Name: Lutilisation dun TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Découvrez comment confirmer l'identité du récepteur à l'héparine TMEM184A en utilisant une construction marquée GFP dans des cellules vasculaires. Cette méthode permet d'identifier fonctionnellement les gènes orphelins.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recherche dans le laboratoire Lowe-Krentz est soutenue par des subventions de recherche HL54269 des National Institutes of Health à LLK.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l&#39;identification de TMEM184A en tant que récepteur de l&#39; héparine dans des cellules vasculaires 1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l&#39;identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l&#39;effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu&#39;une protéine candidate est en fait le récepteur app...

L&#39;identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d&#39;isolement basées sur l&#39;affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d&#39;héparine identifié après les interactions d&#39;affinité d&#39; héparine 1 et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) P2 2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés 3. De même, l&#39; identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l&#39; identification de nouvelles protéines 4TM 4. L&#39;examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l&#39;identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions 5. Après l&#39;identification, l&#39;analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l&#39;aide d&#39;un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d&#39;aquaporine. Lorsque cela est possible, la fonction d&#39;une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu&#39;ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l&#39;identification de protéines / fonction 6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines. L&#39;identification récente de TMEM184A comme un récepteur d&#39;héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d&#39;affinité et MALDI MS 1, 7 a été l&#39;occasion de développer une collection d&#39;essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l&#39;identification . Une étude récente a confirmé que l&#39; héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d&#39;adhésion cellulaire et d&#39; autres protéines 8. Dans le système vasculaire, l&#39; héparine et l&#39; héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d&#39; héparane des chaînes de structure similaire à l&#39; héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines 9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l&#39;absorption d&#39;héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l&#39;identité du TMEM184A comme un récepteur de l&#39;héparine.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A construct</td><td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Héparine</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Sensible à la lumière</td></tr><tr><td>Fluorescéine-Héparine</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Sensible à la Lumière Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA, sans méthanol)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, disponible auprès de Fisher Scientific</td><td>PI28908 chez Fisher</td><td>Utilisation dans les</td></tr><tr><td>plaques de neutravidine Reacti-bind de hotte (boîtes noires à 96 puits recouvertes d’Avidin)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, par l’intermédiaire de Fisher Scientific</td><td>PI15510 chez Fisher</td><td>Faites attention à la durée de conservation</td></tr><tr><td>des plaques noires à 96 puits</td><td>Corning Life Sciences Plastic, achetée auprès de Fisher Scientific</td><td>064432 chez Fisher</td><td></td></tr><tr><td>A7r5 Cellule musculaire lisse vasculaire ligne</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>Peut être échangé en MEM medium1</td></tr><tr><td>BAOEC cellules endothéliales aortiques bovines</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B304-05</td><td>La culture, telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour la poursuite de la culture1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC Cellules musculaires lisses de l’aorte bovine</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>La culture telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour la poursuite de la culture1</td></tr><tr><td>RAOEC cellules endothéliales aortiques de rat</td><td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td><td>La culture, telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour une culture continue7</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-GFP</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, par l’intermédiaire de Fisher Scientific</td><td>MA5-15256-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>Billes recouvertes de streptavidine</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Disponible chez Bio-Rad</td><td></td><td>Peut être préparée en laboratoire. Le pH est de 6,8</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorps contre l’anticorps N-terminal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006</td><td>Seul connu TMEM184A anticorps contre la région N-terminale.</td></tr><tr><td>TMEM184A anticorps dirigés contre l’extrémité C-terminale</td><td>obtenu auprès de ProSci Inc, Poway, CA&nbsp ;</td><td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci utilisé dans les anticorps Figure 1</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc9996</td><td>Utilisé dans les anticorps Figure 5</td></tr><tr><td>Secondaires, marqués avec TRITC ou Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (anti-âne anti-lapin, TRITC) 715 165 150 (âne anti-souris, Cy3)</td> <td>Réactivité croisée minimale pour minimiser toute coloration non spécifique.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Acheté chez Sigma</td><td>C5849</td><td>Notez que ce numéro de catalogue spécifique n’a plus été fabriqué.&nbsp ; Le fournisseur fournira des informations concernant le remplacement.</td></tr><tr><td>Imagerie en direct Boîtes de 35 mm</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 &ndash ; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta avec un objectif à immersion dans l’huile 63X</td><td>Utilisé pour les images et l’imagerie en direct dans les Figures 1, 2 et 3</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td>C2+ confocal avec un objectif à immersion dans l’huile 60X</td><td>Utilisé pour les images en Figure 5</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>LSM 880 avec un objectif à immersion dans l’huile 63X</td><td>Utilisé pour les images en Figure 2C</td></tr><tr><td>Electroporation Equipment</td><td>Bio-Rad</td><td>Gene Pulser X-Cell System</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation</td><td>Disponible auprès de MidSci</td><td>EC2L</td><td>Peut également être obtenu auprès du fournisseur d’équipement</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg ; m200 Pro Lecture</td><td>au milieu des puits plutôt qu’à la surface.</td></tr><tr><td>Programme d’ordinateur pour la mesure de l’intensité de la coloration</td><td>Image J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Programme et information disponibles en ligne</td><td>Tout programme approprié peut être utilisé. Voir https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html pour plus de détails. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Culture cellulaire trypsine solution</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td>achetée en solution 10x</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation d&#39;un tmem184a gfp-tagged construct pour confirmation de heparin receptor identity

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l&#39;isolement et l&#39;analyse bioinformatique basée sur l&#39;affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d&#39;autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d&#39;élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l&#39;extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l&#39; affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l&#39;identification des TMEM184A comme un récepteur d&#39;héparine 1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d&#39;autres nouvelles protéines.

Bien qu&#39;en théorie, la transfection d&#39;une construction d&#39; ADN dans des cellules peut être réalisée avec des réactifs de transfection lipophiles, les rapports précédents indiquent une transfection plus efficace de la GFP dans les cellules endothéliales construit en utilisant une électroporation 12. Le protocole fourni ici typiquement obtenu GFP dans la construction d&#39;expression supérieure à 80% des cellules endothéliales primaires et dérivées des ce...

Un TMEM184A codant pour la construction d&#39;une étiquette de la GFP à l&#39;extrémité carboxy-terminale conçu pour l&#39;expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l&#39;identification de TMEM184A comme récepteur d&#39;héparine dans les cellules vasculaires.

L&#39;utilisation d&#39;un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

L’objectif global de l’utilisation d’une construction marquée GFP est de confirmer l’identité d’une protéine jusqu’alors inconnue en utilisant la GFP comme poignée. Cette méthode peut aider à l’identification fonctionnelle des gènes orphelins lorsqu’une activité enzymatique spécifique n’est pas disponible pour confirmation. Le principal avantage de cette technique est que le GPF-tag permet d’utiliser la même construction pour plusieurs types d’expériences.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des problèmes, car la transfection n’aboutit pas toujours à l’expression de construction forte, et les cellules ne revivent pas toujours. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode, lorsque nous avons commencé à reconnaître les difficultés d’identifier une protéine en utilisant uniquement des anticorps créés contre elle. Commencez par remettre en suspension les cellules d’intérêt dans un millilitre de tampon d’électroporation saline tamponné HEPES et placez immédiatement les cellules sur de la glace.Ajoutez un volume suffisant de plasma marqué au GFP-TMEM184A dans les cellules pour atteindre une concentration finale de 20 microgrammes par millilitre d’

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Ici, nous démontrons l'utilisation de colorant fluorescent Alexa couplé à α-bungarotoxine à mesurer récepteur GABA A de localisation à la surface et l'endocytose dans les neurones de l'hippocampe. Grâce à l'utilisation de constructions portant une étiquette extracellulaire qui se lie à court α-bungarotoxine, l'analyse de la membrane plasmique protéine endocytose trafic peut être atteint.

L&#39;utilisation d&#39;un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic

Ce manuscrit décrit comment effectuer des tests basés sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) (molécule unique) pour mesurer la dynamique de liaison entre le récepteur de l’antigène des lymphocytes T (TCR) et les molécules du CMH chargées de peptides antigéniques telles qu’elles se produisent dans la synapse immunologique d’un lymphocyte T en contact avec une bicouche lipidique planaire fonctionnalisée.

Mesure de TCR-pMHC Reliure<em&gt; In Situ</em&gt; L&#39;aide d&#39;un essai basé sur la microscopie FRET-

Les protéines de l’enveloppe nucléaire jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques de base et ont été impliquées dans diverses maladies humaines.  Ce protocole décrit un nouveau modèle murin basé sur Cre/Lox qui permet le contrôle spatio-temporel de la perturbation des complexes LINC.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

les arythmies cardiaques héréditaires sont souvent provoquées par des mutations qui modifient la distribution de surface d'un ou plusieurs canaux ioniques. Ici, on adapte les essais de cytométrie en flux pour fournir une quantification de l'expression de la protéine totale et de la surface cellulaire relative des canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules 201 TSA.

Détermination de la surface de la cellule relative et d&#39;expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Nous présentons ici un protocole robuste et optimisé pour la production de quantités de milligramme de monomères natives, tag-free et les fibrilles de l’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO).

Génération d’indigène, non balisés la huntingtine Exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de Fusion de SUMO

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour déterminer les structures de canal d’ion par cryo microscopie électronique, y compris un système baculovirus utilisé pour exprimer efficacement gènes dans des cellules de mammifères avec le minimum d’effort et de toxicité, d’extraction de protéine, de purification, contrôle qualité, préparation des échantillons grille et dépistage, ainsi que collecte de données et traitement.

Expression et Purification de l’homme sensible lipides canal de Cation TRPC3 pour la détermination de structure par particule Cryo microscopie électronique

Ce manuscrit décrit une approche de dépistage à l’échelle du génome basée sur les cellules pour identifier les interactions extracellulaires de récepteur-ligand.

Identification des récepteurs de surface cellulaire à l’aide d’écrans génétiques CRISPR/Cas9 à l’échelle du génome

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Découvrez comment confirmer l'identité du récepteur à l'héparine TMEM184A en utilisant une construction marquée GFP dans des cellules vasculaires. Cette méthode permet d'identifier fonctionnellement les gènes orphelins.

L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

Explorer plus de vidéos