Un rapide, méthode évolutive pour l'isolement, l'étude fonctionnelle, et l'analyse de la matrice extracellulaire de cellules dérivées

L’objectif global de cette procédure est d’isoler la matrice extracellulaire des cellules cultivées pour une grande variété d’expériences en aval, afin d’aider à comprendre les fonctions et les propriétés de la matrice extracellulaire dans les tissus normaux et les processus pathologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la matrice extracellulaire, telles que l’organisation, la composition moléculaire, les interactions protéiques ou les propriétés fonctionnelles de la matrice extracellulaire. De plus, la matrice extracellulaire pourrait être préparée à partir de n’importe quel type de cellule adhérente.

Le principal avantage de cette technique est qu’elles peuvent être réalisées à différentes échelles pour éliminer efficacement les cellules et retenir les protéines de la matrice extracellulaire. Silvia Rosini, étudiante diplômée dans mon laboratoire, et Andrew Hellewell, chercheur postdoctoral, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, des cellules sur plaques sur des lamelles pour l’imagerie de cellules vivantes et de matrice extracellulaire ou ECM.

Pour les études de microscopie à fluorescence, un ECM fixe. Ou pour la préparation de la MEC dérivée de cellules pour des études fonctionnelles à petite échelle. Incuber les cellules à une température et une humidité appropriées pendant un moment approprié pour que les cellules déposent l’ECM.

Généralement supérieur à 16 heures. Dans une hotte aspirante, préparer de l’hydroxyde d’ammonium de 20 millimolaires dans un récipient approprié en utilisant de l’eau désionisée pour diluer la solution mère de un à 14. Retirez les cellules de l’incubateur et retirez délicatement le milieu de culture.

Ajoutez ensuite du PBS sans calcium ni magnésium en versant doucement contre la paroi du plat. Secouez le plat deux fois et versez le liquide. Ensuite, répétez le lavage deux fois de plus.

Dans la hotte aspirante, retirez le dernier lavage PBS, ajoutez 1,5 millilitre d’hydroxyde d’ammonium par plat de 60 millimètres et incubez les plaques à température ambiante pendant cinq minutes. Agitez doucement les plats toutes les minutes pour assurer la lyse de toutes les cellules. Ensuite, ajoutez de grandes quantités d’eau déminéralisée dans chaque plat et secouez l’assiette.

Versez ensuite le matériau solubilisé à l’hydroxyde d’ammonium, qui est composé d’hydroxyde d’ammonium, de cellules lysées et d’eau déminéralisée. Lavez la couche ECM insoluble dans de grandes quantités d’eau déminéralisée quatre fois de plus, pour assurer l’élimination complète de tout le matériau solubilisé à l’hydroxyde d’ammonium. Il est essentiel que les cellules soient complètement éliminées avec des lavages copieux à l’eau déminéralisée.

Si ces étapes ne sont pas effectuées de manière adéquate, le matériel cellulaire peut rester sur la parabole et contaminer l’analyse en aval. Pour l’examen de l’ECM par immunofluorescence, retirer l’eau désionisée restante, fixer l’ECM en ajoutant 2 % de paraformaldéhyde, abrégé PFA, et incuber les plats à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez le PBS pour laver chaque échantillon fixe deux fois et jetez la solution dans un récipient à déchets liquides avant d’effectuer la microscopie à fluorescence conformément au protocole de texte.

Dans une hotte à flux laminaire, préparez des solutions stériles de PBS sans calcium ni magnésium, d’hydroxyde d’ammonium 20 millimolaires et d’eau désionisée en faisant passer chaque solution à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre dans un récipient stérile approprié. Tout en maintenant la technique de stérilité, utilisez du PBS stérile pour laver doucement les cellules productrices de matrice sur des lamelles de recouvrement à trois reprises. Après avoir retiré le lavage final du PBS, ajoutez 1,5 millilitre d’hydroxyde d’ammonium stérile dans la boîte de 60 millimètres et incubez à température ambiante pendant cinq minutes avec un balancement intermittent

Ajoutez de grandes quantités d’eau déminéralisée stérile dans la boîte à bascule, versez le lysat cellulaire dans un récipient à déchets approprié. Répétez ce lavage quatre fois de plus pour assurer l’élimination complète du matériau solubilisé. Après avoir trypsinisé et granulé les cellules conformément au protocole textuel, remettre les cellules d’essai en suspension dans un milieu stérile frais et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensuite, plaquez le nombre approprié de cellules d’essai et de milieu de culture sur l’ECM isolé stérile sur des lamelles de recouvrement et incubez pendant deux à trois heures ou pendant le temps nécessaire. Pour examiner l’organisation du cytosquelette d’actine, fixez les cellules tests dans 2 %PFA et colorez-les avec FITC-Phalloidin pour visualiser l’actine F, et DAPI pour visualiser les noyaux. Après avoir cultivé un grand nombre de cellules, puis retiré les cellules et lavé l’ECM comme démontré précédemment dans la vidéo, inclinez chaque plaque de manière à évacuer l’eau résiduelle vers le fond de la boîte et utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement toute eau restante jusqu’à ce que la plaque soit complètement sèche.

En même temps, chauffez le tampon d’échantillon SDS-PAGE contenant 100 millimolaires de DDT à 95 degrés Celsius pendant deux minutes et ajoutez 200 microlitres à chaque plaque de 100 millimètres à examiner par immunoblot. À l’aide d’un grattoir à cellules, rassemblez l’échantillon d’un côté de la boîte et utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour le transférer dans un tube. Pour analyser l’ECM par spectrométrie de masse, préparez un échantillon plus concentré en prélevant le tampon d’échantillon SDS-PAGE de la boîte, en le réchauffant à 95 degrés Celsius et en utilisant la même aliquote sur deux à trois plaques supplémentaires.

Transférez tout extrait résiduel de tampon d’échantillon SDS-PAGE de la pointe du racleur de cellule dans le tube afin de minimiser la perte de matériau ECM. Pour une extraction efficace de l’ECM isolé dans le tampon d’échantillon SDS-PAGE, il est essentiel que le tampon d’échantillon soit chauffé à 95 degrés, qu’il contienne un agent réducteur et que la plaque soit largement grattée. On voit ici des cellules COS-7 cultivées sur des lamelles en verre.

traitement à l’hydroxyde d’ammonium a permis d’éliminer efficacement les cellules, comme l’a établi la perte des noyaux cellulaires et du cytosquelette d’actine. Dans cette figure, les cellules COS-7 ont été transfectées avec l’étiquette RFP thrombospondin-1. Et l’ECM a été visualisée avant et après le traitement à l’hydroxyde d’ammonium.

On déduit que les puncta fluorescents identifiés dans les deux images sont associés à l’ECM. Dans cette expérience, des fibroblastes dermiques humains ont été retirés avec de l’hydroxyde d’ammonium et l’ECM a été sondée avec un anticorps anti-collagène 1, qui a démontré un motif de coloration fibulaire et maillé caractéristique. Comme le montre ici, la coloration à la fibronectine a été réalisée sur l’ECM à partir de cellules de chondrosarcome de rat extraites à l’hydroxyde d’ammonium.

Dans cet exemple, les cellules COS-7 de test ont été plaquées pendant deux heures sur une ECM stérile produite par des cellules RCS et analysées pour l’organisation de l’actine F par coloration FITC-Phalloidine. Par rapport aux cellules COS-7 produisant leur propre ECM. Dans cette expérience, l’ECM a été isolée à partir de cellules de chondrosarcome de rat et les protéines dérivées de l’ECM ont ensuite été séparées par SDS-PAGE.

Et les quatre bandes principales ont été isolées et analysées par spectrométrie de masse. La fibronectine, la thrombospontine-1 et cinq, et la matriline-1 ont été identifiées. Enfin, la MEC endogène des fibroblastes dermiques humains a été analysée par immunoblottage.

La fibronectine et la thrombospondine-1 ont été détectées, tandis que les protéines intracellulaires alpha-tubuline et bêta-actine étaient absentes. Une fois maîtrisée, l’élimination des cellules avec de l’hydroxyde d’ammonium et l’extraction de l’ECM avec un tampon d’échantillon SDS-PAGE chaud à partir de trois boîtes de 100 millimètres peuvent être effectuées en une heure si elles sont effectuées correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer des solutions d’hydroxyde d’ammonium frais à chaque fois pour éliminer les cellules.

Il est également très important d’utiliser des lavages copieux avec de l’eau déminéralisée pour s’assurer d’éliminer toutes les cellules. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que l’analyse protéomique de l’ECM extraite peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles qu’une abondance relative de protéines ECM produites par différents types de cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’éliminer efficacement les cellules des boîtes de culture cellulaire et de la façon d’extraire l’ECM.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans une hotte aspirante et le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.