la culture de Caenorhabditis elegans En trois dimensions dans le laboratoire

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer un système de culture tridimensionnel pour les nématodes qui pourrait mieux simuler les conditions naturelles. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine du développement, de la physiologie et du comportement de Célégan. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous étudiions le comportement naturel des nématodes dans les fruits en décomposition, qui est un environnement 3D.

Cette technique est avantageuse par rapport aux techniques de culture bidimensionnelles standard car les nématodes résident dans des habitats 3D dans la nature. Bien que cette méthode ait été développée pour la culture de C elegans, elle peut également être appliquée à d’autres nématodes. La démonstration de cette procédure sera faite par Tong Young Lee, un étudiant diplômé de mon laboratoire.

Pour commencer cette procédure, Otto Clave a préparé les solutions à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, préparez 50 millilitres de la solution de cholestérol stérile à 5 milligrammes par millilitre. Dans un tube conique de 50 millilitres, ajoutez 0,25 gramme de cholestérol et 50 millilitres d’éthanol à 99,99 % et mélangez bien.

Ensuite, stérilisez la solution de cholestérol à l’aide d’une seringue de 50 millilitres avec un filtre de seringue ventilé de 0,45 et retirez tout cholestérol non développé. Ensuite, inoculez 10 millilitres de bouillon de lysogénie avec des bactéries. Cultivez l’inoculation bactérienne à 37 degrés Celsius dans un incubateur agitant pendant la nuit.

En préparation d’une dilution en série, répartissez neuf millilitres de la solution de chlorure de sodium dans sept tubes coniques stériles de 15 millilitres. Pour faire une tente de la septième dilution d’Opi 50 Souche E Coli. Ensuite, sortez un millilitre de la culture bactérienne ou de la culture bactérienne diluée dans un nouveau tube avec neuf millilitres de solution de chlorure de sodium.

Et vortex bien le mélange. Après avoir préparé la culture bactérienne, ajoutez 0,6 gramme de chlorure de sodium, un gramme de tarière granulée et 0,5 gramme de peptone dans une fiole de 500 millilitres. Placez une barre d’agitation magnétique dans la fiole.

Ajoutez ensuite 195 millilitres d’eau distillée et couvrez le ballon d’une feuille d’aluminium. Ensuite, Otto Clave l’échantillon à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, placez la fiole chaude d’Otto Claved dans une plaque à mélanger, remuez à vitesse modérée pendant au moins deux heures jusqu’à ce qu’elle atteigne 40 degrés Celsius.

Alternativement, le ballon peut être refroidi à 40 degrés Celsius en le plaçant dans un bain-marie à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes avant de le transférer sur une plaque à mélanger. Assurez-vous de refroidir suffisamment en continuant à partir d’ici. Une température élevée peut entraîner l’opacification de la vis sans fin, mais une température trop basse peut entraîner un durcissement prématuré de la tarière.

Lorsque la température de la vis sans fin atteint 40 degrés Celsius, ajoutez du chlorure de calcium, une solution de cholestérol, du sulfate de magnésium et un tampon de phosphate de potassium et continuez à remuer la solution. Pour le test de durée de vie NGT-3D, ajoutez 80 microlitres de FUDR de 150 millimètres au média pour obtenir une concentration finale de 120 micromolaires. Ensuite, prélevez six millilitres de milieu de tarière dans un tube conique stérile et gardez-le au chaud dans un incubateur.

Ce média sera utilisé pour la couche supérieure exempte de bactéries. Ajoutez ensuite six millilitres de la culture bactérienne diluée dans le ballon directement sur une paillasse stérilisée. Pour le NGT-3D, versez 6,5 millilitres de média dans les tubes à essai en plastique transparent de huit millilitres pour former une couche de tarière bactérienne.

Et distribuez soigneusement 200 microlitres de média sans bactéries sur le support 3D semi-dur pour former une fine couche sans bactéries sur le dessus. Fermez ensuite hermétiquement le couvercle de la chambre. Pour NGB-3D, versez 65 millilitres de milieu dans une bouteille de culture cellulaire en plastique transparent de 25 centimètres carrés.

Positionnez ensuite la chambre verticalement à température ambiante pendant une semaine pour permettre aux colonies bactériennes d’atteindre une taille considérable d’au moins un millimètre de diamètre. Dans cette procédure, choisissez un ver à quatre étages L et transférez-le dans une plaque NGM sans bactéries. Laissez ensuite le ver se déplacer librement pendant quelques minutes afin d’éliminer les bactéries de son corps.

Et répétez la procédure deux fois de plus. Ensuite, placez soigneusement le ver propre sur la surface du support 3D. Le ver aurait dû entrer dans la tarière dans la matrice de la tarière 3D.

Fermez ensuite le couvercle sans serrer pour incuber pendant 96 heures à 20 degrés Celsius. Après quatre jours, fermez bien le couvercle et placez la chambre de culture NGT-3D dans un bain-marie à 88 degrés Celsius pour faire fondre la tarière. À l’aide d’une pipette en verre, transférez le support fondu sur une boîte de Pétri en plastique de neuf centimètres.

Ensuite, à l’aide d’un microscope stéréo de dissection à transmission, comptez le nombre de vers aux stades L3, L4 et adulte. Comme illustré ici, la construction de NGT-3D est un protocole simple et direct qui aboutit à un tube à essai rempli de tarière avec de petites colonies bactériennes espacées dans toute la tarière. Pour confirmer si C elegans peut réduire et croître normalement en NGT-3D, la fertilité et le développement des larves sont comparés en 3D avec les plaques NGM 2D standard.

Dans l’essai sur la taille relative du couvain, les hermaphrodites adultes de C. elegans dans NGT-3D se reproduisent aussi bien que les hermaphrodites dans les plaques MGM 2D standard lorsque les colonies bactériennes sont abondantes avec au moins 60 colonies. De plus, le développement des larves dans NGT-3D se déroule également normalement lorsqu’il y a beaucoup de colonies bactériennes, la majorité des vers étant à l’état adulte après 96 heures. Cependant, si les colonies bactériennes sont clairsemées dans la matrice 3D, la taille relative de la couvée et le développement des larves sont affectés négativement.

Voici une courbe de survie des elegans sauvages de type C en plaques NGT-3D ou NGM. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les tests de durée de vie et l’analyse comportementale peuvent être effectuées afin de répondre aux questions sur le vieillissement et le comportement en 3D.

Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans les domaines de la génétique pour explorer des questions sur l’écologie et l’évolution chez Célégans. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver les nématodes dans un environnement de laboratoire 3D.