Name: Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour lévaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Découvrez l'implantation intrarénale de cellules tumorales Renca chez la souris immunocompétente pour modéliser le carcinome rénal métastatique. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des thérapies antitumorales dans un contexte préclinique réaliste.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;Institut national du cancer (R15CA173657 à AW et R01CA109446 à TSG), l&#39;Institut du cancer Simmons (AW) et l&#39;Université de Minnestoa 4 Fondation Climb du cancer du rein (TSG). Nous tenons à remercier le Dr Kristin Anderson pour l&#39;aide à l&#39;immunofluorescence.

Le protocole suivant décrit une procédure expérimentale pour induire et surveiller la croissance des tumeurs rénales orthotopique expérimentales et des métastases spontanées potentielles. Toutes les procédures suivantes sont effectuées conformément aux politiques et procédures approuvées institutionnelles concernant l&#39;utilisation humaine des animaux de laboratoire. 1. Entretien de lignées cellulaires <ol><li> Maintenir la lignée cellulaire d&#39;adénocarcinome rénal murin, Renca, dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 additionné de 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine et 1 mM de chacun des acides aminés non essentiels, de L-glutamine , et du pyruvate de sodium (appelé RPMI complet). Des cellules de culture dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Comme pour toute lignée cellulaire établie, il est recommandé d&#39;utiliser à faible nombre de cellules RENCA passage pour la transfection et l&#39;implantation ultérieure afin de minimiser les changements phénotypiques ou génétiques qui pourraient se produire après le culte à long termeure. <ol><li> Utiliser un système de transposon à l&#39;ingénieur cellules RENCA pour exprimer de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase de luciole. <ol><li> En utilisant un réactif de transfection à base de liposomes cationiques, co-transfecter des cellules Renca avec un vecteur d&#39;expression de la transposase (pPGK-SB11) et un codage de vecteur de transposon pour l&#39;expression de la luciférase de luciole, ainsi qu&#39;un gène codant pour la fusion de GFP et le gène de résistance à la zéocine , à la fois sous le contrôle transcriptionnel d&#39;un promoteur bidirectionnel (pKT2 / Lubig) 19. </li><li> Deux jours plus tard, plaque les cellules transfectées à une dilution limite et permettent aux cellules de se développer en complété RPMI complet avec zéocine (300 pg / ml). Confirmer l&#39;expression de la GFP dans chaque clone par cytométrie de flux. Ces cellules sont appelées Renca-GL. REMARQUE: le clonage de limitation de la dilution permettra aux cellules sélectionnées pour être dérivées d&#39;une seule cellule. </li></ol></li></ol></li><li> Pour implanter les cellules Renca intrarenally, préparer des cellules Renca into une suspension à cellule unique à 2 x 10 6 cellules / ml dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS). <ol><li> Retirer cellules RENCA adhérentes à partir du flacon de culture tissulaire en utilisant 0,25% de trypsine dans du HBSS. Après environ 5 min, ajouter du RPMI complet dans le ballon pour neutraliser la trypsine et de transférer les cellules à un tube de centrifugation pour le lavage. Centrifuger les cellules à 300 g de la force centrifuge relative (RCF xg) pendant 5 min à 25 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans HBSS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et ajuster le volume avec du HBSS pour obtenir 2 x 10 6 cellules / mL. </li><li> Dessiner les cellules dans une seringue de 1 ml munie d&#39;une aiguille de calibre 18 pour empêcher la contrainte de cisaillement sur les cellules. Remplacer l&#39;aiguille de calibre 18 avec une aiguille de calibre 28 avant l&#39;injection des cellules tumorales. Une injection de 0,1 ml délivre 2 x 10 5 cellules dans le rein. </li></ol></li></ol> 2. Zone chirurgicale Préparation <ol><li> Préparer une chirurgie stérilezone dans une enceinte de sécurité biologique en plaçant un drap chirurgical stérile sur un coussin chauffant. Rassembler toutes les fournitures, y compris des pinces, scalpel, ciseaux, gouttes pour les yeux, 5% gaze povidone-iode antiseptique et stérile. Tous les instruments autoclaver avant utilisation. </li><li> Effectuer l&#39;opération en utilisant une technique de pointe aseptique. instruments RESTÉRILISER entre les animaux avec un stérilisateur à billes. Porter des gants stériles, une blouse de laboratoire, et un masque facial. </li></ol> 3. Préparation des animaux <ol><li> Anesthésier les souris avec de la kétamine / xylazine (87,5 mg / kg et 12,5 mg / kg, respectivement, ip) selon les directives institutionnelles. Déterminer la profondeur d&#39;anesthésie en effectuant un orteil-pincement. </li><li> Lorsque l&#39;animal est considéré comme non réactif, préparer le site d&#39;injection (par exemple, le flanc gauche) sur des souris Balb / c en pinçant (avec les doigts) ou le rasage ( l&#39; aide de tondeuses) de la fourrure. </li><li> Déplacez les souris de la zone de préparation de la chirurgie (par exemple, la cage du logement) à la zone chirurgicale et appliquer une pommade vétérinaire à lales yeux pour prévenir la sécheresse. écouvillon libéralement le site d&#39;incision préparé avec 5% de povidone-iode antiseptique. </li><li> Injecter chlorhydrate de bupivacaïne (0,1 mL d&#39;une solution à 2,5 mg / mL, sc) dans la zone où l&#39;incision est faite comme une analgésie pré-opératoire. </li><li> Faire une seule incision (~ 1,0 - 1,5 cm) sur le flanc gauche de l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile ou des ciseaux, avec précaution afin de ne pas pénétrer dans le péritoine. Séparer le derme du péritoine avec des ciseaux stériles. Tamponnez le site d&#39;incision avec de la gaze de coton stérile pour éliminer toute trace de sang. </li><li> Maintenez la souris avec les deux mains, en utilisant la main gauche pour tenir la tête et la main droite pour soutenir le flanc. </li><li> Identifier la rate à travers le péritoine et, avec un doigt de la main droite, palper la souris par le dessous; le rein doit maintenant être visible à travers le péritoine. Gardez une prise ferme de l&#39;animal pour fournir une tension à travers le péritoine et les reins. </li><li> Demandez à une deuxième personne injecter la tumeur célls (préparé dans la section 1.2.) à travers le péritoine intact dans le centre du rein en utilisant une seringue de 1 ml munie d&#39;une aiguille de calibre 28. Lentement délivrer 0,1 mL (2 x 10 5) de cellules. Une fois que les cellules sont injectées, maintenir l&#39;aiguille en place pendant 5 - 10 s pour réduire le reflux de cellules. Il est important de noter la nécessité d&#39;une extrême prudence lors de cette étape, la personne va injecter les cellules qui porte l&#39;aiguille à proximité immédiate des doigts de la personne qui tient la souris. </li><li> Retirer l&#39;aiguille et fermer l&#39;incision avec une fine couche de colle tissulaire à base de cyanoacrylate. </li><li> Remettre l&#39;animal dans une cage propre avec une serviette en papier stérile. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant. Ne pas laisser sans surveillance les animaux pendant la période de récupération. Ne pas retourner les animaux à des conditions de logement standards jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient en position verticale et sternal. Suivez les directives institutionnelles dans toutes les procédures utilisant des animaux de laboratoire. </li></ol> 4. BioImagerie luminescent <ol><li> Surveiller la croissance des tumeurs par imagerie bioluminescente. REMARQUE: Les procédures détaillées pour effectuer une imagerie bioluminescente peuvent être obtenues à partir de Lim et al. 20 Le signal de la luciférase peut être détectée dès l&#39; âge de 24 h après l&#39; implantation des cellules tumorales. Comme il n&#39;y a pas de tumeur visible à l&#39;extérieur dans ce modèle, il est essentiel de surveiller la croissance de la tumeur périodiquement. Selon l&#39;expérience conçue, la croissance de la tumeur orthotopique peut procéder pour des durées variables. L&#39;un des avantages de l&#39;utilisation des cellules RENCA exprimant la luciférase est que la croissance de la tumeur peut être contrôlée de façon répétée dans le même animal à intervalles réguliers pendant toute la durée de l&#39;expérience, et un interrogatoire spécifique portant la tumeur et les organes sans tumeur peut être fait à un point final défini. <ol><li> Injecter luciférine (0,1 ml d&#39;une solution à 15 mg / mL dans du PBS stérile) ip et lui permettre de circuler pendant 10 minutes avant de placer la souris dans le système d&#39;imagerie par bioluminescence. Placez le mo<html> utiliser avec sa place du côté dorsal, roulé légèrement sur le côté, afin d&#39;avoir la face rein injecté vers le haut. </li><li> Mesurer la charge tumorale chez les photons de lumière émis par seconde (flux de photons) dans une région définie d&#39;intérêt (ROI) en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li></ol></li><li> Quantification de la charge de la tumeur dans les organes individuels. REMARQUE: Quantification peut être effectué à des moments définis dans les organes individuels après leur retrait de souris euthanasiées. <ol><li> Injecter les souris avec la luciférine, comme à l&#39;étape 4.1. </li><li> Après 10 min, euthanasie les souris en utilisant une procédure approuvée. </li><li> Disséquer les organes d&#39;intérêt (par exemple, les reins et les poumons, voir la section 5 ci - dessous). Transférer le tissu à des boîtes de Petri de 35 x 10 mm et les placer dans le système d&#39;imagerie par bioluminescence. </li><li> Mesurer la charge tumorale chez les photons de lumière émis par seconde (flux de photons) dans un ROI définies en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. Organ récolte <ol><li> A un point d&#39; extrémité défini pour l&#39;expérience individuelle, l&#39; euthanasie des souris porteuses de tumeur selon les directives institutionnelles préférées (par exemple, le CO 2, la dislocation cervicale, une surdose d&#39;anesthésie). Cependant, éviter la dislocation cervicale si les poumons doivent être collectés après l&#39;inflation de l&#39;encre de Chine. </li><li> Procéder à une évaluation grossière de la croissance tumorale primaire rénale dans le rein injecté par la mesure du poids des organes par voie humide. <ol><li> Pour déterminer la masse de la tumeur (en g), isoler 21 et peser le rein portant la tumeur et le rein controlatéral de la même souris, où la différence de poids des reins définit la masse tumorale. disséquer soigneusement toute tissu conjonctif étranger par les reins excisés avant de mesurer leur poids. </li></ol></li><li> Évaluer le degré de métastases tumorales dans les poumons en gonflant les poumons à l&#39;encre de Chine avant l&#39;excision et la fixation immédiatement les poumons dans une solution de Feketelass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Calcul manuel des lésions métastatiques sur la surface pulmonaire peut alors être effectuée. <ol><li> Faire une incision médiane avec des ciseaux à partir de la mi-ventre, à travers la cage thoracique, et à travers les glandes du cou / salivaire. Retirez délicatement la cage thoracique à l&#39;aide des ciseaux et des pinces, sans compromettre le tissu pulmonaire. </li><li> La trachée Exposer en retirant le tissu conjonctif. </li><li> Préparer une seringue de 3 ml avec une aiguille de calibre 18 rempli de solution à 10% de l&#39;encre de Chine dans HBSS. </li><li> En utilisant une pince, fil soigneusement une suture de soie sous la trachée. Il sera utilisé pour attacher la trachée une fois gonflé. </li><li> Insérer avec précaution l&#39;aiguille vers le bas de la trachée et abaisser lentement la seringue pour gonfler les poumons avec la solution d&#39;encre de Chine. Environ 1 - 1,5 ml de solution d&#39;encre l&#39;Inde gonfler complètement les poumons. </li><li> Pincer la trachée fermée en attachant plusieurs noeuds, avec le fil de suture en dessous de l&#39;aiguille pour empêcher le reflux de l&#39;encre. </li><li> Remove l&#39;aiguille et soigneusement couper le tissu conjonctif pour enlever les poumons gonflés. </li><li> Dans une hotte chimique, placer les poumons dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de la solution de Fekete (35 ml de EtOH à 95%, 15 ml de dH 2 O, 5 ml de formaldehyde et 2,5 ml d&#39;acide acide glacial dans une bouteille en verre de 100 mL) 23. </li><li> Laisser les poumons pour fixer / Destain pendant 24 - 48 h à température ambiante avant le comptage manuel des nodules de tumeur décoloré. </li><li> Retirez les poumons intacts après détachage et décortiquer soigneusement les poumons fixés par lobe dans une boîte de Pétri 35 x 10 mm. Compter le nombre de nodules tumoraux (nodules blancs) sur chaque lobe sous un microscope à dissection. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).</li>
<li>Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+for+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors for kidney cancer.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).</li>
<li>Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+incidence+of+small+renal+masses%3A+a+need+to+reassess+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).</li>
<li>Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+and+future+perspectives+of+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma.</a> Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).</li>
<li>Rini, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+cancer%3A+therapeutic+advances+through+understanding+the+molecular+basis+of+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance.</a> Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).</li>
<li>Acquavella, N., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+trying+but+failing+to+improve+the+only+curative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy.</a> J. Immunother. 36, 459-461 (2013).</li>
<li>Salup, R. R., Wiltrout, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+established+murine+renal+cancer+by+interleukin+2-stimulated+cytotoxic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes.</a> Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).</li>
<li>Ko, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+differential+suppression+of+myeloid-derived+suppressor+cell+subsets+by+sunitinib+is+compartmentally+constrained%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained.</a> Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).</li>
<li>Kusmartsev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+regulates+expression+of+VEGFR1+in+myeloid+cells%3A+link+to+tumor-induced+immune+suppression+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma.</a> J. Immunol. 181, 346-353 (2008).</li>
<li>Rocha, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+gene+therapy+enhances+the+efficacy+of+IL-2+in+suppressing+metastatic+renal+cell+carcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice.</a> Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).</li>
<li>Shanker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+metastatic+solid+tumors+with+bortezomib+and+a+tumor+necrosis+factor-related+apoptosis-inducing+ligand+receptor+agonist+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).</li>
<li>VanOosten, R. L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tumor-specific+CD8%2B+T+Cells+after+intratumoral+Ad5-TRAIL%2FCpG+oligodeoxynucleotide+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy.</a> Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages.</a> Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+in+different+anatomical+sites+can+sculpt+and+vary+the+tumor+microenvironment+to+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy.</a> Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+potency+of+regulatory+T+cell-mediated+immunosuppression+in+kidney+tumors+compared+to+subcutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors.</a> Oncoimmunology. 3, 963395(2014).</li>
<li>Devaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+tumors+can+affect+responses+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between tumors can affect responses to therapy.</a> Oncoimmunology. 4, 975572(2015).</li>
<li>Norian, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+metastatic+renal+cell+carcinoma+after+adenovirus-encoded+TNF-related+apoptosis-inducing+ligand+%28TRAIL%29%2FCpG+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy.</a> PLoS One. 7, 31085(2012).</li>
<li>Matin, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+response+to+renal+cryoablation+in+an+in+vivo+orthotopic+renal+cell+carcinoma+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model.</a> J. Urol. 183, 333-338 (2010).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+source+of+transposase+for+Sleeping+Beauty-mediated+gene+insertion+and+expression+in+somatic+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues.</a> Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).</li>
<li>Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+of+mammary+tumors+using+IVIS+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-mediated+modulation+of+MDSC+contributes+to+the+efficacy+of+Ad5-TRAIL+therapy+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).</li>
<li>James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24711083">Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC.</a> Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).</li>
<li>James, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+alters+dendritic+cell+function+in+the+presence+and+absence+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth.</a> J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Brincks, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triptolide+enhances+the+tumoricidal+activity+of+TRAIL+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma.</a> FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+intravascular+staining+redefines+lung+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses.</a> J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).</li>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Nous présentons un protocole pour un modèle de souris RCC orthotopique. L&#39;implantation de cellules tumorales d&#39;adénocarcinome rénal de souris dans le rein de souris constitue un modèle clinique pertinente de CRm. Ce modèle se traduit par une tumeur primaire dans le rein et métastases distantes dans les poumons, qui sont tous deux caractéristiques de RCC avancé. La description présentée ici est spécifique pour la lignée de cellules immunocompétentes Renca dans des souris Balb / c. En utilisant ce modèle orthotopi...

Carcinome à cellules rénales (RCC) représente la majorité des tumeurs malignes du rein et environ 3% de toutes les tumeurs malignes des adultes dans le monde entier 1, 2. En raison de l&#39; absence de symptômes, diagnostics erronés, et des outils de dépistage insuffisantes pour RCC, près de 30% des patients présentent un cancer du rein métastatique (MRCC) au moment du diagnostic, avec un 20-30% supplémentaire des patients évoluant vers un stade métastatique 2. Ces cas donnent lieu à ~ 13.500 décès par an 1, 3. Bien que la détection précoce et le traitement du RCC primaire a amélioré, le taux de décès liés à la RCC continue d&#39;augmenter, ce qui suggère que la maladie métastatique est en grande partie responsable de la mortalité 3. le développement de la thérapie pour RCC a progressé au cours de la dernière décennie avec la découverte et la mise en œuvre des thérapies ciblées et immunothérapies. Malheureusement, SURVIV sans progressional et la survie globale des cas avancés sont encore bien moins de 2 ans pour la majorité des patients 4, 5, 6. Ces statistiques justifient la nécessité de poursuivre la recherche sur l&#39;identification et le développement de traitements efficaces pour RCC. Pour faire avancer de manière adéquate les interventions thérapeutiques de MRCC, traductionnelle pertinents modèles pré-cliniques de la maladie sont d&#39;abord nécessaires. Développement d&#39;un modèle pertinent et cohérent pour récapituler la condition humaine du RCC avancé devrait répondre à plusieurs questions clés: 1) Le modèle est anatomiquement pertinent; 2) Est-ce que les progrès de la tumeur de façon similaire à la pathologie humaine; 3) Est-ce métastases proviennent de la tumeur primitive; et 4) peut progression de la tumeur primaire et métastatique surveiller au fil du temps? Selon le type de traitement à l&#39;étude, les lignées cellulaires de souris de tumeurs RCC, des lignées de cellules tumorales RCC humaines et xenog patient humain dérivé RCCradeaux peuvent être utilisés dans des souris immunocompétentes ou immunodéprimées. Un hôte avec un système immunitaire intact et fonctionnel est requis pour ces études évaluant un aspect de l&#39; immunothérapie, ce qui nécessite l&#39;utilisation de la lignée de cellules Renca bien décrit dérivée d&#39;un adénocarcinome rénal spontanée des souris Balb / c 7. La plupart des études injectent cellules RENCA sous - cutanée (sc), qui forme une tumeur locale facile à mesurer, ou par voie intraveineuse (iv) à des souris Balb / c pour produire des &quot;métastases&quot; pulmonaires expérimentales 8, 9, 10, 11, 12. Utilisation d&#39;une tumeur Renca implanté sc-RCC au modèle humain a un certain nombre de limitations, y compris innervation inexacte de vascularisation 13, les différences de microenvironnement 14, 15, et l&#39;absence d&#39;organe / tumeur cellulaire Communication 13, 16. En outre, de nombreuses tumeurs sc ( en particulier Renca) ne métastasent pas aux organes distaux, l&#39; inhibition de l&#39;étude d&#39;un événement qui est une caractéristique clinique commune 17. Pour étudier CRm, cellules RENCA peuvent être injectées par voie iv à établir la charge tumorale dans les poumons, l&#39;emplacement principal de métastases chez des patients atteints de RCC. La méthode d&#39;injection par voie intraveineuse d&#39;initier des tumeurs métastatiques, cependant, ne permet pas l&#39;étude de la manière dont, quand, ou pourquoi les cellules ont migré de l&#39;organe primaire ( par exemple, le rein) vers le site distant. Un modèle à la fois la maladie primaire et métastatique évidente dans le même animal est cruciale pour étudier la progression et le traitement de la maladie avancée, d&#39;autant plus que les métastases sont généralement la cause de mortalité chez ces patients. Notre laboratoire a mis au point un modèle murin de mRCC qui intègre toutes les fonctionnalités décrites ci-dessus. Pour établir prtumeurs imary, orthotopique, cellules RENCA sont implantés directement dans le rein de l&#39;animal à travers le péritoine translucide. Une petite incision dans le flanc gauche permet la visualisation de la rate (en tant que point de repère), et le rein gauche. En utilisant une aiguille de petit calibre, les cellules tumorales Renca sont injectés directement dans le rein à travers le péritoine pour une implantation orthotopique. Par rapport à d&#39; autres méthodes d&#39;implantation de cellules Renca sous la capsule du rein 18, cette méthode d&#39;implantation permet un débit plus élevé, car il est assez non invasive, ne nécessite pas suturer, est d&#39;une classe faible de la douleur, et le temps efficace lorsque exercé. Ces résultats du modèle bien caractérisé en charge de la tumeur primaire reproductible (~ de taux d&#39;utilisation de 99%) dans le rein injecté ainsi que la charge de la tumeur métastatique dans les poumons. Les avantages significatifs de ce modèle sont sa nature syngéniques, ce qui permet des enquêtes d&#39;immunothérapie; ses métastases spontanées, pour étudier unemaladie VANCÉES; et son implantation orthotopique, pour modéliser l&#39;impact anatomique sur la progression et le traitement des maladies. Les thérapies visant à cibler RCC bénéficieraient grandement de l&#39;utilisation de ce modèle au cours du développement pré-clinique.

<table><tbody><tr><td>Larmes artificielles pommade ophtalmique</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Adhésif tissulaire</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Bétadine Solution (Povidone-iode, 5 %)</td><td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % de marcaine (injection de chlorhydrate de bupivavaine)</td><td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Venture</td><td>908291</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp ;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Sels équilibrés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IVIS Pied à coulisse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciférin, Sel de potassium</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Encre de Chine</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>Pince</tr><tr><td>La Belle au bois dormant (SB) système de transposon</td><td>Neuromics</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de souris syngénique rénal métastatique carcinome cellulaire pour l&#39;évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

carcinome à cellules rénales (RCC) affecte&gt; 60.000 personnes aux Etats-Unis chaque année, et environ 30% des patients RCC ont de multiples métastases au moment du diagnostic. RCC métastasique (CRm) est incurable, avec un temps de survie médian de 18 mois. Interventions à base immunitaire (par exemple, l&#39; interféron (IFN) et l&#39; interleukine (IL) -2) induire des réponses durables dans une fraction des patients CRCR et les inhibiteurs de kinases multiples (par exemple, sunitinib ou sorafenib) ou anti-récepteur de VEGF anticorps monoclonaux (mAb) sont en grande partie palliatives, comme rémissions complètes sont rares. De telles lacunes dans les thérapies actuelles pour les patients MRCC fournissent la justification de l&#39;élaboration de protocoles de traitement nouveaux. Un élément clé dans le test pré-clinique de nouvelles thérapies de MRCC est un modèle animal approprié. caractéristiques bénéfiques qui récapitulent la condition humaine comprennent une tumeur rénale primaire, métastases tumorales rénales, et un système immunitaire intact d&#39;enquêter sur toute effecto immunitaire axée sur la thérapieRéponses r et la formation de facteurs immunosuppresseurs induite par une tumeur. Ce rapport décrit un modèle de souris orthotopique mRCC qui a toutes ces caractéristiques. Nous décrivons une technique d&#39;implantation intrarénal en utilisant la lignée cellulaire rénale de la souris adénocarcinomes Renca, suivi par l&#39;évaluation de la croissance tumorale dans le rein (site principal) et les poumons (site métastatique).

<html> L&#39;implantation réussie de cellules RENCA se traduira par le développement de la tumeur dans le rein et les métastases aux poumons des souris. Après l&#39;excision du porteur d&#39; une tumeur et les reins controlatéraux, des poids de tissu humide (g) ont été mesurés afin de démontrer la charge tumorale par rapport au poids accru (figure 1). Les tumeurs RENCA peuvent être identifiés par immunohistochimie par cytokératine 8 et 18 coloration (Figure 2).</s...

Mise en oeuvre d&#39;un modèle orthotopique de carcinome rénal chez les souris immunocompétentes donne le chercheur un système cliniquement pertinente définie par la présence d&#39;une tumeur rénale et des métastases pulmonaires primaires dans le même animal. Ce système peut être utilisé pour tester précliniquement une variété de traitements in vivo.

Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour l&#39;évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

L'objectif général de cette procédure est d'établir des tumeurs rénales orthotopiques chez la souris par l'implantation intrarénale de cellules tumorales afin d'étudier la croissance tumorale, les métastases et l'efficacité des thérapies anti-tumorales. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de l'oncologie urologique, telles que l'efficacité d'une nouvelle thérapie dans un modèle préclinique de cancer du rein. Le principal avantage de cette technique est que l'implantation tumorale intrarénale permet d'obtenir une tumeur rénale primitive métastasant aux poumons, reproduisant ainsi la pathogenèse du carcinome rénal observée en clinique.Pour préparer les cellules tumorales Renca, commencez par détacher la culture cellulaire à l’aide de trypsine 0,25 % et de HBSS après un rinçage au PBS. Neutralisez la réaction après cinq minutes à l’aide de milieu RPMI complet. Transférez les cellules dans un tube conique pour centrifugation, puis remettez en suspension le culot dans du HBSS frais.Après le comptage, ajuster le volume à une concentration de deux fois dix puissance six cellules par millilitre dans du HBSS, puis aspirer les cellules dans une seringue d'un millilitre munie d'une aiguille de calibre 18. Ensuite, placer un champ opératoire stérile sur un tapis chauffant et vérifier le niveau approprié de sédation par une pression sur l'orteil. Raser les poils du flanc gauche de la souris et appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux.Ensuite, désinfecter le site d'implantation avec un antiseptique à la povidone iodée à 5 % et utiliser un scalpel stérile pour pratiquer une incision unique d'un à un centimètre et demi sur le flanc gauche, en prenant soin de ne pas pénétrer le péritoine. À l'aide de ciseaux, séparer le derme du péritoine, en tamponnant le site d'incision avec une gaze stérile en coton pour éliminer tout sang. Puis saisir la tête avec la main gauche et soutenir le flanc avec la main droite afin de localiser la rate à travers le péritoine.À l’aide d’un doigt de la main droite, palper la souris par en dessous. Le rein devrait devenir visible. En maintenant fermement l’animal afin d’exercer une tension sur le péritoine et le rein, demander à un assistant d’injecter lentement 0,1 millilitre des cellules Renca à travers le péritoine intact au centre du rein.Immobilisez l'aiguille pendant cinq à dix secondes afin de réduire le reflux des cellules. Ensuite, fermez l'incision avec une fine couche d'adhésif tissulaire à base de cyanoacrylate. Au point final de l'expérience, utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision médiane, en partant de la région abdominale moyenne jusqu'au niveau de la cage thoracique, du cou et des glandes salivaires.À l’aide de ciseaux et de forceps, retirer soigneusement les côtes sans endommager le tissu pulmonaire, puis enlever le tissu conjonctif afin d’exposer la trachée. Remplir une seringue de trois millilitres équipée d’une aiguille de calibre 18 avec de l’encre de Chine à 10 % et du PBS. Ensuite, utiliser le forceps pour passer délicatement un fil de suture en soie sous la trachée, puis faire un nœud lâche.Ensuite, insérez soigneusement l'aiguille dans la trachée et gonflez lentement les poumons avec un à un millilitre et demi de la solution d'encre de Chine. Serrez fermement le nœud autour de la trachée pour empêcher le reflux de l'encre, puis retirez l'aiguille et découpez délicatement le tissu conjonctif afin d'extraire les poumons gonflés. Fixez les poumons dans un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de solution de Fekete, dans une hotte chimique à température ambiante.Après 24 à 48 heures, retirez les poumons intacts décolorés et séparez soigneusement les lobes dans une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres. Comptez ensuite le nombre de nodules tumoraux blancs au microscope stéréoscopique. Une implantation intrarénale réussie de cellules Renca chez la souris entraîne un développement tumoral au niveau du rein et une métastase pulmonaire, les animaux porteurs de tumeurs présentant une charge tumorale importante, mesurée par l'augmentation du poids des reins implantés avec la tumeur.Comme observé, les tumeurs Renca peuvent être identifiées par coloration immunohistochimique de la cytokeratine huit et 18. L'implantation d'une lignée cellulaire Renca exprimant la luciférase permet le suivi de la charge tumorale au niveau du rein et des métastases pulmonaires par imagerie bioluminescente, comme le confirme davantage l'inflation pulmonaire à l'encre de Chine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de cinq minutes par souris si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien identifier le rein à travers le péritoine afin de garantir une implantation tumorale intrarénale précise. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme les tests précliniques de médicaments, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que dans quelle mesure un nouveau médicament affecte-t-il la croissance ou la métastase de tumeurs intrarénales ? Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer l'implantation de cellules tumorales intrarénales afin de créer des tumeurs rénales orthotopiques chez la souris.N'oubliez pas que le travail avec des animaux vivants et des instruments chirurgicaux peut présenter des risques, et que des précautions, telles que le respect des directives institutionnelles de manipulation des animaux et le maintien d'un champ chirurgical et d'instruments stériles, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Dans cette vidéo, nous développons un modèle murin orthotopique de carcinome à cellules rénales. Ce modèle aboutit à des tumeurs primaires reproductibles dans le rein injecté et à des tumeurs métastatiques dans le poumon, permettant d’évaluer la progression de la maladie et le traitement.

Génération d’un modèle de carcinome à cellules rénales : un protocole pour développer un modèle murin orthotopique de RCC par implantation intrarénale de cellules cancéreuses

Ce modèle orthotopique de cancer de la prostate humain permet la quantification de la taille de la tumeur, les cellules tumorales circulantes, et la formation de métastases dans le poumon distinct. Comme les cellules doivent échapper à l'organe principal, entrer dans la circulation sanguine, et implanter dans un site secondaire, ce modèle reprend effectivement le scénario chez les humains.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Les modèles de métastases de carcinome à cellules rénales (RCC), la progression de la maladie spontanée peuvent être utilisées pour l'évaluation des traitements dans un cadre clinique. Ce protocole illustre différentes procédures d'implantation orthotopique de cellules de tumeur du rein, une néphrectomie proprement dit, et présente enfin un guide de notation visuelle de l'autopsie et bioluminescent de charge métastatique et de la localisation.

Modélisation spontanée carcinome rénal métastatique (MRCC) chez des souris après néphrectomie

Un modèle murin de métastases hépatiques préclinique réalisée par une technique d'injection de hemispleen.

Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

La dissémination métastatique du cancer est la principale cause de décès liés au cancer. Nous fournissons une description en profondeur de notre méthodologie de chirurgie de survie pour établir un système orthotopique "patient comme" modèle de souris syngénique pour étudier les mécanismes de métastases dans les tumeurs d'organes solides.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.

Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie

Le carcinome rénal métastatique de cellules claires est une maladie sans modèle animal complet pour l’investigation préclinique complète. Ce protocole illustre deux nouveaux modèles animaux pour la maladie : le modèle orthotopique ment implanté de souris et le modèle chorioallantoic de membrane de poulet, qui démontrent la métastasis de poumon ressemblant à des cas cliniques.

Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

Il s’agit d’une méthode efficace pour dépister les suppresseurs ou les facteurs de métastases cancéreuses. Les cellules, transduites avec une bibliothèque d’expressions, sont injectées dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque du poulet pour former des colonies métastatiques. Les colonies ayant un caractère invasif diminué ou accru sont excisées, élargies, réinjectées pour confirmer leur phénotype et, enfin, analysées à l’aide d’un séquençage à haut débit.

Découverte de régulateurs métastatiques à l’aide d’un modèle de membrane chorioallantoïque intravitale rapide et quantitative du poussin

Cet article décrit un flux de travail de techniques utilisées pour tester de nouveaux médiateurs candidats de métastases de mélanome et leur(s) mécanisme(s) d’action.

Une plateforme de découverte robuste pour l’identification de nouveaux médiateurs de métastases de mélanome

L’un des principaux défis du développement de nouvelles thérapies pour le cancer du poumon consiste à modéliser le microenvironnement tumoral à mesure que la maladie régionale progresse vers une maladie métastatique. Ici, nous décrivons une méthode simple d’établissement d’un modèle syngénique orthotopique du cancer du poumon qui permet un suivi in vivo de la maladie au fil du temps.

Méthode peu invasive de génération d’un modèle murin orthotopique syngénique de cancer du poumon

Découvrez l'implantation intrarénale de cellules tumorales Renca chez la souris immunocompétente pour modéliser le carcinome rénal métastatique. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité des thérapies antitumorales dans un contexte préclinique réaliste.

Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour lévaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques (Vidéo) | JoVE Journal

Un modèle de souris syngénique rénal métastatique Carcinome cellulaire pour l'évaluation des thérapies quantitatives et longitudinales précliniques

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