Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

L'objectif général de ce protocole est d'évaluer les effets de nutriments supplémentaires dans un modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sodique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie intestinale concernant le développement des sciences cliniques à travers la conduite de l'expérience sur le modèle de colite. Les principaux avantages de cette technique sont son faible coût, l'absence d'équipement sophistiqué nécessaire et la possibilité d'obtenir une analyse claire de la morphologie de tout le côlon.

Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le stress oxydatif dans le côlon consécutif à un recrutement excessif de neutrophiles. Pour l'administration de suppléments nutritionnels par gavage, immobilisez d'abord la souris manuellement par le garrot, en plaçant la queue entre le troisième doigt et la base du pouce. Ensuite, tout en maintenant la souris en position verticale, insérez l'aiguille de gavage du côté gauche de la bouche de l'animal et suivez soigneusement le palais pour localiser l'œsophage.

Si aucune résistance n'est rencontrée, avancer l'aiguille vers l'estomac. Administrer lentement tout le volume du supplément, puis retirer soigneusement la seringue et mesurer le poids corporel de l'animal. Attribuer un score de zéro à quatre selon le pourcentage de perte de poids, puis prélever un échantillon frais de selles et utiliser les applicateurs fournis pour appliquer une mince couche d'échantillon sur une lame à partir d'un kit de test de recherche de sang occulte dans les selles par la méthode de la guaïac.

Fermer le couvercle sur l’avant du kit et ouvrir la fenêtre arrière pour appliquer deux gouttes de la solution de développement à l’arrière du lieu d’échantillonnage. Lire les résultats après 30 secondes, en attribuant un score de zéro à quatre selon l’intensité du signal. Ensuite, observer un deuxième échantillon frais de selles pour évaluer la consistance des selles, en attribuant un score de zéro à quatre selon le cas.

Pour déterminer la perméabilité épithéliale intestinale in vivo, placez un animal anesthésié en position supine et pratiquez une incision médiane afin d'exposer les intestins. Localisez le caecum et effectuez une petite incision dans le segment proximal du colon ascendant. Insérez ensuite une canule d'alimentation de calibre 22 et fixez-la à l'aide d'un ligature en fil de soie ordinaire.

Passer soigneusement un grand volume de PBS à travers l'aiguille pour rincer toutes les fèces du côlon, puis introduire une solution de bleu d'Évans jusqu'à ce que le colorant atteigne l'anus. Après 15 minutes, rincer le tube avec un excès de PBS jusqu'à ce que le lavage périanal soit limpide. Ensuite, exciser le côlon et rincer le tissu avec davantage de PBS, suivi d'un millilitre de N-acétylcystéine à six millimolaire afin d'éliminer tout colorant adhérent au mucus colique.

À présent, incisez le côlon longitudinalement et rincez le tissu une fois de plus avec du PBS et de la N-acétylcystéine, puis enregistrez le poids et la longueur du côlon et placez le tissu dans deux millilitres de N,N-diméthylformeamide à température ambiante sous agitation douce afin d'extraire le colorant résiduel, en mesurant les concentrations de colorant par spectrophotométrie à 610 nanomètres le lendemain matin. Après sept jours de sulfate de dextrane sodique, ou colite induite par DSS, disséquez entièrement le côlon et enregistrez sa longueur. Pour les préparations en « Swiss roll », ouvrez le côlon longitudinalement, retirez soigneusement toute matière fécale, puis utilisez un bâtonnet fin et rond en bois ou une pince à pointe fine pour enrouler le tissu avec la muqueuse tournée vers l'intérieur.

Ensuite, placer soigneusement le tissu à l'intérieur d'une cassette d'inclusion, puis fixer avec cinq millilitres de formaldéhyde à 10 % à température ambiante. Il est essentiel d'enrouler étroitement le côlon sans le plier afin d'éviter des problèmes lors de la coupe histologique, qui pourraient entraîner des lésions tissulaires cliniques et une interprétation erronée en tant que lésions associées à la colite. Après 48 heures, laver l'échantillon à l'eau du robinet pendant 18 heures, puis procéder à la déshydratation par une série d'éthanol.

Après la dernière immersion dans l'éthanol absolu, traiter le tissu par quatre incubations d'une heure dans le xylène. Après la dernière immersion dans le xylène, placer l'échantillon dans 50 millilitres de paraffine liquide pendant une incubation de 17 heures et une incubation de trois heures. À la fin de l'incubation de trois heures, plonger l'échantillon dans un moule carré en plastique de 22 millimètres cubes contenant de 8 à 10 millilitres de paraffine liquide fraîche pendant 24 heures.

Lorsque la paraffine est solidifiée, utiliser un microtome pour obtenir des sections tissulaires de cinq micromètres d'épaisseur, puis plonger brièvement les coupes transversales dans un bain d'eau d'un litre contenant 0,3 % de gélatine et monter immédiatement les échantillons sur des lames en verre traitées à la polylysine pour une coloration H&E. Pour l'analyse du stress oxydatif, créer d'abord une barrière autour du tissu à l'aide d'un stylo hydrophobe. Ensuite, incuber des coupes transversales cryogéniques tissulaires de huit micromètres dans une solution aqueuse de DHE à cinq micromolaire pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius à l'abri de la lumière.

L'incubation est suivie de trois lavages de 15 minutes dans du PBS avec agitation douce à température ambiante. Séchez les échantillons à l'air et ajoutez une goutte de milieu de montage pour protéger la fluorescence. Ensuite, observez la fluorescence de l'éthidium oxydé au microscope confocal à balayage laser avec un grossissement de 40x.

Le traitement par le DSS entraîne une augmentation continue de l'indice d'activité de la maladie, comme prévu, atteignant un score maximal le septième jour suivant l'induction. La supplémentation par un régime anti-inflammatoire retarde l'apparition précoce de la colite, bien que les effets protecteurs soient seulement marginaux aux points temporels ultérieurs. Une intervention diététique pourrait également prévenir l'augmentation induite par le DSS de la perméabilité épithéliale intestinale, ainsi que le raccourcissement du côlon.

La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine de tissus coliques distaux inclus en paraffine révèle que les échantillons témoins présentent une morphologie normale, tandis que les animaux traités au DSS montrent les signes typiques de la colite. Notamment, un traitement parallèle associé à une supplémentation alimentaire atténue nettement les modifications morphologiques induites par la colite, avec une morphologie globale similaire à celle du groupe témoin. La coloration en immunofluorescence du tissu colique distal indique également que les molécules des jonctions serrées et adhérentes sont internalisées lors de la colite induite par le DSS, et que la co-localisation de ces protéines est partiellement perdue au niveau des contacts entre les cellules épithéliales des cryptes.

Importamment, cette internalisation est réduite lorsque les souris traitées au DSS reçoivent un supplément alimentaire anti-inflammatoire et anti-oxydant. De plus, le recrutement important de neutrophiles vers le côlon en réponse à la colite induite par le DSS est contré par la supplémentation alimentaire, entraînant une amélioration concomitante du stress oxydatif induit par les neutrophiles et une légère réduction de la production de cytokines inflammatoires. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que les mesures en chambre d'affleurement, peuvent être réalisées afin d'analyser la résistance électrique de la barrière épithéliale dans le côlon.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la colite et l'exploration des mécanismes moléculaires de la pathogenèse de la colite ulcéreuse dans un modèle murin reproductible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser le développement de la colite ainsi que les effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions de la barrière épithéliale intestinale. N'oubliez pas que le travail avec des animaux vivants exige le respect de normes éthiques strictes afin d'éviter toute souffrance inutile.