Dissection de l'Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l'oreille moyenne et l'analyse histologique

L’objectif global de la procédure de dissection est d’isoler la bulle auditive et la capsule, puis les osselets auditifs individuels des souris postnatales pour diverses analyses histologiques. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des plaies, telles que les mécanismes de mauvaise morphogenèse, d’ossification endochondrale ou de mauvais métabolisme minéral. Cette méthode est basée sur une connaissance approfondie des détails anatomiques.

En général, les individus qui ne connaissent pas la souris en tant que système biologique peuvent avoir des difficultés, car leur connaissance de l’oreille moyenne humaine peut ne pas être applicable à l’homologue de la souris. La démonstration de la procédure sera faite par Ayako Sakamoto, une technicienne de mon laboratoire. Commencez par placer la bulle auditive et la capsule avec l’os du crâne environnant dans une boîte à échantillons contenant une solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4 à température ambiante.

À l’aide d’un microscope binoculaire à dissection, identifiez les os du crâne entourant la capsule auditive, comme illustré ici. Utilisez une paire de pinces pour saisir le crâne environnant et une deuxième série pour retirer l’os basisphénoïde et occipital. Ensuite, à l’aide de la pince, retirez doucement les os interpariétaux et pariétaux de la capsule et retirez-les lorsqu’elles sont complètement desserrées.

Ensuite, retirez le squamosal de la bulle et de la capsule et retirez doucement l’os et les tissus mous. Ensuite, saisissez l’oreille externe et retournez l’échantillon pour révéler le côté médial. Ensuite, tournez l’échantillon à 180 degrés, saisissez la capsule et retirez les tissus mous restants.

La crête dorsale est maintenant visible. À cet angle, les nerfs facial et vestibulo-cochléaire du conduit auditif interne, de la fosse sous-arquée et du canal semi-circulaire antérieur sont clairement visibles. Lorsque la crête dorsale est inclinée vers le bas de la boîte de dissection, la bulle auditive est clairement visible.

Si la préparation est légèrement inclinée, la malle est visible à l’intérieur de la bulle. Commencez par utiliser des forceps pour fracturer le conduit auditif externe au-dessus du marteau et latéralement au sillon tympanique. Créez une deuxième facture antérieure à la première.

Retirez ensuite le morceau de conduit auditif externe afin que la membrane tympanique soit visible. Ensuite, retirez une partie de la membrane tympanique et de l’os tympanique près du processus malléal court à la fois au niveau des parois ventrale et postérieure. La malle, l’incus, l’étrier et le muscle tenseur du tympan doivent maintenant être exposés.

Soulevez la marteau et coupez le muscle tenseur du tympan avec le bord biseauté d’une aiguille de calibre 27. Notez que le manubrium malléal se fixe fermement à la membrane tympanique, comme on le voit chez d’autres mammifères. Disloquer le marteau de l’invagination au niveau de l’articulation ossiculaire en fracturant l’apophyse antérieure du marteau au niveau de la goniale.

Isolez la malleus de la bulle auditive à l’aide d’une pince. Retirez la majeure partie de la bulle auditive pour exposer l’incus et l’étrier. Ensuite, utilisez le bord biseauté d’une aiguille de calibre 27 pour couper le ligament postérieur de l’incus à la crête courte.

Isolez l’incus à l’aide d’une pince. Coupez l’artère stapédiale près de l’étrier avec le bord biseauté d’une aiguille de calibre 27. Faites pivoter l’échantillon de manière à ce que la fenêtre ronde soit positionnée en bas.

Insérez ensuite une aiguille à coudre dans le foramen obturateur de l’étrier et soulevez les étriers. Après avoir retiré les étriers, l’ouverture ovale de la fenêtre doit être clairement visible. Utilisez l’aiguille de calibre 27 pour pousser l’étrier hors de l’aiguille à coudre.

Pour commencer l’enrobage tissulaire, utilisez d’abord des ciseaux pour couper le processus styliforme à l’extrémité antérieure de la bulle. La malle et la crête dorsale sont visibles à travers la partie coupée. Immergez la bulle et la capsule dans 1 à 2 % de paraformaldéhyde dans du PBS.

Si de l’air est emprisonné dans la bulle, retirez-la à l’aide d’une aiguille et d’une seringue. Laissez la bulle et la capsule dans le fixateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur de tube. Le lendemain, lavez rapidement la bulle et la capsule dans PBS.

Ensuite, immergez immédiatement dans un composé cryo-enrobé liquide à quatre degrés Celsius. Il est courant que des bulles d’air se forment dans le composé cryo-intégré au niveau de l’oreille moyenne et externe. Retirez la bulle d’air de l’oreille moyenne par aspiration à l’aide d’une aiguille.

Utilisez la même technique pour la bulle d’air dans l’oreille externe. Une fois toutes les bulles d’air éliminées, orientez le tissu en fonction du type de sections à obtenir. Le tissu peut ensuite être incorporé dans des blocs congelés avant la section.

Cette image montre la coloration H et E d’une section longitudinale de paraffine d’une maille décalcifiée, indiquée par la lettre M, et de la bulle auditive et de la capsule d’une souris P14. La membrane tympanique est indiquée par la lettre TM. Cette image montre le marquage osseux calcique d’une section longitudinale d’un marteau non décalcifié congelé, indiqué par la lettre M, et la bulle auditive d’une souris P21. Les signaux verts de calcium révèlent une nouvelle formation osseuse dans la malleuse, la bulle et la capsule.

Une fois la technique maîtrisée, la bulle auditive et la capsule peuvent être isolées en une dizaine de minutes si l’intervention est correctement réalisée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des orientations anatomiques des osselets auditifs et de la bulle chez la souris, qui ont été décrites dans le texte principal.