Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

l'activation Autophagie est bénéfique dans la prévention d'un certain nombre de maladies. L' une des approches physiologiques pour induire autophagy in vivo est un exercice physique. Ici, nous montrons comment activer l'autophagie par l'exercice aérobie et de mesurer les niveaux de l'autophagie chez les souris.

L’objectif global de cette expérience est d’activer physiologiquement l’autophagie chez la souris par une course forcée ou volontaire, puis de mesurer les niveaux d’autophagie dans des tissus spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’autophagie, en particulier sur la façon dont l’autophagie et l’action contribuent aux effets bénéfiques médiés par l’exercice aérobique. Le principal avantage de cette technique est que l’exercice physique est un balancement aérobie rapide entre l’autophagie in vivo à l’aide de souris.

Pour cette expérience, commencez avec des souris C57 black six âgées de huit à douze semaines, hébergeant un gène trans pour détecter l’autophagie induite par l’exercice in vivo, connue sous le nom de GFP-LC3. Pour plus de détails sur l’utilisation des tapis roulants de souris, consultez la publication JoVE suivante. Réglez le stimulus électrique du tapis roulant sur une faible intensité.

Lors de leurs deux premières séances, acclimatez les souris à un tapis roulant ouvert en montée de dix degrés. Le premier jour, exercez les souris pendant cinq minutes avec le tapis roulant fonctionnant à huit mètres par minute. Le deuxième jour, faites fonctionner les souris pendant dix minutes, d’abord à huit mètres par minute, et après cinq minutes, augmentez la vitesse à dix mètres par minute.

Le troisième jour, faites fonctionner les souris pendant 90 minutes complètes. Démarrez le tapis roulant à dix mètres par minute et encouragez les souris à courir en utilisant de légers coups de pouce pour éviter les chocs répétés du pied. Il est essentiel d’observer et de manipuler les souris afin qu’elles ne reçoivent pas trop de chocs électriques pendant les 90 minutes de course.

Tout au long de la course, utilisez vos doigts pour encourager les souris à rester sur le tapis roulant. Après 40 minutes, 6augmentez la vitesse d’un mètre par minute. Après 50 minutes, augmentez à nouveau la vitesse d’un mètre par minute.

Après 60 minutes, augmentez la vitesse d’un mètre par minute. Après 70 minutes, commencez à augmenter la vitesse toutes les cinq minutes de sorte que les cinq dernières minutes de la course de 90 minutes soient de 17 mètres par minute. Après la fin de l’essai, euthanasiez immédiatement les souris pour la collecte de tissus si vous le souhaitez.

Pour ce test, hébergez les souris individuellement. Utilisez la même souche que celle décrite précédemment. Préparez une roue de course de souris de 11,4 centimètres de diamètre avec un compteur kilométrique de vélo attaché.

Chaque rotation doit mesurer 358 millimètres de course. Déplacez la souris dans la cage contenant la molette et laissez-la l’utiliser librement pendant deux semaines. Toutes les 24 heures, enregistrez la distance parcourue par la souris à partir du compteur kilométrique.

Après les deux semaines, prélever les tissus pour analyse au besoin. Pour mesurer le flux autophagique, traitez les souris avec l’inhibiteur de l’autophagie, la chloroquine, pendant trois jours. Dissoudre la chloroquine dans du PBS à raison de cinq milligrammes par millilitre et l’injecter chez la souris par voie intrapéritonéale à la dose de 50 microgrammes par gramme.

Donnez aux souris une injection par jour pendant trois jours consécutifs et prélevez des tissus trois heures après la dernière injection. Pour les souris exercées sur tapis roulant, commencez la course de 90 minutes 90 minutes après l’injection le troisième jour afin que la course se termine trois heures après l’injection. Ensuite, euthanasiez les souris et récoltez immédiatement leurs tissus.

Préparez-vous à profuser un animal dans les 90 minutes suivant l’exercice en préparant le fixateur. Chargez une seringue de 30 millilitres avec 15 à 20 millilitres de paraformaldéhyde à quatre pour cent fraîchement préparé et connectez la seringue avec une aiguille de cathéter de calibre 20. Fixez le pousse-seringue chargé et réglez-le à 90 millilitres par heure de débit continu.

Avec l’animal sur une surface de travail propre, en position couchée, ouvrez la cavité thoracique à travers le diaphragme pour exposer le cœur. Maintenant, insérez l’aiguille du cathéter dans le ventricule droit. Ensuite, faites une petite incision sur le foie pour drainer le sang et démarrer la pompe.

Injectez le fixateur jusqu’à ce que les poumons et le foie deviennent complètement pâles. Habituellement, 15 millilitres de fixateur suffisent. Après la profusion, retirez l’aiguille et prélevez les tissus d’intérêt.

Pour collecter le muscle squelettique, disséquez le vaste latéral. Tirez brièvement la peau de la jambe vers l’arrière pour exposer les muscles et localiser le quadriceps fémoral. Ensuite, disséquez le vaste latéral, qui est le muscle externe attaché à la partie supérieure de l’os fémoral.

Pour une fixation et une déshydratation supplémentaires, placez les tissus récoltés dans quatre pour cent de paraformaldéhyde pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez les tissus à 15 pour cent de PBS de saccharose et laissez-les tremper à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’ils se soient installés dans la solution. Ensuite, transférez les tissus à 30 pour cent de PBS de saccharose à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou plus.

Gardez les mouchoirs dans l’obscurité autant que possible pendant ces bains. Ensuite, placez les tissus dans un milieu d’enrobage tel que l’OCT et coupez-les en petits morceaux si nécessaire. Ensuite, laissez-les s’acclimater quelques minutes dans une petite boîte de Pétri.

Ensuite, transférez-les dans des cryomoules avec suffisamment d’OCT pour couvrir. Dans les moules, orientez les surfaces de sectionnement vers le bas et évitez de former des bulles. Ensuite, congelez les échantillons dans une glacière en mousse couverte remplie de glace sèche jusqu’à ce que l’OCT devienne blanc.

Maintenant, enveloppez les échantillons individuels dans des feuilles étiquetées, scellez-les dans un sac en plastique et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils puissent être traités. En utilisant la GFP marquée LC3 comme système rapporteur, l’induction de l’autophagie a été observée chez les souris exercées comme décrit. Après stimulation par autophagie, LC3 se déplace du cytosol vers l’autophagosome dans des structures ponctuées.

Les souris exercées avaient beaucoup plus de points GFP-LC3 dans les muscles squelettiques et le cortex cérébral par rapport aux souris au repos. L’analyse par transfert Western à l’aide d’un anticorps LC3 a montré que l’exercice induisait de manière significative la génération de LC3-II conjugatif lipidique, suggérant qu’il y avait une conversion accrue de LC3-I cytosolique en LC3-II. Ensuite, la dégradation du récepteur de cargaison autophagique, p62, a été mesurée.

90 minutes d’activité sur tapis roulant ont provoqué une dégradation plus importante de P62 dans les muscles squelettiques que la condition de repos. Cet effet a été sauvé par une injection de chloroquine avant l’exercice. La chloroquine étant un inhibiteur de la dégradation lysosomale, ces données indiquent que les phénomènes observés sont dus à un flux autophogagique élevé plutôt qu’à un blocage de la dégradation des autophagosomes.

Après son développement, cette technique a eu des précurseurs dans le domaine de l’autophagie pour explorer les effets sur le mécanisme de l’exercice dans la dégradation du métabolisme et des comportements animaux. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de surveiller les souris pendant qu’elles courent. Après cette procédure, sont les méthodes comme la microscopie électrique.

La microscopie animale peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’exercice dans certaines voies d’autophagie, telles que la mitphagie et la lipophagie.