L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

L’objectif global de l’utilisation d’une construction marquée GFP est de confirmer l’identité d’une protéine jusqu’alors inconnue en utilisant la GFP comme poignée. Cette méthode peut aider à l’identification fonctionnelle des gènes orphelins lorsqu’une activité enzymatique spécifique n’est pas disponible pour confirmation. Le principal avantage de cette technique est que le GPF-tag permet d’utiliser la même construction pour plusieurs types d’expériences.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des problèmes, car la transfection n’aboutit pas toujours à l’expression de construction forte, et les cellules ne revivent pas toujours. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode, lorsque nous avons commencé à reconnaître les difficultés d’identifier une protéine en utilisant uniquement des anticorps créés contre elle. Commencez par remettre en suspension les cellules d’intérêt dans un millilitre de tampon d’électroporation saline tamponné HEPES et placez immédiatement les cellules sur de la glace.

Ajoutez un volume suffisant de plasma marqué au GFP-TMEM184A dans les cellules pour atteindre une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre d’ADN, et transférez environ 0,4 millilitre de cellules dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie. Électroporez les cellules. Ensuite, voyez les cellules transfectées dans des boîtes de culture tissulaire et placez les boîtes dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 72 heures.

L’étape de transfection est l’étape la plus critique de la procédure, car la plupart des travaux expérimentaux restants ne peuvent pas être menés à bien si les cellules ne sont pas viables et n’expriment pas de niveaux significatifs de la construction marquée GFP. Au moment expérimental approprié, ajoutez 100 microgrammes par millilitre d’héparine de rhodamine au milieu de culture cellulaire exprimant le plasmide GFP, et incubez les cellules, à l’abri de la lumière, jusqu’à ce que le niveau de coloration souhaité soit atteint, tel qu’observé par la microscopie à fluorescence. Ensuite, rincez les cellules avec du PBS et quelques secondes de secousse douce, à l’abri de la lumière, suivie d’une fixation avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante avec une agitation douce.

Pour évaluer la co-localisation de l’héparine de rhodamine marquée à la GFP, utilisez un microscope confocal avec les lasers appropriés à excitation et diminution de la GFP et de la rhodamine pour imager au moins 50 cellules de chaque expérience de marquage distincte. Examinez les images dans le programme d’analyse d’images approprié pour déterminer la présence et l’absorption relatives de la rhodamine dans chaque cellule, à l’aide d’un outil à main levée pour encercler les cellules dans chaque image fluorescente. Utilisez l’outil de mesure pour déterminer l’intensité dans chaque espace encerclé, puis exportez les données d’intensité de fluorescence vers une feuille de calcul pour calculer la surface multipliée par l’intensité, en soustrayant l’arrière-plan pour la même quantité de surface pour chaque cellule.

La moyenne de la fluorescence par cellule pour l’ensemble des cellules permet d’obtenir des données statistiquement significatives. Pour faciliter le transfert d’énergie de résonance de fluorescence de la TMEM184A GFP à l’héparine de rhodamine, montez d’abord des cellules TMEM184A de GFP fixes marquées à l’héparine de rhodamine sur des lames de microscope en verre. Excité les cellules à 405 nanomètres pour l’imagerie de l’émission de Rhodamine, suivie d’une excitation de 488 nanomètres pour imager l’émission de GFP.

Puis exciter les cellules à 561 nanomètres pour une seconde imagerie d’émission de Rhodamine. Pour l’imagerie de cellules vivantes de l’absorption de l’héparine de rhodamine, ensemencez une culture de 100 millilitres de cellules transfectées par TMEM184A GFP dans des boîtes d’imagerie de cellules vivantes de 635 millimètres pour obtenir des cellules près de la confluence. Après 48 heures, remplacez le surnageant par un milieu de culture sans rouge de phénol et transférez une boîte de cellules dans un microscope confocal avec un stade de réchauffement réglé à 37 degrés Celsius.

Concentrez le microscope et ajoutez 100 microgrammes par millilitre d’héparine de rhodamine aux cellules en mélangeant doucement. Ensuite, commencez immédiatement à enregistrer les images en direct. Si aucune absorption d’héparine ne se produit dans le champ de vision, déplacez légèrement la parabole pour identifier les cellules avec au moins une vésicule verte, contenant l’étiquette de rhodamine.

Pour une évaluation in vitro de la liaison à l’héparine, rincer une plaque noire à 96 puits revêtue d’ativan et une plaque noire non revêtue à 96 puits avec 200 microlitres de 0,2 % de CHAPS PBS pro-well pour trois lavages de cinq minutes avec agitation. Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de 60 picomoles par puits d’anti-GFP biotinylé en trois exemplaires sur la plaque recouverte d’ativan pour chaque groupe de recherche de GFP. Ensuite, ajoutez un tampon uniquement aux puits de contrôle et scellez tous les puits avec un couvercle de plaque pour une incubation de deux heures à température ambiante avec agitation.

À la fin de l’incubation, laver tous les puits trois fois dans du CHAPS PBS, comme cela vient d’être démontré, et ajouter 100 microlitres de cinq nanomoles par puits de GFP TMEM184A, ou GFP seul, dans les puits appropriés de la plaque recouverte d’ativan. Après une incubation d’une heure à température ambiante avec agitation, laver tous les puits avec du CHAPS PBS frais et ajouter 100 microlitres de chaque concentration expérimentale de fluorescéine-héparine, dans les puits d’essai appropriés en trois exemplaires, sur la plaque recouverte d’ativan. Ajoutez les étalons de concentration aux plaques revêtues et non revêtues d’ativan, et incubez les deux plaques pendant 10 minutes à température ambiante, en agitant, à l’abri de la lumière.

Maintenant, utilisez un lecteur de plaques pour enregistrer l’émission initiale d’héparine-fluorescence dans les puits de contrôle des deux plaques, et l’émission initiale de fluorescence totale à partir des puits avec la GFP immobilisée ou la TMEM184A GFP dans la plaque recouverte d’ativan. Transférez ensuite l’héparine fluorescente non liée des puits avec la GFP immobilisée TMEM184A ou la GFP dans les puits correspondants de la plaque noire non revêtue. Après avoir immédiatement lu l’émission de fluorescence sur la plaque noire non revêtue, ajoutez 100 microlitres de CHAPS PBS frais dans les puits d’où la fluorescéine-héparine a été retirée, et lisez les émissions de fluorescence de ces puits pour obtenir l’émission de fluorescence des échantillons non liés retirés dans la plaque non revêtue.

Lorsque toutes les lectures non liées ont été obtenues, utilisez les valeurs d’émission d’héparine totale pour confirmer que les niveaux corrects d’héparine ont été ajoutés à chaque puits, en soustrayant les lectures de fond moyennes des valeurs. Créez ensuite un graphique de l’émission en fonction de la fluorescéine-héparine totale ajoutée, pour déterminer l’échelle de l’émission en fonction de la quantité d’héparine, et tracez le graphique de l’héparine liée corrigée, en fonction de l’héparine ajoutée pour les triplets des puits de TMEM184A GFP et GFP. La durée après la transfection a un impact sur la distribution de la GFP TMEM184A, qui semble s’accumuler sur au moins 72 heures, avec plus de GFP apparente dans la région paranucléaire au fil du temps.

Le modèle de coloration de la GFP dans cette culture de cellules vasculaires représentative semble être le plus similaire à celui d’un anticorps élevé contre un peptide C-terminal, un résultat logique, étant donné que la GFP se trouve à l’extrémité C-terminale de la protéine. L’utilisation d’un ligand fluorescéine-rhodamine-héparine peut également être utilisée pour l’évaluation en temps réel de la co-localisation des récepteurs de ligand au fil du temps. L’absorption de l’héparine est augmentée dans la GFP TMEM184A construire des cellules inactivées stables transfectées, ce qui donne des cellules qui peuvent retrouver la capacité d’internaliser l’héparine de rhodamine au niveau ou au-dessus du niveau des cellules de type sauvage.

En utilisant le système de tact GFP codé par plasmide démontré, la construction de la GFP TMEM184A isolée par anticorps anti-GFP démontre une liaison spécifique à l’héparine satriple, tandis que la GFP de contrôle ne se lie à aucune héparine. Une simple coloration par immunofluorescence avec des anticorps à nouveau GFP peut également fournir des informations sur l’emplacement de la GFP, sur la base de l’accès des anticorps dans les cellules non perméabilisées, fournissant des preuves préliminaires que la GFP exprimée au niveau de la membrane plasmique est extracellulaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut aboutir à une excellente expression de la construction GFP, après 24 à 48 heures de culture.

Lors de l’essai du protocole d’imagerie en direct, il est important de se rappeler que certaines cellules peuvent ne pas présenter l’absorption co-localisée, il est donc souvent nécessaire d’examiner d’autres cellules. Les tests de liaison avec des ligands GFP peuvent être compliqués par des dimères ou des agrégats d’ordre supérieur de la protéine GFP, en particulier s’ils se trouvent dans des micelles de détergent. Dans l’ensemble, l’expression de protéines marquées à la GFP peut faciliter une grande variété d’expériences pour confirmer l’identité d’une protéine jusqu’alors inconnue.