Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

L’objectif global de cette méthode de fabrication d’hydrogels personnalisés est d’étudier les cellules et les conditions de culture qui reproduisent la complexité de la matrice extracellulaire pulmonaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine pulmonaire, telles que la façon dont les cellules pulmonaires interagissent avec la MEC dans des conditions saines et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est que les hydrogels ECM pulmonaires sont adaptables à votre application en culture 2D ou 3D.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à cause de la complexité des techniques de décellularisation, nécessitant parfois plusieurs personnes et une attention aux détails pour optimiser la quantité de tissu viable. Pour ce protocole, ayez un poumon porcin prêt pour la décellularisation. On trouvera des détails sur sa préparation dans le protocole de texte.

Une fois le poumon préparé, utilisez une pompe à main canulée pour s’adapter à l’artère pulmonaire. Tout d’abord, perfaction environ un litre d’eau dans le système vasculaire, puis 1,5 litre dans la trachée. Faites cela trois fois, en augmentant le volume d’eau perfusé à mesure que les débris cellulaires sont éliminés.

Ensuite, perfuser le tissu avec du Triton X-100, également à l’aide de la pompe à main. Ensuite, immergez le tissu dans un bain de solution Triton X-100 à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, rincez le système vasculaire et la trachée trois fois avec de l’eau distillée.

Après les rinçages, utilisez la pompe à main pour perfuser le tissu avec du désoxycholate. Ensuite, immergez les tissus dans du désoxycholate pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez le mouchoir trois fois à l’eau distillée, comme précédemment.

Après les rinçages, utilisez la pompe à main pour perfuser le tissu avec du chlorure de sodium filtré. Ensuite, plongez le tissu dans du chlorure de sodium filtré pendant une heure à quatre degrés Celsius. Après le bain, perfuser le système vasculaire et la trachée trois fois avec de l’eau distillée pour rincer.

Après les rinçages, perfuser le tissu avec la solution de DNase, puis l’immerger dans une solution de DNase pendant une heure à quatre degrés Celsius. Au bout d’une heure, perfuser le système vasculaire et la trachée cinq fois en utilisant du PBS, et non de l’eau. Maintenant, en utilisant uniquement un tissu blanc opaque, disséquez tous les tubules de deux millimètres de diamètre ou plus.

Ils se trouvent principalement autour du hile et des parties médiales des poumons. Laissez intactes les zones respiratoires, qui se trouvent principalement à la périphérie. Après avoir retiré les tubules, disséquez le tissu en sections d’un pouce ou moins.

L’orientation de ces blocs n’a pas d’importance. Après avoir égoutté les blocs de tissus, transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres et congelez-les à 80 degrés Celsius. Quelques blocs peuvent être réservés à l’histologie pour confirmer l’élimination des cellules et des débris.

Pour transformer le tissu pulmonaire en poudre décellularisée, remplacez le couvercle du tube de tissu congelé par un papier filtre et fixez-le avec un élastique. Ensuite, lyophilisez le tissu jusqu’à ce que tout l’excès de liquide ait disparu à l’aide d’un lyophilisateur selon les instructions du fabricant. Ensuite, conservez le tissu à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il puisse être broyé.

Pour préparer le broyeur, chargez-le d’abord avec de l’azote liquide, en laissant de la place pour le tube du broyeur. Ensuite, du tube du broyeur, retirez la barre magnétique du broyeur et couvrez le bas du tube avec du tissu. Ensuite, replacez la barre du broyeur et tassez sans serrer plus de tissu pour remplir le tube.

Ensuite, fermez le tube du broyeur, placez-le dans le congélateur/broyeur et remplissez le moulin d’azote liquide jusqu’à sa capacité maximale. Maintenant, faites fonctionner le moulin pendant environ cinq minutes avec un taux d’impaction d’environ 600 par minute. Ensuite, conservez la poudre décellularisée à 80 degrés Celsius, jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Pour fabriquer le matériau de pré-gel, ajoutez de la poudre de tissu décellularisé et de la pepsine dans un tube conique. Ajoutez ensuite 0,01 molaire d’acide chlorhydrique dans le tube, pour une concentration finale de 1 % de poudre de tissu décellularisé et 0,01 % de pepsine. Gardez cette solution sous agitation constante à température ambiante pendant 48 heures pour digérer les tissus.

Après 48 heures, mettez la solution sur de la glace pendant cinq minutes. Ajustez maintenant le pH de la solution à 7,4 en utilisant de l’hydroxyde de sodium froid de 0,1 molaire, puis amenez la concentration de PBS de la solution à 1X en ajoutant 10X PBS. Nous avons une certaine expérience de la modification des temps et du pH du pré-gel.

Il y a une certaine flexibilité dans la gamme qui peut être utilisée, mais les propriétés peuvent changer radicalement si la procédure est modifiée de manière mineure. La solution n’est pas considérée comme un pré-gel et elle peut être utilisée pour enrober des plaques non traitées pour former des hydrogels sur lesquels former des cellules, pour former des hydrogels dans lesquels former des cellules, ou elle peut être modifiée avant de former des hydrogels pour augmenter la rigidité des hydrogels. Pour cultiver des cellules sur un revêtement de gel microporeux bidimensionnel, ajoutez 20 microlitres de solution de prégel dans les puits d’une plaque de culture tissulaire non traitée à 96 puits.

Ensuite, réfrigérez l’assiette pendant la nuit à quatre degrés Celsius afin que les protéines soient absorbées dans l’assiette. Le lendemain, aspirez la solution de pré-gel et rincez les puits avec du PBS. Ensuite, ajoutez 3 200 cellules dans chaque puits et remplissez le volume de média dans chaque puits à 100 microlitres.

Les plaques peuvent ensuite être incubées. Pour une culture cellulaire tridimensionnelle avec des cellules à l’intérieur du gel microporeux, remettre en suspension les cellules d’intérêt à raison d’un million par millilitre dans une solution pré-gel. Ensuite, distribuez rapidement 16 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour former une culture cellulaire 3D d’environ 500 microns d’épaisseur.

Le gel se formera en 30 minutes une fois incubé à 37 degrés Celsius. Une fois les gels formés, ajoutez du milieu dans les puits jusqu’aux marques de 100 microlitres. Pour une culture cellulaire tridimensionnelle avec des cellules sur le gel microporeux, ajoutez les 100 microlitres de la solution de pré-gel dans les puits d’une plaque non traitée à 96 puits.

Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour la gélification. Une fois les gels formés, ajoutez 3 200 cellules dans un milieu de 100 microlitres sur les hydrogels et procédez à l’incubation de la plaque. Des hydrogels ont été produits à partir de poumons normaux de porc, de rat et de souris en utilisant la méthode décrite.

Les tests rhéologiques ont confirmé que plus de 90 % de la gélification se produit dans les premières minutes après avoir atteint 37 degrés Celsius. Les hydrogels formés sont restés stables pendant de longues périodes dans le PBS, mais l’attachement et la prolifération des cellules peuvent changer avec le temps. La solution de pré-gel a été testée en tant que codage pour améliorer la fixation des cellules.

L’attachement et la prolifération des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ont été mesurés à l’aide d’un MTTSA. Des améliorations ont été observées en recouvrant les puits d’ECM. Lors de la fabrication de gels 3D, l’ajout de Genipin a augmenté la réticulation de l’hydrogel.

En utilisant des balayages fréquentiels sur un rhéomètre, la rigidité de l’hydrogel a été directement corrélée à la concentration de Génipin, la concentration médiane et la plus pertinente étant de 0,01 %. En testant les gels les plus rigides, la prolifération cellulaire a été mesurée comme étant plus élevée par un MTTSA sur les gels avec une réticulation accrue. Une fois maîtrisée, la décellularisation peut être réalisée en huit heures sur quatre jours. La solution de pré-gel peut être préparée en une heure sur deux jours, et la formation du gel peut être réalisée en deux heures sur deux jours.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’AFM, les western blots, la coloration et l’immunohistochimie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que le module d’élasticité, la composition des protéines et la réponse cellulaire au matériau.