Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

L’objectif général de ce protocole est d’évaluer les effets de nutriments supplémentaires dans un modèle murin de colite induite par le sulfate de sodium de dextran. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie intestinale sur le développement de la science clinique dans la direction de l’expérience du modèle de colite. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est peu coûteuse, qu’elle ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et qu’elle permet une analyse claire de la morphologie de l’ensemble du côlon.

Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le stress oxydatif dans le côlon à la suite d’un recrutement excessif de neutrophiles. Pour l’administration de suppléments nutritionnels par gavage, retenez d’abord manuellement la souris par la croûte, en plaçant la queue entre le troisième doigt et la base du pouce. Ensuite, en tenant la souris en position verticale, insérez l’aiguille de gavage dans le côté gauche de la bouche de l’animal et suivez attentivement le toit de la bouche pour localiser l’œsophage.

Si aucune résistance n’est rencontrée, avancez l’aiguille vers l’estomac. Administrez lentement tout le volume de supplément, puis retirez soigneusement la seringue et mesurez le poids corporel de l’animal. Attribuez un score de zéro à quatre en fonction du pourcentage de perte de poids, puis prélevez un échantillon de selles fraîches et utilisez les applicateurs fournis pour appliquer une fine couche d’échantillon sur une lame d’un kit de test de sang occulte fécal au gaïac.

Fermez le couvercle à l’avant du kit et ouvrez la fenêtre arrière pour appliquer deux gouttes de la solution de développement à l’arrière de l’emplacement de l’échantillon. Lisez les résultats après 30 secondes, en attribuant un score de zéro à quatre en fonction de l’intensité du signal. Observez ensuite un deuxième échantillon de selles fraîches pour évaluer la consistance des selles, en attribuant un score de zéro à quatre le cas échéant.

Pour déterminer la perméabilité épithéliale intestinale in vivo, placez un animal anesthésié en position couchée et faites une incision médiane pour exposer les intestins. Localisez le cæcum et faites une petite incision dans le segment proximal des ascendants du côlon. Insérez ensuite une aiguille d’alimentation de calibre 22 et fixez l’aiguille avec une ligature de fil de soie ordinaire.

Rincez soigneusement un volume abondant de PBS à travers l’aiguille pour rincer toutes les matières fécales du côlon, suivi de l’installation de la solution bleue d’Evans jusqu’à ce que le colorant atteigne l’anus. Après 15 minutes, rincez le tube avec un volume excessif de PBS jusqu’à ce que le lavage périanal soit clair. Ensuite, excisez le côlon et rincez le tissu avec plus de PBS, suivi d’un millilitre de N-acétylcystéine de six millimolaires pour éliminer tout colorant collant au mucus colique.

Maintenant, coupez le côlon longitudinalement et rincez le tissu une fois de plus avec du PBS et de la N-acétylcystéine, puis enregistrez le poids et la longueur du côlon et placez le tissu dans deux millilitres de N, N-diméthylformamide à température ambiante avec une légère agitation pour extraire le colorant restant, en mesurant les concentrations de colorant par spectrophotométrie à 610 nanomètres le lendemain matin. Après sept jours de sulfate de dextran sodique, ou colite induite par le DSS, disséquez tout le côlon et enregistrez sa longueur. Pour les rouleaux suisses, ouvrez le côlon longitudinalement, retirez soigneusement toute matière fécale et utilisez un bâton en bois mince et rond ou une pince à pointe fine pour rouler le tissu avec la muqueuse vers l’intérieur.

Ensuite, placez soigneusement le tissu à l’intérieur d’une cassette d’enrobage, puis fixez-le avec cinq millilitres de formaldéhyde à 10 % à température ambiante. Il est essentiel d’enrouler le côlon fermement sans le plier pour éviter les problèmes lors de la section tissulaire, ce qui pourrait entraîner des lésions tissulaires cliniques et une fausse interprétation comme des dommages associés à la colite. Après 48 heures, laver l’échantillon à l’eau du robinet pendant 18 heures, suivi d’une déshydratation par une série d’éthanol.

Après la dernière immersion absolue à l’éthanol, traitez le tissu avec quatre incubations d’une heure dans du xylène. Après la dernière immersion au xylène, placez l’échantillon dans 50 millilitres de paraffine liquide pour une incubation de 17 heures et une incubation de trois heures. À la fin de l’incubation de trois heures, immergez l’échantillon dans un moule en plastique carré de 22 millimètres cubes dans huit à 10 millilitres de paraffine liquide fraîche pendant 24 heures.

Lorsque la paraffine s’est solidifiée, utilisez un microtome pour acquérir des sections de tissu de cinq microns d’épaisseur, puis plongez brièvement les sections transversales dans un bain-marie d’un litre contenant 0,3 % de gélatine et montez immédiatement les échantillons sur des lames de verre traitées avec de la polylysine pour la coloration H&E. Pour l’analyse du stress oxydatif, créez d’abord une barrière autour du tissu à l’aide d’un stylo hydrophobe. Ensuite, incubez des coupes cryologiques de tissus de huit microns dans cinq DHE micromolaires dissoutes dans l’eau pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité.

L’incubation est suivie de trois lavages de 15 minutes dans du PBS avec une légère agitation à température ambiante. Faites sécher les échantillons à l’air libre et ajoutez une goutte de milieu de montage pour protéger la fluorescence. Observez ensuite la fluorescence de l’éthidium oxydé sur un microscope confocal à balayage laser à un grossissement de 40x.

Le traitement par le DSS conduit à un indice d’activité de la maladie en constante augmentation comme prévu, atteignant un score maximum le septième jour après l’induction. La supplémentation alimentaire anti-inflammatoire retarde l’apparition précoce de la colite, tandis que les effets protecteurs ne sont que marginaux à des moments ultérieurs. L’intervention diététique peut également prévenir l’augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale induite par le DSS, ainsi que le raccourcissement de la longueur du côlon.

La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des tissus distaux du côlon distal inclus dans la paraffine révèle que les échantillons de contrôle présentent une morphologie normale, tandis que les animaux traités par DSS présentent les signes typiques de colite. Il convient de noter que le traitement parallèle avec une supplémentation alimentaire atténue clairement les changements morphologiques induits par la colite avec une morphologie globale similaire à celle du groupe témoin. La coloration par immunofluorescence du tissu distal du côlon indique également que les molécules de jonction étanches sont internalisées lors de la colite induite par le DSS et que la co-localisation de ces protéines est partiellement perdue aux contacts des cellules épithéliales cryptiques.

Il est important de noter que cette internalisation est réduite lorsque les souris traitées au DSS reçoivent le supplément alimentaire anti-inflammatoire et antioxydant. De plus, le recrutement robuste de neutrophiles dans le côlon en réponse à la colite induite par le DSS est contrecarré par une supplémentation alimentaire, ce qui entraîne une amélioration concomitante du stress oxydatif induit par les neutrophiles et une légère réduction de la production de cytokines inflammatoires. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que les mesures de la chambre suintante peuvent être effectuées pour analyser la résistance électrique de la barrière épithéliale dans le côlon.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur la colite et de l’exploration du mécanisme moléculaire de la pathogenèse de la colite ulcéreuse dans un modèle murin reproductible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser le développement de la colite et les effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions de la barrière épithéliale intestinale. N’oubliez pas que travailler avec des animaux vivants nécessite le respect de normes éthiques élevées pour éviter des souffrances inutiles.