Cryosectioning de contigües Les régions d'un muscle squelettique de souris unique pour l'expression génique et analyses histologiques

L’objectif global de cette procédure est de permettre l’analyse des paramètres histologiques et moléculaires à partir de sections adjacentes d’un seul tissu. Avec cette méthode, nous pouvons aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie et des maladies des muscles squelettiques. Par exemple, quels sont les effets régénérateurs après une blessure musculaire et quels sont les effets de l’administration de gènes viraux par injection intramusculaire ?

L’avantage de cette méthode est que les données histologiques et moléculaires peuvent être directement corrélées à partir d’un seul tissu. Cela permet une analyse plus efficace des données et une meilleure utilisation des tissus expérimentaux. Cinq minutes avant de terminer les dissections, refroidissez le bain de cryoconservation.

Lorsque les échantillons de tissus sont prêts à être intégrés, appliquez d’abord de la résine d’enrobage sur le tiers inférieur à la moitié du tissu, là où le muscle rencontre le bouchon. Cela doit être fait proprement pour réduire l’interférence de la résine avec les étapes en aval. Ensuite, plongez immédiatement le bouchon dans le bain de 2-méthylbutane refroidi à moins 140 degrés Celsius.

Inclure jusqu’à huit préparations de tissus par lot. Dans le bain, remuez les mouchoirs pendant 30 secondes, en raclant le fond du bécher pour éviter que les bouchons de mouchoirs ne gèlent dans la solution. Après 30 secondes, à l’aide d’un outil métallique, retirez un bouchon de tissu du 2-méthylbutane.

Ensuite, retirez rapidement la lamelle de support. Remettez l’excès de 2-méthylbutane dans le bain, puis déposez le liège tissulaire dans le bain d’azote extérieur. Une fois que tous les tissus ont été transférés dans l’azote liquide, déplacez-les dans un récipient et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.

Après avoir préparé le cryostat et monté un échantillon de tissu, utilisez les commandes grossières et fines pour faire avancer l’échantillon jusqu’à la pale de manière à ce qu’il touche la pale. Réinitialisez la somme des épaisseurs de section à zéro à ce stade. Ensuite, réglez le cryostat sur la fonction de trim avec une épaisseur de section à 30 microns.

Et coupez et jetez des sections jusqu’à la profondeur de tissu souhaitée. Pour collecter efficacement les cryosections pour l’extraction de l’ARN, ouvrez d’abord le tube de collecte et placez-le près du porte-lame. Là, utilisez une brosse propre et pré-refroidie pour prélever chaque section et la transférer dans le tube.

Des sections antérieures du tibial de souris de 30 microns prélevées à une profondeur de tissu de 400 à 4 000 microns produisent généralement 25 à 50 milligrammes de muscle. Si de la résine d’enrobage entoure la cryosection, verrouillez le frein à main et utilisez une lame de rasoir pour raser de petits morceaux de résine jusqu’à ce qu’il n’y ait plus qu’une fine couche autour du haut du muscle. Coupez toujours la résine avec la lame inclinée loin du muscle.

Une fine couche de résine d’enrobage n’altère pas considérablement l’extraction de l’ARN en aval. S’il y a présence de résine d’enrobage plus épaisse, utilisez des brosses pour l’éloigner du muscle avant de déplacer la cryosection dans le tube de collecte. Pendant le processus de sectionnement, lorsque des coupes histologiques sont souhaitées, réinitialisez l’épaisseur de la tranche à sept microns à l’aide des commandes du cryostat.

Ensuite, coupez et jetez quatre à sept sections pour obtenir une surface de tissu uniforme et notez cette profondeur de tissu. Maintenant, coupez une bonne section et orientez-la sur la surface du porte-lame. À l’aide d’une lame de microscope à température ambiante, prélevez la section et ramenez-la à température ambiante.

Collectez toutes les sections souhaitées, puis notez la profondeur finale des tissus. Une fois la section terminée, enregistrez rapidement le poids des cryosections groupées pour l’isolement de l’ARN. Remettez immédiatement le tube dans la chambre du cryostat pour maintenir la température des sections près de moins 20 degrés Celsius.

Commencez par transférer rapidement les cryosections regroupées sur de la glace et ajoutez environ un millilitre de réactif d’extraction d’ARN organique pour 50 milligrammes de cryosections. Plus le réactif est appliqué tôt, moins l’ARN se dégrade. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 18, homogénéisez les cryosections sans faire trop de bulles en prélevant à plusieurs reprises une solution et en l’éjectant sur les parois du tube.

Utilisez la pointe de l’aiguille pour disperser les morceaux agglomérés. Tous les cinq passages, remettez brièvement l’échantillon dans la glace pour le garder au frais. Une fois homogénéisé, utilisez une aiguille de calibre 22 pour triturer soigneusement l’échantillon en utilisant cinq autres coups.

Remettez ensuite l’échantillon dans la glace. Répétez ce processus trois ou quatre fois pour obtenir une homogénéité tissulaire très finement dispersée. Une fois l’homogénat final réalisé, laissez-le incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour perturber les complexes moléculaires.

Ensuite, dans une hotte, ajoutez 0,1 millilitre de BCP par millilitre de réactif d’isolement d’ARN. Ensuite, secouez vigoureusement le tube pendant 15 secondes. N’utilisez pas de vortex.

Ensuite, incubez l’échantillon à température ambiante pendant deux à trois minutes. Après la brève incubation, centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes à 12 000 g et quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez soigneusement la phase supérieure claire contenant l’ARN.

Transférez-le dans un tube propre et ajoutez un volume égal de 70 % d’éthanol, fabriqué dans de l’eau de mer profonde. Après avoir brièvement fait tourbillonner le tube, laissez-le incuber pendant 10 minutes à température ambiante et procédez en suivant le protocole textuel. Des préparations d’ARN du muscle squelettique ont été fabriquées à partir du tibial antérieur de la souris.

Trois jours auparavant, certains muscles ont reçu une injection de 10 micromolaires de cardiotoxine et d’autres de solution saline. La pureté et le rendement de l’ARN de ces échantillons étaient excellents. Le rendement en ARN était considérablement plus élevé dans les muscles tibiaux antérieurs après une lésion par toxine.

L’intégrité des tissus et la production d’ARN pourraient être prises en compte dans cette observation. La persistance de la qualité de l’ARN préparé a été évaluée à l’aide d’un microlitre d’ARN stocké à moins 20 degrés Celsius pendant 18 mois. Des bandes d’ARN ribosomique 18S et 28S proéminentes sont encore évidentes dans les échantillons, démontrant une qualité élevée de l’ARN.

Des sections de sept microns ont été colorées pour l’expression de la chaîne lourde de myosine embryonnaire, visible en rouge. Pour détecter les fibres régénérantes, colorées pour le collagène six, vues en vert, qui délimitent les fibres musculaires et colorées au dappy, en bleu, pour observer les noyaux. Lorsqu’il y a une mauvaise injection de toxine, la blessure semble minime.

Une injection réussie de toxine entraîne l’atteinte d’une région beaucoup plus grande du compartiment musculaire ciblé. Le degré de lésion pourrait être utilisé comme critère d’inclusion pour l’analyse de l’ARN. Une fois maîtrisées, les sections de coupe pour l’extraction de l’ARN et la lame histologique peuvent être réalisées en moins d’une demi-heure pour un seul tissu.

Suite à cette procédure, d’autres colorations histologiques ou immunofluorescentes peuvent être suivies pour répondre à une grande variété de questions. Les cryosections groupées peuvent également être utilisées pour collecter de l’ADN ou des protéines.