Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

L'objectif général de cette expérience est d'activer physiologiquement l'autophagie chez la souris par une course forcée ou volontaire, puis de mesurer les niveaux d'autophagie dans des tissus spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l'autophagie, en particulier sur la manière dont l'autophagie et son activation contribuent aux effets bénéfiques induits par l'exercice aérobie. Le principal avantage de cette technique est que l'exercice physique constitue un moyen rapide de moduler l'autophagie in vivo chez la souris.

Pour cette expérience, commencez avec des souris C57 black six âgées de huit à douze semaines, porteuses d'un transgène permettant de détecter l'autophagie induite par l'exercice in vivo, connu sous le nom de GFP-LC3. Pour plus de détails sur l'utilisation des tapis roulants pour souris, consultez la publication JoVE suivante. Réglez le stimulus électrique du tapis roulant sur une intensité faible.

Acclimatez les souris à un tapis roulant ouvert incliné à dix degrés lors de leurs deux premières séances. Le premier jour, faites courir les souris pendant cinq minutes à une vitesse de huit mètres par minute. Le deuxième jour, faites-les courir pendant dix minutes, initialement à huit mètres par minute, puis augmentez progressivement la vitesse à dix mètres par minute après cinq minutes.

Le troisième jour, faites courir les souris pendant 90 minutes complètes. Commencez le tapis roulant à dix mètres par minute et encouragez les souris à courir à l’aide de légères pressions pour éviter les chocs électriques répétés. Il est essentiel d’observer et de manipuler les souris afin qu’elles ne reçoivent pas trop de chocs électriques pendant la course de 90 minutes.

Pendant toute la durée de l'essai, utilisez vos doigts pour encourager les souris à rester sur le tapis roulant. Après 40 minutes, augmentez la vitesse d'un mètre par minute. Après 50 minutes, augmentez à nouveau la vitesse d'un mètre par minute.

Après 60 minutes, augmentez la vitesse d'un mètre par minute supplémentaire. Après 70 minutes, commencez à augmenter la vitesse toutes les cinq minutes, de sorte que les dernières cinq minutes de la course de 90 minutes atteignent 17 mètres par minute. À la fin de l'essai, euthanasiez immédiatement les souris pour la collecte des tissus, si souhaité.

Pour ce test, loger les souris individuellement. Utiliser la même souche que celle décrite précédemment. Préparer une roue pour souris de 11,4 centimètres de diamètre équipée d’un odomètre de vélo.

Chaque rotation doit mesurer 358 millimètres de parcours. Placer la souris dans la cage contenant la roue et laisser la souris l'utiliser librement pendant deux semaines. Toutes les 24 heures, noter la distance parcourue par la souris sur l'odomètre.

Après les deux semaines, récoltez les tissus selon les besoins pour analyse. Pour mesurer le flux autophagique, traitez les souris avec l'inhibiteur d'autophagie, la chloroquine, pendant trois jours. Dissolvez la chloroquine dans du PBS à cinq milligrammes par millilitre et injectez-la aux souris par voie intrapéritonéale à une dose de 50 microgrammes par gramme.

Administrer aux souris une injection par jour pendant trois jours consécutifs et prélever les tissus trois heures après la dernière injection. Chez les souris soumises à l'exercice sur tapis roulant, commencer la course de 90 minutes 90 minutes après l'injection du troisième jour, de sorte que la course se termine trois heures après l'injection. Ensuite, euthanasier les souris et prélever immédiatement leurs tissus.

Préparez-vous à perfuser un animal dans les 90 minutes suivant l'exercice en préparant le fixateur. Chargez une seringue de 30 millilitres avec 15 à 20 millilitres de paraformaldéhyde à quatre pour cent fraîchement préparé et reliez la seringue à une aiguille cathéter de 20 gauge. Fixez la seringue chargée sur une pompe et réglez-la sur un débit continu de 90 millilitres par heure.

Avec l'animal placé sur une surface de travail propre, en position dorsale, ouvrez la cavité thoracique par le diaphragme afin d'exposer le cœur. Insérez ensuite l'aiguille du cathéter dans le ventricule droit. Ensuite, pratiquez une petite incision sur le foie pour drainer le sang et démarrez la pompe.

Injecter le fixateur jusqu'à ce que le poumon et le foie deviennent complètement pâles. Généralement, 15 millilitres de fixateur suffisent. Après la perfusion, retirer l'aiguille et prélever les tissus d'intérêt.

Pour prélever le muscle squelettique, disséquez le vaste latéral. Tirez brièvement la peau de la jambe vers l'arrière afin d'exposer les muscles et de localiser le quadriceps fémoral. Ensuite, disséquez le vaste latéral, qui correspond au muscle externe attaché à la partie supérieure de l'os fémoral.

Pour une fixation et une déshydratation supplémentaires, placez les tissus récoltés dans du paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, transférez les tissus dans du PBS contenant 15 pour cent de saccharose et laissez-les tremper à quatre degrés Celsius toute la nuit ou jusqu'à ce qu'ils aient coulé dans la solution. Ensuite, transférez les tissus dans du PBS contenant 30 pour cent de saccharose à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit ou plus longtemps.

Gardez les tissus à l’abri de la lumière autant que possible pendant ces bains. Ensuite, placez les tissus dans un milieu d’incorporation tel que l’OCT et coupez-les en morceaux plus petits si nécessaire. Puis, laissez-les s’acclimater pendant quelques minutes dans une petite boîte de Pétri.

Ensuite, transférez-les dans des moules à cryo inclus dans suffisamment de OCT pour les recouvrir. Dans les moules, orientez les surfaces de sectionnement vers le bas et évitez la formation de bulles. Puis, congélez les échantillons dans un récipient isolé rempli de glace sèche jusqu'à ce que le OCT devienne blanc.

À présent, enveloppez chaque échantillon dans du papier d’aluminium étiqueté, placez-les dans un sac en plastique hermétique et conservez-les à moins 80 degrés celsius jusqu’à leur traitement. En utilisant LC3 marquée par la GFP comme système rapporteur, l’induction de l’autophagie a été observée chez des souris ayant effectué l’exercice décrit. Après la stimulation de l’autophagie, LC3 s’est transloquée du cytosol vers l’autophagosome en formant des structures ponctuelles.

Les souris ayant fait de l'exercice présentaient beaucoup plus de points fluorescents GFP-LC3 à la fois dans le muscle squelettique et dans le cortex cérébral par rapport aux souris au repos. Une analyse par immunobuvardage utilisant un anticorps anti-LC3 a montré que l'exercice induisait significativement la formation de LC3-II conjuguée aux lipides, suggérant une augmentation de la conversion de la LC3-I cytosolique en LC3-II. Ensuite, la dégradation du récepteur de cargaison autophagique, p62, a été mesurée.

Quatre-vingt-dix minutes d'activité sur tapis roulant ont provoqué une dégradation plus importante de la protéine p62 dans le muscle squelettique par rapport à la condition de repos. Cet effet a été annulé par une injection de chloroquine avant l'exercice. Étant donné que la chloroquine est un inhibiteur de la dégradation lysosomale, ces données indiquent que le phénomène observé est dû à un flux autophagique accru plutôt qu'à un blocage de la dégradation des autophagosomes.

Après son développement, cette technique a eu des précurseurs dans le domaine de l'autophagie afin d'explorer les effets du mécanisme de l'exercice sur la dégradation du métabolisme et les comportements animaux. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller les souris pendant qu'elles courent. Après cette procédure, interviennent des méthodes telles que la microscopie électronique.

La microscopie animale peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'exercice dans des voies de l'autophagie sélectionnée, telles que la mitophagie et la lipophagie.