Electrophorèse Capillaire séparation de l'anticorps monoclonal isoformes Utilisation d'un Capillaire Neutre

De nos jours, la technique de l'électrophorèse capillaire de cellules constitue l'un des domaines les plus résolutifs et sensibles pour l'analyse de biomolécules telles que les anticorps monoclonaux. Toutefois, la mise en œuvre réussie de cette technique dépend des connaissances et des compétences de l'analyste lors des étapes critiques de la préparation des échantillons et du système. Ce tutoriel vise à expliquer comment réaliser une analyse réussie, en fournissant une description véritablement détaillée de la préparation des solutions et des échantillons, de la mise en place du système d'électrophorèse capillaire, de la configuration de la méthode instrumentale, ainsi que de l'interprétation et du traitement des données.

Dans l'ensemble, ce protocole peut être utilisé pour le développement et l'amélioration des compétences du personnel impliqué dans la préparation des laboratoires de chimie analytique. Peser la quantité d'HPMC nécessaire pour obtenir une concentration finale de 0,05 pour cent dans 100 millilitres. Étant donné que l'HPMC est un polymère élastique de base, en premier lieu, verser le produit dans un bécher en verre et ajouter lentement 80 millilitres d'eau afin de désagréger la poudre.

Ensuite, rincez le plateau d'humidification à l'eau pour éliminer les traces de poudre. Ajoutez les réactifs restants comme d'habitude et mélangez la solution. Ajustez la valeur de pH à 4,8 à l'aide d'acide acétique à 50 %.

Et laisser la solution se stabiliser pendant cinq minutes. Après cela, ajuster le pH si nécessaire. Ajouter de l'eau pour compléter jusqu'au volume final de 100 millilitres.

Filtrez la solution de BG préparée à travers une membrane neutrophile et versez-la dans un flacon en verre. Enfin, étiquetez correctement le flacon en verre et conservez-le au réfrigérateur. Pour préparer l'échantillon, ajoutez dans un premier temps 162 microlitres de solution tampon oligo-éléments dans un tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajouter 18 microlitres d'un échantillon de map préparé au préalable à une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Comme troisième étape, ajouter 20 microlitres d'une solution d'histamine à un pour cent préparée au préalable afin d'obtenir un volume final d'échantillon de 200 microlitres. Étape suivante : préparer l'échantillon pendant cinq secondes.

Et centrifuger pendant cinq secondes. Aspirer le volume total de l'échantillon. Puis distribuer vers le haut dans un microflacon afin d'éviter d'introduire des bulles.

Enfin, fermer le flacon et le conserver au réfrigérateur. Éteindre l'appareil d'électrophorèse capillaire en appuyant sur l'interrupteur d'alimentation. Puis ouvrir la porte avant.

Placer un nouveau chiffon absorbant sous le bloc d'interface. Rincer les électrodes à travers le bloc d'interface avec de l'eau à l'aide d'une bouteille lavante. Laisser l'eau s'écouler par les trous et sécher soigneusement le bloc d'interface.

Retirez soigneusement l'excès d'eau des électrodes à l'aide du chiffon. Veillez à ne pas toucher les électrodes pendant cette procédure. Retirez le chiffon du système de maintien de l'échantillon.

Nettoyez la surface des plateaux d'échantillons avec une lingette neuve humidifiée à l'eau et non pelucheuse. Et la surface des plateaux de tampon. Faites glisser les plateaux de tampon vers le haut, relevez le système de maintien des échantillons, puis nettoyez leur surface à l'aide de la lingette.

Remettez les bacs à tampon en position. Ensuite, nettoyez soigneusement le bloc d'interface. Nettoyez la barre de serrage et le boîtier de la lampe UV.

À la fin, assurez-vous de tester le système avant utilisation. Rincez les leviers d'ouverture avec de l'eau à l'aide d'un flacon pulvérisateur. Nettoyez soigneusement leur surface avec une lingette neuve non pelucheuse afin d'éliminer la poussière et les sels accumulés.

Enfin, assurez-vous de les tester avant l'installation. Nettoyez les deux extrémités du câble de fibre optique avec un chiffon en microfibre légèrement humidifié et vérifiez la transmission de la lumière entre les deux extrémités. Retirez une nouvelle capillaire neutre de son emballage.

Prenez maintenant une extrémité du tube de protection du capillaire jusqu'au plan de travail. Déroulez et redressez le tube en plastique, puis sortez délicatement le capillaire du tube. Fixez un morceau de papier sur le plan de travail avec les repères de mesure suivants.

Alignez la fenêtre du capillaire avec le point zéro des repères de mesure en centimètres comme suit : fixez ensuite les extrémités du capillaire sur le plan de travail à l’aide de ruban adhésif. Marquez les extrémités du capillaire à deux millimètres à l’extérieur des repères de mesure. Coupez le bouchon de protection à l’extrémité du capillaire la plus éloignée de la fenêtre.

Et immergez l'extrémité du capillaire dans un flacon d'électrophorèse rempli d'eau afin d'éviter d'endommager de façon permanente le revêtement interne du capillaire. Retirez le capillaire du flacon et insérez cette extrémité soigneusement dans le côté sortie de la cartouche. Une fois que le capillaire apparaît de l'autre côté, tirez-le suffisamment pour que la fenêtre du capillaire soit centrée par rapport à la fenêtre de la cartouche, comme suit.

Après cela, retournez la cartouche et insérez le bouchon d'ouverture dans la fenêtre de la cartouche, en appuyant fermement pour le mettre en place. Veillez à ne pas briser la fenêtre capillaire pendant cette opération. Vérifiez que la lumière traverse la fenêtre lorsqu'elle est exposée à une source lumineuse large.

Introduire la capillarité dans le tube de liquide de refroidissement préformé comportant le tube préinstallé non feral et le joint torique. Pousser la capillarité à travers le tube jusqu'à ce qu'elle apparaisse de l'autre côté. Ensuite, insérer l'extrémité du tube du côté de la sortie de la cartouche, puis serrer les écrous du tube.

Insérez l'extrémité d'entrée du capillaire dans le côté d'entrée de la cartouche. Une fois que le capillaire apparaît de l'autre côté, tirez selon les besoins. Ensuite, insérez l'extrémité du tube dans le côté d'entrée de la cartouche et serrez les écrous du tube.

Coupez le bouchon de protection à l'extrémité capillaire la plus proche de la fenêtre. Installez ensuite les attaches de fixation de la cellule sur les extrémités capillaires en appuyant fermement pour les mettre en place comme suit. Coupez les extrémités capillaires en dessous des lignes de référence sur les plaques capillaires allongées.

Veillez à inspecter les extrémités des capillaires à l'aide d'une loupe. Si les extrémités des capillaires ne sont pas lisses, polissez-les à l'aide de la pierre à graver. Placez le joint torique d'ouverture dans le trou bleu d'ouverture.

Puis insérez-le soigneusement à l’aide de l’outil d’insertion de joint torique. Enfin, installez des vials CE remplis d’eau dans le boîtier de cartouche, placez immédiatement la cartouche dans le boîtier en insérant les extrémités capillaires dans les vials, puis conservez au réfrigérateur. Réglez le volume de la pipette.

Ajoutez le volume correct d'eau dans l'entrée tampon aux coordonnées du plateau A1, B1 et F6. Et à la sortie tampon aux coordonnées du plateau A1, B1, C1, E6 et F6. Ajoutez de l'acide chlorhydrique 0,1 normal aux coordonnées du plateau d'entrée tampon C1 et E6. Et ajoutez du BGE aux coordonnées du plateau d'entrée tampon D1 et E6. Et au plateau de sortie tampon à la coordonnée D1. Enfin, fermez hermétiquement toutes les fioles d'électrophorèse capillaire présentes dans les plateaux d'entrée et de sortie tampon. Pendant la procédure, évitez de mouiller les bouchons des fioles afin de prévenir toute fuite de carbone. Ouvrez la porte avant de l'appareil d'électrophorèse capillaire.

Tout d'abord, installez le détecteur UV et fixez-le en tournant la vis dans le sens horaire. Soulevez la porte intérieure, puis installez les leviers d'ouverture en les enfonçant vers le haut dans le bloc d'interface. Insérez le câble de fibre optique dans le serre-câble et tournez dans le sens horaire.

Et connectez l'autre extrémité au détecteur. Manipulez le câble de fibre optique avec précaution, car une flexion pourrait entraîner sa rupture. Placez le plateau d'échantillons dans le système de maintien de l'échantillon et fixez-le en position.

Suivant la même procédure, placez les bacs à tampon dans le système de maintien des échantillons. Relevez la barre de serrage et insérez la cartouche capillaire dans le bloc d'interface. Appuyez sur la barre de serrage aux deux extrémités et serrez les molettes en tournant dans le sens horaire.

Fermez la porte intérieure, puis fermez la porte avant. Enfin, allumez l'appareil de CEC en appuyant sur l'interrupteur d'alimentation. Créez la méthode d'assaisonnement de l'appareil.

Configurez les paramètres dans la section des conditions initiales, y compris la tension, la cartouche, la température de stockage de l'échantillon et les réglages de déclenchement. Sélectionnez deux mille quatorze comme longueur d'onde d'acquisition. Déclarez les actions à effectuer par l'instrument en configurant les paramètres dans des cellules programmées temporellement.

Y compris les réglages spécifiques pour chaque étape de rinçage, d'injection et de séparation. Réalisez cette procédure afin de créer les méthodes d'initialisation, de fonctionnement et d'arrêt de l'appareil. L'étape suivante consiste à créer une nouvelle séquence.

Programmez le capillaire pour le conditionnement en utilisant la méthode de conditionnement. Si le capillaire est utilisé pour la première fois, programmez quatre répétitions. Sinon, programmez deux répétitions.

Ensuite, programmez les échantillons à analyser en utilisant la méthode de fonctionnement. Enfin, programmez le capillaire pour le stockage en utilisant la méthode d'arrêt. L'analyse par électrophorèse capillaire est terminée en moins de 30 minutes.

Le premier résultat correspond à l'étalon interne d'histamine en tant que mesure de la performance du système adeque. Celui-ci est suivi par les formes basiques, principales et acides distinctives de la monoclonale anthiberi ebaluadith. L'ensemble de la course de séparation s'effectue sous un courant constant d'environ 30 microampères.

Après avoir effectué l'expérience, exportez les données brutes à partir du logiciel grab et importez-les via le logiciel empower pour traitement. Le pourcentage de chaque forme de glace est obtenu après intégration verticale par droite tombante du profil électrophorétique. Nous présentons ici un guide détaillé, étape par étape, pour réaliser l'analyse des activités monoclonales générées par électrophorèse capillaire cellulaire.

Outre plusieurs recommandations visant à atténuer les problèmes potentiels, le protocole présenté offre en outre l'avantage de pouvoir être facilement personnalisé pour l'analyse d'autres protéines, moyennant de légères modifications des paramètres de conductivité et de pH.