Name: Cryosectioning de contigües Les régions dun muscle squelettique de souris unique pour lexpression génique et analyses histologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Apprenez le cryocoupes consécutives du muscle squelettique de souris pour corréler données histologiques et moléculaires. Cette méthode optimise l'analyse tissulaire et l'extraction d'ARN de haute qualité.

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Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre et Junna Luan ont fourni une assistance technique. La recherche rapportée dans cette publication a été financée par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de bourse AR065077. Le contenu relève de la seule responsabilité de l’auteur et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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</ol>

L’auteur déclare qu’elle n’a pas d’intérêts financiers concurrents.

Pour obtenir les meilleurs résultats avec cette méthode, gardez l&#39;intégration résine limitée au tiers inférieur ou la moitié du muscle pendant la cryoconservation de tissu, car l&#39;excès de résine va ralentir la collecte des cryosections regroupées et peut augmenter l&#39;incorporation de contamination de la résine dans l&#39;isolement de l&#39;ARN. En outre, une attention particulière lors de l&#39;aiguille d&#39;homogénéisation est important de maximiser le rendement et minimiser la probabilité d&#39;obstruction...

Le but de cette technique est de faire de multiples analyses expérimentales par des modalités différentes, telles que l&#39;histologie et l&#39;expression des gènes, accessibles à partir d&#39;un seul petit tissu source du muscle squelettique. applications de microscopie sont les plus sensibles à l&#39;échantillon des méthodes de conservation, qui doit être soigneusement contrôlée afin de limiter la formation d&#39;artefacts de cristaux de glace lors de la cryoconservation. Ainsi, le développement de la méthode est basé sur le muscle tibial antérieur (TA) musculaire et congelées partiellement recouvert d&#39;enrobage de résine dans un liquide de bain de 2-méthylbutane d&#39;azote refroidi à -140 ° C en tant que matériau de base pour la microscopie par immunofluorescence et l&#39;expression génique analyses. La nécessité d&#39;utiliser le même matériau source pour diverses approches techniques est particulièrement important pour les expériences à base d&#39;injection intramusculaire où les muscles droit et gauche représentent les différentes conditions expérimentales, l&#39;une et l&#39;autre contrôle. Par exemple, dans les études de régénération musculaire, une muSCLE est injecté avec une toxine pour causer des dommages aux tissus répandus tandis que le muscle controlatéral sert de contrôle du véhicule à injection 1. De même, les études de thérapie génique pour les troubles musculaires commencent généralement à la validation du vecteur de thérapie génique par injection intramusculaire , à comparer avec le vecteur vide, vecteur ou sans rapport avec le contrôle du véhicule du côté controlatéral 2. Par conséquent, il est impossible de l&#39;obtenir dans chaque muscle TA pour une application différente. Les stratégies communes pour faire face à ce problème sont les suivants: i) d&#39;utiliser un groupe musculaire différent pour chaque application, ii) d&#39;utiliser des souris supplémentaires, ou iii) pour couper un morceau de muscle pour chaque application. Cependant, des différences substantielles entre les groupes musculaires, il est difficile de comparer les données à partir d&#39;applications séparées, et les animaux supplémentaires augmentent la charge et sont peu justifiées si d&#39;autres alternatives existent. En divisant le muscle après dissection à la source des applications différentes est la meilleure option in de nombreux cas. Toutefois, les morceaux de muscles sont souvent trop petits pour utiliser la pulvérisation sous azote liquide ou par des techniques de broyage mécanique pour l&#39; homogénéisation 2-5. Le muscle est un tissu très structurel garnie de protéines de la matrice extracellulaire et contractiles, l&#39;homogénéisation mécanique inadéquate conduit à un faible rendement de l&#39;ADN ultérieur, l&#39;ARN ou une protéine. La méthode détaillée ici permet de petites quantités de tissu d&#39;un muscle de la source pour une utilisation dans des applications multiples, et l&#39;inclusion de cryosectioning et l&#39;aiguille trituration améliore l&#39;homogénéisation mécanique pour un meilleur rendement de l&#39;ARN.

<table><tbody><tr><td>Liège</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Coupez en petits carrés avec une lame tranchante.</td></tr><tr><td>Lamelle en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Utilisée pour orienter le muscle pendant la congélation.</td></tr><tr><td>Thermomètre basse température</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-méthylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Attention : produit chimique dangereux. Stocker dans une armoire inflammable.</td></tr><tr><td>Résine d’enrobage : « cryomatrix"Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>D’autres résines d’enrobage peuvent être substituées à la cryomatrice.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 avec porte-lames jetable</td><td>Tout cryostat en état de marche doit suffire pour le protocole.</td></tr><tr><td>Lame de cryostat jetable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Utilisez une lame ou un couteau approprié pour le cryostat à utiliser.</td></tr><tr><td>Solution de décontamination à l’ARNase : « RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Utiliser pour manipuler les cryosections. Peut être trouvé dans les magasins avec des fournitures d’art simples.</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>Réactif d’extraction organique d’ARN : TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Attention : Le TRIzol est un produit chimique dangereux. Remarque : Seuls les réactifs d’extraction organiques sont recommandés pour l’extraction de l’ARN du muscle squelettique.</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 18</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 22</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 26</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>en option. Peut être utilisé pour une troisième série de trituration d’échantillons dans le protocole d’extraction d’ARN.</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Pour les échantillons de très grande valeur, une seringue Luer-Lok est recommandée (par exemple , VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropentane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Pour 70 % d’éthanol dans l’eau DEPC : alcool à 200 degrés</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>Mélanger 35 ml d’alcool 200 proof + 15 ml d’eau DEPC.</td></tr><tr><td>Pour 70 % d’éthanol dans l’eau DEPC : Eau traitée DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>Mix 35 ml d’alcool 200 proof + 15 ml d’eau DEPC.</td></tr><tr><td>Kit de purification de l’ARN : Minikit d’ARN PureLink</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Étapes finales de la préparation de l’ARN.</td></tr><tr><td>Eau sans DNase/Rnase&nbsp ;</td><td>L’eau traitée Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC peut également être utilisée.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre : Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Traitez l’ARN purifié pour éliminer toute contamination de l’ADN avant les applications en aval.</td></tr><tr><td>Stylo hydrophobe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS pour le protocole d’immunofluorescence.</td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Réhydratez le stock de sérum d’âne normal selon les instructions du fabricant, puis diluez une aliquote à 5 % pour l’immunofluorescence. Un sérum de chèvre normal peut également être utilisé.</td></tr><tr><td>Anticorps eMHC</td><td>Université de l’Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Collagen VI</td> anticorps <td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-lapin AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-phénylindole)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Média de montage aqueux : Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>N’utilise que des supports de montage conçus pour les applications fluorescentes avec des propriétés anti-décoloration.</td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>Utilisation pour le montage de lames à l’extrémité du protocole d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images : ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, ou des produits plus avancés</td><td>Freeware ImageJ devraient également fonctionner pour le comptage manuel. Des logiciels plus avancés avec des capacités de segmentation peuvent permettre une automatisation partielle du processus ; par exemple , ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Fusionner et cartographier les images de section : Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 n’est plus fabriqué. D’autres options pour la cardiotoxine sont EMD Millipore #217503 ; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618 ; ou Ge Script # RP17303 ; Mais ceux-ci n’ont pas été validés.</td></tr><tr><td>kit de transcription inverse : Superscript III Système de synthèse premier brin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Tous les réactifs de transcription inverse validés et de haute qualité peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>PCR standard : Système de polymérase GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Tout système de polymérase Taq validé et de haute qualité peut être utilisé. Si le séquençage de l’ADN doit être utilisé pour une application en aval de la PCR, un système de PCR haute fidélité doit être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>SYBR vert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>À utiliser en qPCR lorsque vous n’utilisez pas un mélange maître qPCR dédié. À utiliser avec SuperROX (pour les instruments Applied Biosystems) et GoTaq Flexi polymérase et tampons.</td></tr><tr><td>ROX : SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX est plus stable dans la réaction PCR, il est donc préférable pour une utilisation comme colorant de référence passif qPCR par rapport au ROX (carboxy-X-rhodamine). Pour la qPCR avec les instruments Applied Biosystems</td></tr><tr><td>PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning de contigües les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Avec cette méthode, cryosections consécutifs sont recueillies pour permettre aux deux applications de microscopie pour l&#39;histologie des tissus et à l&#39;enrichissement de l&#39;ARN pour l&#39;expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d&#39;un muscle squelettique de souris unique. En règle générale, il est difficile d&#39;obtenir une homogénéisation suffisante des petits échantillons de muscles squelettiques, car les volumes de tampon peut être trop faible pour des applications de broyage efficaces, mais sans rupture mécanique suffisante, l&#39;architecture du tissu dense de limites musculaires pénétration des réactifs de tampon, ce qui provoque finalement le rendement en ARN faible. En suivant le protocole présenté ici, à 30 um coupes sont recueillies et mises en commun permettant cryosectioning et après l&#39;homogénéisation de l&#39;aiguille pour perturber mécaniquement le muscle, ce qui augmente la zone de surface exposée à la pénétration du tampon. Les principales limites de la technique est qu&#39;elle nécessite un cryostat, et il est relativement faible débit. Cependant, l&#39;ARN de haute qualité peut être obtenue à partir de petits échantillons de m groupécryosections uscle, ce qui rend cette méthode accessible pour de nombreux muscles squelettiques différents et d&#39;autres tissus. Des analyses plus, cette technique permet appariées (par exemple, l&#39; histopathologie des tissus et l&#39; expression des gènes) des régions adjacentes d&#39;un seul muscle squelettique de sorte que les mesures peuvent être comparées directement à travers les applications pour réduire l&#39; incertitude expérimentale et de réduire les expérimentations animales réplicatives nécessaires pour approvisionner un petit tissu pour des applications multiples.

ARN Muscle cryosection est de haute qualité et offre un rendement suffisant pour la plupart des applications Les analyses des seize squelettiques préparations d&#39;ARN musculaires sont présentés dans le tableau 1 , en utilisant 19,4 mg de 41 à Pooled jambier antérieur (TA) , le muscle des souris témoins 8. Les deux à gauche (L) et droite muscles (R) TA ont été préparés dans des expériences de régénération avec d...

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l&#39;enrichissement de l&#39;ARN pour la mesure de l&#39;expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d&#39;un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Cryosectioning de contigües Les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

L’objectif global de cette procédure est de permettre l’analyse des paramètres histologiques et moléculaires à partir de sections adjacentes d’un seul tissu. Avec cette méthode, nous pouvons aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie et des maladies des muscles squelettiques. Par exemple, quels sont les effets régénérateurs après une blessure musculaire et quels sont les effets de l’administration de gènes viraux par injection intramusculaire ?L’avantage de cette méthode est que les données histologiques et moléculaires peuvent être directement corrélées à partir d’un seul tissu. Cela permet une analyse plus efficace des données et une meilleure utilisation des tissus expérimentaux. Cinq minutes avant de terminer les dissections, refroidissez le bain de cryoconservation.Lorsque les échantillons de tissus sont prêts à être intégrés, appliquez d’abord de la résine d’enrobage sur le tiers inférieur à la moitié du tissu, là où le muscle rencontre le bouchon. Cela doit être fait proprement pour réduire l’interférence de la résine avec les étapes en aval. Ensuite, plongez immédiatement le bouchon dans le bain de 2-méthylbutane refroidi à moins 140 degrés Celsius

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