Cell-gratuit Analyse d'intégrité de l'ADN dans des échantillons d'urine

L’objectif global de cette méthode est d’évaluer l’intégrité de l’ADN acellulaire de l’urine à des séquences oncogènes spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer urologique, telles que le diagnostic précoce non invasif du cancer de la vessie et de la prostate. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à faire et à analyser.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des tumeurs malignes urologiques, car elles libèrent normalement des cellules et des acides nucléiques libres dans l’urine. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur des échantillons urinaires, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que le sérum ou le plasma. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auraient du mal car la concentration d’ADN acellulaire dans l’urine est souvent faible.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé de trouver une méthode simple pour la détection précoce non invasive du cancer de la vessie. Pour commencer la procédure, procurez-vous un échantillon d’urine propre de 50 millilitres qui a été conservé à quatre degrés Celsius pendant au plus trois heures. Retournez l’échantillon deux fois, puis divisez-le dans deux tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres.

Centrifugez l’échantillon à 850 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, pour chaque tube, transférez 10 millilitres de la partie supérieure du surnageant dans deux tubes de cinq millilitres, en laissant au moins deux millilitres de surnageant au-dessus de la pastille. Jetez les granulés et conservez le surnageant à moins 80 degrés Celsius.

Répétez ce processus pour des échantillons d’urine supplémentaires au besoin. Pour commencer la purification de l’ADN, pour chaque échantillon, décongelez une aliquote de surnageant d’urine. Vortex l’échantillon décongelé et retournez le tube deux fois.

Placez un millilitre de l’échantillon dans un tube de cinq millilitres et conservez le reste à moins 80 degrés Celsius. Préparez un kit de purification d’ADN adapté aux échantillons d’urine selon les instructions du fabricant. Ajoutez 100 microlitres de protéinase K et un millilitre de tampon de lyse à l’échantillon et mélangez bien avec une pipette.

Incuber l’échantillon à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, préparez les tampons de lavage dans une colonne d’essorage. Après l’incubation, laissez l’échantillon refroidir à température ambiante, puis ajoutez un millilitre d’éthanol absolu et mélangez bien par pipetage.

Transférez 650 microlitres de l’échantillon dans la colonne. Centrifugeuse à 6000 fois G pendant une minute. Replacez le tube de prélèvement et répétez ce processus jusqu’à ce que tout l’échantillon ait été chargé sur la colonne.

Ajoutez ensuite 500 microlitres du premier tampon de lavage et centrifugez la colonne à 6000 fois G pendant une minute. Replacez le tube de collecte, ajoutez 500 microlitres du deuxième tampon de lavage et centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant trois minutes. Placez la colonne dans un tube de collecte propre et centrifugez à vitesse maximale pendant encore trois minutes pour éliminer le tampon de lavage résiduel.

Transférez la colonne dans un microtube à centrifuger propre de 1,5 millilitre. Chargez 50 microlitres de tampon d’élution sur la colonne et laissez le tampon s’imprégner dans la colonne pendant sept minutes. Ensuite, centrifugez la colonne à 6000 fois G pendant une minute.

Pipetez l’éluat dans la colonne et centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant une minute pour obtenir l’ADN acellulaire de l’urine. Pour commencer à préparer les normes, isolez d’abord l’ADN d’une lignée cellulaire appropriée à l’aide d’un kit de purification. Quantifiez l’ADN de chaque échantillon d’urine purifié de la lignée cellulaire à l’aide d’un spectrophotomètre selon les instructions du fabricant du kit.

Diluez l’ADN UCF à un nanogramme par microlitre et stockez les échantillons dilués à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le test d’intégrité. Diluez l’ADN de la lignée cellulaire pour créer six étalons de 100 microlitres de différentes concentrations. Conservez les étalons à moins 20 degrés Celsius.

Pour commencer le test d’intégrité de l’ADN, décongelez les échantillons d’ADN UCF, les normes, les amorces PCR appropriées et le supermix vert sur glace. Ensuite, installez la plaque de disque du rotor à 72 puits avec des tubes à bandes. Placez deux aliquotes de 10 microlitres d’étalon, puis chaque échantillon dans des puits.

Préparez deux puits de 10 microlitres d’eau sans RNase comme contrôles négatifs. Pour chaque puits rempli, préparez un mélange d’un microlitre de chaque apprêt, de 12,5 microlitres de supermix vert et de 6,5 microlitres d’eau sans RNase. Transférez 15 microlitres du mélange dans chaque puits rempli, puis transférez les puits dans un disque rotor de 72 puits.

Effectuez la PCR avec un instrument en temps réel selon les spécifications du fabricant. À l’aide du logiciel de l’instrument, vérifiez si certaines répliques ont une différence de valeur de seuil de cyclage d’une ou de plusieurs. Éliminez ces échantillons de l’analyse et évaluez le seuil médian de cycle pour les échantillons restants.

Effectuez une analyse de fusion sur chaque échantillon avec une valeur seuil de cyclage médiane de 36 ou moins pour évaluer la spécificité du produit PCR. Ensuite, utilisez la courbe standard pour déterminer une concentration en nanogrammes par microlitre pour chaque applicon. L’ADN acellulaire de l’urine a été isolé et l’intégrité de l’ADN a été évaluée dans quatre régions qui montrent une augmentation du nombre de copies d’ADN dans les tumeurs solides.

Une séquence de contrôle a également été évaluée pour vérifier que la quantité d’ADN dans chaque échantillon était suffisante pour le test d’intégrité. La concentration totale en ADN libre et les coefficients de variation ont été calculés pour chaque gène. Cette méthode montre une sensibilité de 73 % et une spécificité de 84 % pour la détection du cancer de la vessie, mais seulement une sensibilité de 58 % et une spécificité de 44 % pour le cancer de la prostate.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée de travail si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR numérique ou le séquençage de nouvelle génération peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’inducteur du nombre de copies des gènes d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ADN acellulaire de l’urine de manière très simple, et comment étudier l’intégrité de régions d’intérêt spécifiques à l’aide d’approches PCR en temps réel.