possible. </li><li> L&#39;utilisation de deux scalpels, coupés leptoméninge tissu dans un environ 6 cm x 6 cm grande pièce. </li><li> Placer le couvercle sur une boîte de culture et transfert à un microscope à dissection dans une hotte à flux laminaire horizontal. </li></ol> 3. Dissection de leptoméninge Tissue REMARQUE: Les étapes 03.01 à 03.03 doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire horizontal à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. <ol><li> Retirer les vaisseaux sanguins d&#39;une région sur la pièce de leptoméninge (étape 2.3) assez grand pour créer au moins 20-25 3 mm x 3 mm pièces. Tenir la leptoméninge en place avec un scalpel et de l&#39;autre, utiliser un mo raclage doux et peu profondetion pour séparer les vaisseaux. </li><li> Couper des petits carrés de tissu de la zone préparée. Couper dans un processus par étapes en faisant d&#39;abord les gros morceaux, puis couper les en sections plus petites. </li><li> Utilisez un scalpel pour maintenir le tissu en place et un autre scalpel pour couper le tissu avec un mouvement de bascule. En raison de la consistance du tissu, il est difficile de faire coulisser les uns contre les autres scalpels. Cela ne fera que déchirer le tissu à part et se traduit par des bords irréguliers. </li><li> Continuer à couper les morceaux de moitié jusqu&#39;à ce qu&#39;il y à environ 20-25 3 mm x 3 mm pièces. </li></ol> 4. Transfert de Dissected Méninges Pièces sur Tissue Culture Plaques REMARQUE: L&#39;étape 4 doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique. <ol><li> Aspirer la gélatine de la plaque de 6 puits (de l&#39;étape 1.3). Ajouter 1 ml de milieu de croissance meninges à chaque puits. En utilisant des pinces stériles, placer 3-4 pièces de biopsie dans chaque puits. </li></ol> 5. Mise en place de couverture glisse sur Meninges Pieces REMARQUE: Les étapes 05.01 à 05.02 doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire horizontal à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection. <ol><li> Couvrir les morceaux avec 1-2 15 mm lamelles stériles circulaires par puits. </li><li> Appuyez fermement avec une pince pour assurer les morceaux touchent le fond de la plaque. Ceci permet la fixation de pièces de tissu au fond du puits. </li><li> Placer la plaque de 6 puits dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li></ol> Culture 6. Cellule Maintenance REMARQUE: Les étapes 06.01 à 06.03 doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Manipuler des boîtes de culture avec soin que les lamelles ne doivent pas bouger et déloger les méninges pièces. <ol><li> Après 2 jours de culture, ajouter un 1 ml supplémentaires de milieu frais de croissance meninges à chaque puits. </li><li> Au jour 7, aspirez soigneusement les médias et ajouter 2 mL de milieu frais dans chaque puits. </li><li> Après 9 jours, continuer à changer de support de croissance tous lesautre jour jusqu&#39;à ce que la culture devient confluentes. </li></ol> 7. repiquage NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Une fois que les fibroblastes méningées ont migré hors des morceaux de tissu méningées et commencer à se développer vers les bords du récipient de culture, développez des fibroblastes méningées en plus grande boîte de culture. <ol><li> Avant de commencer le repiquage, le manteau de la boîte de culture avec 1% de gélatine pendant 15-30 min. </li><li> Aspirer le milieu de plat à 6 puits et laver les cellules avec 2 ml de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de trypsine / EDTA à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 à 10 min. Il est nécessaire d&#39;enlever les lamelles ou le tissu méningé pour cette étape. </li><li> Lorsque les cellules sont arrondies et commencent à se détacher, ajouter 2 ml de milieux de culture. </li><li> cellules haut et bas pour perturber complètement toutes les touffes et transférer la solution de cellules à une plus grande boîte de culture pipettes. </li><li> Utiliser un rapport de 1: 3 à 1: 4 pour combiner des cellules de trois boîtes à 6 puits dansune boîte de culture T75. </li><li> Une fois les cellules fibroblastes méningées sont confluentes dans des flacons de culture T75, trypsiniser les cellules et la cryoconservation dans les médias de cryoconservation à 1x10 6 cellules / mL par flacon. Un T75 flacon de culture avec des fibroblastes confluentes méningées contient environ 5-7 millions de cellules. </li></ol> 8. Caractérisation des fibroblastes méningés par immunocoloration REMARQUE: Avant de commencer la procédure, préparer une solution de paraformaldehyde à 4%, 5% de sérum de chèvre normal dans du PBS (tampon de blocage), 0,3% de Triton X-100 dans du PBS (tampon de perméabilisation), les solutions d&#39;anticorps primaires et secondaires, et 1 pg / ml de Hoechst 33342 dilué dans du PBS de 10 mg / mL stock. <ol><li> Seed 15.000 à 30.000 fibroblastes méningées dans 8 puits chambre diapo revêtues de gélatine à 0,1%. </li><li> Après 24 h lorsque les cellules sont fixées, fixer les cellules dans 100 ul de paraformaldehyde à 4% par puits pendant 10 min à température ambiante. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 150 ul de 0,3% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Ajouter 200 ul de solution de blocage (PBS + 5% de sérum de chèvre normal) pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Aspirer la solution de blocage et ajouter 150 ul d&#39;anticorps primaires souhaités dilués dans une solution de blocage. Pour double coloration, préparer des dilutions de travail des anticorps primaires dans des tubes de centrifugation séparés sur la glace comme suit: <ol><li> Préparer dilution 1: 300 d&#39;anticorps anti-fibronectine + dilution 1: 200 d&#39;anticorps anti-nestine dans la solution de blocage. Préparer dilution 1: 250 d&#39;anticorps anti-SERPINH1 + 1: 1000 dilution de l&#39;anti-TUJ1 dans la solution de blocage. Préparer dilution 1: 250 d&#39;anticorps anti-SERPINH1 + dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-SOX2 dans une solution de blocage </li></ol></li><li> Incuber à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Laver les puits 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Préparer un travail 1: 400 dilution marqué par fluorescence des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin (vert; Ex / Em 2 </sup&gt; 495/519 nm) et de chèvre anti-souris (rouge; Ex / Em 2 590/617 nm) dans une solution de blocage et ajouter 100 pi à chaque puits. Incuber pendant 1 h, à l&#39;obscurité, à température ambiante. Puis, lavez les puits une fois avec PBS 1x. </li><li> Ajouter 100 pi de 1 pg / ml Hoechst 33342 (bleu; Ex / Em 2 358/461 nm) solution à chaque puits et incuber dans l&#39;obscurité pendant 3 min. Laver les puits 3 fois avec PBS 1x, laissant dans le lavage final 1x PBS dans le puits, et recouvrir la lame avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Analyser les cellules sous microscope à fluorescence. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
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<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit un protocole simple et robuste pour dériver une culture de fibroblastes méningée de leptoméninge post-mortem humains recueillies conjointement avec un don de cerveau. Il y a très peu de descriptions de protocoles pour dériver des cultures de cellules de matériel humain post-mortem. Deux études décrivent des cultures de fibroblastes 7, 8, peau dérivé 9, une étude décrit les échantillons 10</...

Méninges se composent de trois membranes qui protègent le cerveau: la dure-mère-mère, arachnoïde et la pie. Plus récemment, il a été reconnu que les méninges jouent également un rôle important dans le développement du cerveau et du cerveau homéostasie 1. Méninges sont dérivées de cellules mésenchymateuses et dérivées de la crête neurale et de façon intéressante, il a été démontré que les cellules souches résidant dans les méninges peuvent donner naissance à des neurones in vitro et in vivo après transplantation 2, 3, 4. Les cultures méninges ont également été utilisées avec succès en tant que couches d&#39;alimentation, car ils possèdent une activité inductrice dérivé des cellules stromales de la différenciation des cellules souches embryonnaires dans des neurones dopaminergiques 5. En outre, les leptoméninges ont le potentiel de se différencier en neurones directement, les astrocytes, les oligodendrocytes et dans des conditions ischémiques 6. Pour ce protocole, les échantillons de meninges post-mortem humaines sont collectées à partir de l&#39;arachnoïde et la pie, collectivement appelées les méninges, et sont achetés dans le cadre d&#39;un don de cerveau humain à des fins de recherche. Dissection du cerveau est effectué dans les 24 h de la mort et l&#39;échantillon de leptoméninge est placé dans un milieu de croissance à froid pour un traitement ultérieur dans le 6-8 suivant h comme illustré ici dans ce protocole. Ce protocole décrit la dissection et la préparation d&#39;échantillons de méninges humaines pour le développement de la culture de cellules de leptoméninge primaires patient. Le tissu est découpé en morceaux d&#39;environ 25-30 3 mm x 3 mm carrés. Trois pièces sont placées dans chaque 6 puits revêtues de gélatine bien et maintient avec des lamelles de verre rondes. La dissection meninges prend environ 25-35 min. Le principal défi de cette culture est la stérilité comme le cerveau l&#39;approvisionnement, le transport, et la dissection ne sont généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Tonc, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B et en utilisant des plats multi-puits pour la culture séparément des morceaux de tissu. Excroissance des fibroblastes méningés se produit généralement dans la première semaine. Le support est changé tous les deux à trois jours jusqu&#39;à ce que les cellules soient confluentes et les cellules sont repiquées par voie enzymatique. Les fibroblastes méningées sont cryoconservés à 1 million de cellules par mL / flacon dans les milieux de cryoconservation. Avec ce protocole, 20-30 millions de fibroblastes méningées peuvent être dérivées en 6-8 semaines pour la cryoconservation. Les applications en aval de ces fibroblastes méningées sont des cultures primaires pour la recherche sur la maladie, la différenciation neuronale directe ou dérivation de cellules souches pluripotentes induites à partir de la leptoméninge pour la compréhension des mécanismes de la maladie et pour le développement de médicaments.

<table><tbody><tr><td>Corning Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Plaque à 6 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles de 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels, lame stérile, n° 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe de précision incurvée</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL Unité de filtration</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Combiner les composants du média et filtre.</td></tr><tr><td>Flacons traités pour la culture cellulaire Nunc avec bouchons filtrants, T175 cm2&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Société</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B (solution jaune/250 &micro ; g/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Coloration à la fibronectine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 lames de chambre de puits&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20 % de paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100 % Glycérol&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre 100 % normal&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Fibronectine [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>Dilution 1:300 dans une solution bloquante</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>Dilution 1:250 dans une solution bloquante</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>dilution 1:100 dans une solution bloquante</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 dilution dans une solution bloquante</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>dilution 1:1 000 dans une solution bloquante</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-lapin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>dilution 1:400 dans une solution bloquante ; (canal vert ; Ex/EM2 495/519 nm)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-souris</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>dilution 1:400 dans une solution bloquante ; (canal rouge ; Ex/Em2 590/617 nm)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 coloration</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>diluer à une concentration finale de 1,0 &mu ; g/mL ; (chaîne bleue ; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Les fournisseurs sont des suggestions, des produits similaires provenant d’autres fournisseurs peuvent également être utilisés.</td></tr></tbody></table>

dérivation des cultures leptoméninge explants de postmortem humaines donateurs cerveau

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Même si des progrès considérables ont été accomplis dans la caractérisation clinique de la maladie de Parkinson, de nombreuses études indiquent que le diagnostic de la maladie de Parkinson n&#39;a pas pathologiquement confirmé dans jusqu&#39;à 25% de la maladie de Parkinson diagnostiquée cliniquement. Par conséquent, les tissus prélevés chez des patients cliniquement diagnostiqués avec la maladie de Parkinson idiopathique peut avoir un taux élevé d&#39;erreur de diagnostic; par conséquent , des études in vitro à partir de ces tissus pour étudier la maladie de Parkinson comme un modèle pré - clinique peut devenir inutile. En recueillant leptoméninge humains post - mortem avec un diagnostic neuropathologique confirmé de la maladie de Parkinson et caractérisé par la perte de cellules nigro et inclusions protéiques intracellulaires appelées corps de Lewy, on peut être certain que le parkinsonisme cliniquement observé est pas causée par un autre processus pathologique sous - jacent (par exemple , la tumeur, l&#39; artériosclérose). Ce protocole présents la dissection et la préparation des leptoméninge humains post-mortem pour la dérivation d&#39;une culture de fibroblastes méningée. Cette procédure est robuste et a un taux de réussite élevé. Le défi de la culture est la stérilité que l&#39;acquisition du cerveau est généralement pas réalisée dans des conditions stériles. Par conséquent, il est important de compléter le milieu de culture avec un cocktail de pénicilline, streptomycine et amphotéricine B. La dérivation des fibroblastes méningées des cas d&#39; autopsie confirmés de la maladie de Parkinson est la base pour la modélisation in vitro de la maladie de Parkinson. fibroblastes méningées apparaissent 3-9 jours après la préparation des échantillons et environ 20-30 millions de cellules peuvent être cryoconservés dans 6-8 semaines. La culture de fibroblastes méningée est homogène et les cellules expriment la fibronectine, un marqueur couramment utilisé pour identifier les méninges.

Lorsque le protocole de traitement de leptoméninge a réussi, l&#39;excroissance des fibroblastes méningés est d&#39;abord observé trois à neuf jours après la dissection, bien que cela peut dépendre de la durée de l&#39;intervalle post-mortem du cerveau. La figure 1 montre des cultures de fibroblastes méningées de quatre donneurs différents. La figure 1A montre une pièce tenue par une lamelle de verre (diagonale sombre) et fibroblaste excroissance autour ...

Le protocole de culture leptoméninge explant de post-mortem du cerveau humain est un moyen techniquement robuste et simple pour obtenir des fibroblastes méningées fibronectine positifs dans les 6-8 semaines et cryoconservation environ 20-30000000 cellules.

Dérivation des cultures leptoméninge explants de Postmortem humaines donateurs cerveau

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Je m’appelle Birgitt Schule et je dirige le programme de don de cerveaux à l’Institut et au Centre clinique Parkinson. Dans cette vidéo, nous décrivons une technique de culture cellulaire d’explant et la durée du fibroblaste primaire à partir de leptoméninges du cerveau humain post-mortem de patients atteints de la maladie de Parkinson. Ces fibroblastes peuvent être utilisés pour diverses applications, y compris des tests cellulaires.C’est important, car nous pouvons étudier des lignées cellulaires de cas de maladie de Parkinson sporadique avec pathologie à corps de Lewy prouvés par l’autopsie. Commencez par placer tous les matériaux requis dans le capot de culture tissulaire. Tous les objets entrant dans la hotte doivent être pulvérisés avec de l’éthanol à 70 % et essuyés.La première étape consiste à transférer les méninges du tube dans le plat de découpe. Commencez par verser environ 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans un plat de coupe stérile de 10 centimètres. Ici, vous pouvez voir les méninges.À l’aide d’une pince stérile, transférez soigneusement les méninges dans le plat de découpe. Effectuez cette étape lentement pour éviter les déchirures. L’étape suivante consiste à laver les méninges dans du PBS pour éliminer autant de sang que possible.Si votre échantillon est trop sanglant, vous pouvez envisager de le transférer dans un autre plat de découpe. Ajoutez encore 10 millilitres de PBS dans un plat frais de 10 centimètres. Répétez ce lavage pour continuer à éliminer le sang des méninges.Enfin, transférez les méninges dans un plat frais de 10 centimètres contenant du PBS. Lorsque vous avez terminé, couvrez la parabole et transférez-la dans le microscope de dissection dans la hotte à flux laminaire. L’étape suivante consiste à continuer à sectionner les méninges en petits morceaux.À l’aide de deux scalpels stériles, séparez doucement les vaisseaux sanguins des méninges avec un léger mouvement de grattage. Préparez une zone suffisamment grande pour couper environ 18 morceaux de 3 millimètres sur 3 millimètres, comme illustré sur cette image. Ensuite, prenez le scalpel et, à l’aide d’un mouvement de balancement, divisez la région préparée en morceaux de 3 millimètres sur 3 millimètres.Il est plus facile de le faire par étapes en coupant d’abord les méninges en morceaux plus gros, puis en coupant ces morceaux en sections plus petites. Couvrez le plat de coupe et transférez-le dans le capuchon de culture tissulaire. Ensuite, préparez-vous à transférer les méninges dans une plaque de culture tissulaire à six puits qui a été assez recouverte de 1 millilitre de gélatine à 0,1 pour cent pendant 30 à 60 minutes.Ajoutez un millilitre de méninges dans chaque puits. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, transférez trois à quatre morceaux de méninges au centre de chaque puits. Les cellules cultivées sur cette plaque seront un passage zéro.L’étape suivante utilise des lamelles pour s’assurer que les morceaux de méninges sont immobiles et restent en contact avec la boîte de culture. Placez une lamelle circulaire stérile de 15 millimètres sur les morceaux de méninges. Si nécessaire, repositionnez les morceaux de méninges à l’aide d’une lamelle.Ensuite, à l’aide de la pince, appuyez fermement sur la lamelle pour vous assurer que les pièces touchent la plaque. Cette image montre les morceaux de méninges maintenus en place à l’aide d’une lamelle. Placez le couvercle sur la plaque à six puits et transférez soigneusement la plaque dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Après deux jours de culture, ajoutez un millilitre supplémentaire de milieux de méninges frais dans chaque puits. À sept jours, aspirez les médias. Ensuite, remplissez chaque puits avec 2 millilitres de milieu frais.Après le septième jour, continuez à remplir les puits avec 2 millilitres de milieu frais tous les deux jours. Cette image montre le premier jour des morceaux de méninges et la culture sous un microscope inversé. Après environ six à neuf jours, on peut observer une fixation cellulaire dans la première excroissance.Entre 15 et 19 jours, le nombre de cellules augmente et la croissance devient plus dense. Les fibroblastes méningés sont caractérisés par l’expression de la fibronectine. Ces images montrent des cellules méningées en culture qui ont été colorées et qui sont positives pour la fibronectine.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dériver des cultures d’explants de leptoméninges à partir de donneurs de cerveau humain post-mortem. Cette technique offre un moyen simple et robuste de dériver un fibroblaste méningé en trois à six semaines, et permet de stocker 15 à 20 millions de cellules à un faible nombre de passages.

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