L'utilisation de la technique de superposition Soft-agar à l'écran pour les composés inhibitrices produites par voie bactérienne

L’objectif global de cette procédure est de dépister les agents produits par une souche bactérienne, qui sont inhibiteurs envers la deuxième souche bactérienne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans un certain nombre de domaines microbiologiques, mais elle est particulièrement utile en écologie microbienne, pour comprendre les interactions bactériennes antagonistes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu coûteuse et facile à réaliser et à interpréter.

La démonstration de la procédure sera faite par Aretha, une étudiante du laboratoire. Pour commencer l’expérience, inoculez une seule colonie de seringues de P dans 3 millilitres de bouillon King’s Medium B, ou KB. Incuber la culture pendant la nuit. Le lendemain matin, diluez la culture de bouillon de 1 à 100 dans 3 millilitres de bouillon KB frais.

Incuber la culture pendant trois à quatre heures en la secouant à température ambiante. Assurez-vous que la culture a une augmentation notable de la turbidité, puis ajoutez la mitomycine C.Ensuite, incubez la culture pendant la nuit en secouant à température ambiante. Le lendemain, granulez un à deux millilitres de cultures induites par la mitomycine C dans une microcentrifugeuse de paillasse.

Retirez et stérilisez les surnageants de culture en les faisant passer à travers un filtre de la taille des pores de 0,22 micromètre. Ajouter du chlorure de sodium pour atteindre une concentration molaire et ajouter du polyéthylène glycol, ou PEG 8000, à une concentration finale de 10 %, au surnageant stérile. Retournez les échantillons à plusieurs reprises jusqu’à ce que le chlorure de sodium et le PEG soient complètement dissous.

Incuber les échantillons dans un bain de glace pendant une heure. Ensuite, centrifugez les échantillons. Après l’essorage, décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans le tampon en le pipetant à plusieurs reprises.

Éliminer le PEG résiduel par deux extractions séquentielles avec un volume égal de chloroforme. Combinez avec du chloroforme avec la pastille remise en suspension et agitez le mélange pendant 15 secondes. Ensuite, centrifugez le mélange à 20 000 fois G pendant cinq minutes.

Transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube de microfuge frais. Répétez cette extraction deux fois, jusqu’à ce qu’aucune interface blanche entre la phase aqueuse et la phase organique ne soit visible. Laisser le chloroforme résiduel s’évaporer des surnageants extraits dans une hotte.

Inoculez une seule colonie d’une souche de P syringae dans trois millilitres de KB et incubez la culture pendant la nuit en agitant à température ambiante. Le lendemain matin, diluez la culture 1 à 100 dans du KB frais. Incuber la culture pendant trois à quatre heures en la secouant à température ambiante. Ensuite, préparez la gélose à l’eau stérilisée en autocavant une suspension de gélose dans de l’eau ultra-pure.

Maintenez la gélose molle fondue dans un bain-marie à 60 degrés Celsius avant de l’utiliser. À l’aide d’une pipette sérologique stérile, transférez trois millilitres de gélose molle dans un tube de culture stérile. Remettez le tube de culture dans le bain-marie pour le maintenir à l’état fondu.

Avant de verser le recouvrement, laissez refroidir la gélose fondue, mais ne la laissez pas se solidifier. Il est essentiel que la gélose soit maintenue dans un état chaud et complètement fondu avant l’inoculation. Sinon, la superposition aura un aspect granuleux et sera plus difficile à interpréter.

Dans une hotte stérile, inoculer 100 microlitres de la culture de la souche testeur dans la gélose molle et le vortex pour mélanger. Faites pivoter la culture à la main pendant 10 à 15 secondes, puis versez-la au fond d’une plaque de gélose. Inclinez la plaque dans toutes les directions pour vous assurer que la gélose molle recouvre uniformément la gélose inférieure.

Couvrez l’assiette et laissez-la se solidifier pendant 20 à 30 minutes. Attention à ne pas déranger la plaque pendant la solidification. Une fois solidifié, placez deux à cinq microlitres de surnageant sur le recouvrement.

Laissez les plaques incuber toute la nuit à température ambiante. Observez et notez les résultats le lendemain matin. En utilisant cette méthode, deux souches de P syringae sont inhibées par des bactériocines différentes.

La souche A est sensible à une bactériocine de haut poids moléculaire, la Tailocin, mais n’est pas sensible à une autre bactériocine de bas poids moléculaire. À l’inverse, la souche B est insensible à la Tailocin, mais elle est sensible à la bactériocine de faible poids moléculaire. La Tailocin est efficacement récupérée après la précipitation du PEG, contrairement aux Bacteriocines de faible poids moléculaire.

La destruction par bactériophage est distinguée des autres antimicrobiens non réplicatifs en comparant une série de dilutions. Dans le cas de la clairance médiée par les bactériophages, la dilution du surnageant s’est résolue en plaques individuelles, ou zones de clarification, tandis que la clairance médiée par la bactériocine ne s’est pas résolue en de telles plaques. Cette procédure peut être utilisée comme dépistage initial pour identifier les agents inhibiteurs, et peut être combinée à des manipulations génétiques en aval pour identifier ou confirmer la source de cette activité.