Name: , Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par limage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Découvrez la fabrication de réseaux microfluidiques vasculaires biomimétiques en 3D par dégradation laser guidée par l'image dans des hydrogels PEGDA. Cette méthode avancée permet de créer des modèles de tissus et des dispositifs sur puce haute densité.

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Les auteurs remercient le Dr Jeff Caplan et M. Michael Moore du Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center pour leur soutien en matière de microscopie confocale. L’accès à l’équipement de microscopie a été soutenu par les subventions d’instrumentation partagée des National Institutes of Health (NIH) (S10 RR0272773 et S10 OD016361) et le programme fédéral de subventions de recherche et développement de l’État du Delaware (16A00471). Cette recherche a été financée par des subventions de l’Institutional Development Award (IDeA) du National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), de l’American Cancer Society (14-251-07-IRG), de la Fondation de recherche de l’Université du Delaware (14A00778), de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas (CPRIT) (RR140013) et de la National Library of Medicine des NIH (4 R00 LM011390-02).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Critique en remplaçant les fonctions standard du logiciel de microscope pour permettre l&#39;utilisation de masques virtuels pour, la dégradation à base de laser guidée par l&#39;image, la macro microscope doit être installé et manipulé avec précaution. Comment les interfaces logicielles de microscope avec la macro microscope peuvent parfois être contre-intuitif, et beaucoup d&#39;efforts ont été investis dans la détermination des paramètres optimaux dans les deux programmes pour développer cette méthode. Une compréhension générale de balayage laser de base l&#39;utilisation du microscope confocal est recommandé, en particulier avec le &quot;Stage&quot; et les fenêtres &quot;Focus&quot; pour trouver et correctement le positionnement de l&#39;hydrogel dans les x, y et z dimensions, avant de tenter la dégradation à base de laser. En outre, la fabrication d&#39;un canal d&#39;entrée est critique pour le protocole; espèces fluorescentes suspendues doivent être en mesure d&#39;entrer dans les systèmes microfluidiques pour l&#39;imagerie et la caractérisation réussie du réseau. Il est important de noter que ce protocole applique à un particulier au lasermicroscope confocal à balayage configuré avec un laser à impulsions femtoseconde spécifique, exécutant des versions spécifiques du logiciel de microscope et la macro microscope (voir les détails dans la liste des matières spécifiques / Équipement). Nous avons découvert que les nouvelles versions de la macro microscope manque le contrôle et la fonctionnalité nécessaire nécessaire pour le contrôle de laser guidée par l&#39;image. Alors que d&#39;autres plates-formes de microscope et des sources laser à impulsions peuvent être utilisés, ce protocole spécifiquement applicable à ce système et devra être modifiée en fonction de la plate-forme, une source laser, et le logiciel mis en oeuvre. Les principes sous-jacents à travers ce protocole appliquent toujours, cependant. Une modification possible à ce protocole implique la modification de la composition d&#39;hydrogel. Ici, nous avons utilisé 5% en poids, 3,4 hydrogels kDa PEGDA, mais la dégradation à base de laser (à des fins en dehors de la génération du réseau microfluidique) a été mis en œuvre pour dégrader les deux hydrogels synthétiques et naturelles, y compris pégylé fibrine21,22 plasmine, protéine de soie hydrogels 23 et 24 du collagène. Réglage de la puissance du laser, la vitesse de balayage, l&#39;espacement entre les Z-tranches, et le nombre de répétitions aidera à déterminer les paramètres optimaux pour fabriquer des réseaux microfluidiques dans d&#39;autres formulations d&#39;hydrogel. Une limitation du courant de la technique est le volume global d&#39;hydrogel qui peut être dégradé dans une quantité de temps possible. Pour créer des vides ouverts ou des caractéristiques microfluidiques au sein de l&#39;hydrogel, le laser temps de séjour doit être égale ou supérieure à 8,96 ps / pixel (ou une vitesse de balayage laser de 0,021 um / uS) lorsque vous utilisez une fluence laser de 37,7 nJ / um 2. Avec ces paramètres, il faut 1,4 heures pour dégrader les vaisseaux dans un volume de 0,014 mm 3 (comme on le voit sur la figure 1). En utilisant un temps d&#39;arrêt du laser de 4,48 ps / pixel ou au-dessous, l&#39;énergie fournie ne suffit pas pour la dégradation totale de la formulation d&#39;hydrogel utilisé ici. La mise en œuvre d&#39;un hydrogel différentcomposition pourrait surmonter cette limitation. L&#39;utilisation de gels photolabiles qui contiennent des composants sensibles à la lumière 34-36 ou hydrogels qui ont un grand multiphotonique sections 21-24 sont de bonnes options qui permettraient d&#39;utiliser moins d&#39; énergie et se traduirait par une dégradation plus rapide. En ce qui concerne les limitations dimensionnelles, les caractéristiques ont été fabriquées jusqu&#39;à 1,5 mm de profondeur dans l&#39;hydrogel 7. L&#39;atteinte de la profondeur est fonction de la distance de travail de l&#39;objectif et peut être augmentée en utilisant des objectifs de la distance de travail ultra-longues optimisés pour l&#39; imagerie in vivo. Le canal le plus petit mesuré 7 créé en utilisant un 20X (NA1.0) objectif d&#39;immersion de l&#39; eau avait une largeur de 3,3 um et une profondeur de 8,9 um, ce qui est comparable à la taille des plus petits canaux générés dans la figure 1. Alors que d&#39; autres laboratoires ont utilisé des objectifs NA inférieurs 21,23,24, nous prévoyons que les réseaux microfluidiques avec de petites fonctionnalités peuvent être générées à l&#39; aide de hautobjectifs er NA au détriment d&#39;une distance de travail réduite. En fin de compte, cependant, la résolution de la technique est une fonction de la fonction d&#39;étalement de point du faisceau laser focalisé, les propriétés de balayage laser, la quantité d&#39;énergie délivrée par le laser, et les propriétés d&#39;absorption laser du matériau se dégradent. En outre, les propriétés laser (vitesse, fluence, l&#39;espacement entre les masques virtuels, et le nombre de répétitions) doivent être optimisées en fonction des propriétés d&#39;hydrogel (densité de réticulation, macromère / poids de monomère moléculaire, pour cent en poids, et le type d&#39;hydrogel: à base de protéines par rapport synthétique ), car ceux-ci intrinsèquement modifier les interactions avec le laser et donc la résolution ultime du processus. En tant que l&#39;énergie fournie est également influencée par l&#39;objectif utilisé, une optimisation supplémentaire est nécessaire lors de la commutation entre les objectifs. En ce qui concerne les coûts, l&#39;accès à un microscope avec un laser pulsé est nécessaire, et tandis que de nombreux différents objectives peuvent être utilisés, ceux qui ont une haute NA et longue distance de travail (pour l&#39; imagerie in vivo) peut être coûteux. Au- dessus et au - delà du protocole détaillé ici, les réseaux microfluidiques générés en utilisant cette technique peuvent également être fonctionnalisés avec des peptides de cellules-adhésif post-canal fabrication pour induire l&#39; adhérence des cellules endothéliales et la formation de lumière 7. En outre, l&#39;incorporation de séquences de peptides cellulaires dégradable dans le matériau en vrac avant 9 pour canaliser la dégradation pourrait permettre l&#39;étude de la migration des cellules dans et à travers l&#39;hydrogel. Pour la fluidification continue du réseau microfluidique au sein de l&#39;hydrogel, les hydrogels peuvent être photopolymérisées dans des dispositifs fluidiques ou des boîtiers plus importants, comme le montrent les figures 2 et 3 7. La génération de réseaux vasculaires par auto-assemblage vasculogenic ou angiogénique 8-12 fournit une approche simple pour induire vascularization à travers un volume relativement important d&#39;hydrogel. Bien que cette approche se traduit par des réseaux fluidiques irrigables, il est difficile de contrôler directement la taille, la tortuosité, la densité et l&#39;architecture globale du réseau. En raison de cette limitation, le profil d&#39;écoulement et les vitesses de cisaillement dans le système vasculaire peuvent varier entre les expériences. Alternativement, des techniques de microfabrication 13-16 permettent un contrôle direct sur l&#39; architecture du réseau , mais sont souvent limités par leur incapacité à générer des petits canaux, capillaires de taille ou la fabrication de réseaux denses qui imitent l&#39;architecture vasculaire in vivo. Alors que l&#39;hydrogel technique de dégradation à base de laser décrite ici a été récemment reconverti pour la génération microfluidique, il surmonte simultanément le contrôle architectural et les limites fondées sur la taille des méthodes de microfabrication existantes en permettant la création de réseaux microfluidiques biomimétiques 3D qui récapitulent la densité, la tortuosité, gamme de taille et architectur globalee du système vasculaire in vivo. En outre, de multiples réseaux fluidiques peuvent être générés dans un seul hydrogel, permettant l&#39;étude du transport inter-réseau 7. Pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire qui cherchent à répliquer plus étroitement dans les processus de transport in vivo in vitro, les réseaux microfluidiques hydrogel intégré à haute résolution présentées ici sont bien adaptés. Nous prévoyons que ce protocole sera utile dans le développement de constructions de tissu que le transport plus précisément mimique in vivo pour une utilisation en tant que dispositifs de dépistage de drogues et dans les modèles de la maladie in vitro.

Le système vasculaire, comprenant à la fois lymphatique et cardiovasculature, formes de réseaux très denses qui sont essentiels pour le transport des nutriments et de l&#39;oxygène et pour l&#39;élimination des déchets métaboliques. En conséquence, les cellules résidant dans les tissus vascularisés ne sont jamais plus de 50-100 um loin d&#39;un récipient 1. La capacité de se reproduire in vivo dans l&#39; architecture vasculaire in vitro est critique pour modéliser avec précision les processus de transport in vivo en utilisant des constructions artificielles. Avec un entraînement récent pour développer des dispositifs d&#39; organes sur une puce 2 pour haut débit médicament dépistage 3,4 et la modélisation des maladies 5,6, les méthodes pour créer des réseaux microfluidiques qui récapitulent le transport in vivo -comme dans des hydrogels synthétiques ou naturels sont le dessin un intérêt significatif. Pour améliorer la biomimétisme de microtissues utilisés dans ces dispositifs, nous avons développé une méthode de dégradation d&#39;hydrogel à base de laser guidée par l&#39;image qui utilise trois dimensional &#39; image (3D) des piles de vascularisation native en tant que modèles pour générer des réseaux microfluidiques vasculaires dérivés intégrés dans PEGDA hydrogels 7. Ce protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un laser à balayage confocal microscope disponibles dans le commerce équipé d&#39;un laser à impulsions femtoseconde pour fabriquer des réseaux microfluidiques biomimétiques vasculaires dérivées dans des hydrogels PEGDA par dégradation à base de laser guidée par l&#39;image. Les approches actuelles pour fluidiser hydrogels comprennent l&#39;induction de vasculogenic 8-10 ou 10-12 techniques cellules endothéliales d&#39; auto-assemblage et de microfabrication angiogéniques pour créer des canaux pré-définis pour endothélialisation 13-16. Bien que les réseaux auto-assemblées récapitulent la densité et de l&#39; architecture complexe du système microvasculaire, ils sont souvent plus perméables que les réseaux 11,17,18 in vivo, ce qui peut être problématique dans le transport de modélisation pour des applications de criblage de médicaments. Réseaux auto-assemblés sont constitués de physiologie dematiquement pertinentes, les vaisseaux capillaires de taille, mais ils peuvent être difficiles à intégrer à l&#39;écoulement du fluide en vrac en raison des limitations de générer de plus grands navires de artériole taille. Comme il n&#39;y a pas de contrôle direct sur l&#39;ensemble de ces réseaux, l&#39;architecture finale peut varier d&#39;un échantillon à, ce qui rend difficile de produire de façon répétée des réseaux avec les mêmes propriétés d&#39;écoulement et de transport de fluides. Pour générer 3D, réseaux microfluidiques hydrogel embarqué à géométrie répétitive et une architecture bien définie, un certain nombre de techniques de microfabrication ont été développées, y compris l&#39; assemblage modulaire 13, l&#39; impression 3D de matériaux sacrificiels 16, assemblage écriture directe 14, et l&#39; impression omnidirectionnelle 15. L&#39;application de ces méthodes, l&#39;architecture microfluidique, et les propriétés d&#39;écoulement et de transport de fluide donc, peut être fabriqué de façon répétée à travers de nombreuses constructions. Une limitation importante de ces méthodes, cependant, est l&#39;incapacité de créer microfréseaux luidic avec des caractéristiques capillaires moyenne, 4 à 10 um 19. La plupart des techniques de microfabrication sont souvent limitées à des fonctionnalités allant de 150 à 650 um de diamètre 13,16. Certaines techniques existantes sont capables de générer des réseaux hiérarchiques avec des canaux à travers une large plage de diamètres de 10 à 300 um pour le montage direct-écriture 14, et 18 à 600 um pour l&#39; impression omnidirectionnelle 15, mais ils sont limités dans leur capacité à générer des réseaux denses ou pour produire de multiples réseaux microfluidiques à proximité dans un seul construction 7. Pour surmonter certaines de ces limitations, nous avons développé une technique de dégradation d&#39;hydrogel à base de laser guidée par l&#39; image qui permet la fabrication reproductible de biomimétique, réseaux microfluidiques hiérarchiques qui récapitulent l&#39;architecture microvasculaire in vivo. Pour ce faire, un 790 nm, 140 femtoseconde (fs) laser pulsé fonctionnant à 80 MHz est raster scannée in emplacements 3D désirée à l&#39; intérieur d&#39; un hydrogel tel que défini par les images de la vascularisation in vivo. Nous pensons que le processus de dégradation fonctionne grâce à la décomposition induite par laser optique de l&#39; eau, la formation du plasma qui en résulte, l&#39;expansion rapide thermoélastique subséquente de l&#39; eau et de la dégradation locale de l&#39;hydrogel que l&#39;eau se dilate 20. Ce mécanisme varie légèrement d&#39; une dégradation à base de laser d&#39;hydrogels à base de protéines 21-24. A la différence PEGDA, qui a une section transversale multiphotonique bas, les protéines ont souvent une grande section transversale multiphotonique et sont donc dégradées par l&#39; intermédiaire d&#39; une absorption multiphotonique induite par bris chimique 23. Pour générer des réseaux microfluidiques guidée par l&#39; image, l&#39;obturateur laser est contrôlé par des masques virtuels images dérivées, qui sont constitués d&#39;une mosaïque de régions d&#39;intérêt 9 qui définissent l&#39;architecture microfluidique. En utilisant cette approche, nous avons démontré la capacité de fabriquer des microfluidique biomimétique 3D vasculaire dérivéles réseaux de circuits intégrés, ce qui récapitulent l&#39;architecture dense et tortueuse du système vasculaire in vivo, afin de contrôler localement la porosité des hydrogels en modifiant la quantité d&#39;énergie délivrée au cours de la dégradation. Nous avons également été en mesure de générer deux réseaux microfluidiques indépendants qui entrelacent à proximité (15 um) , mais ne se connectent jamais directement 7. Nous avons également démontré la capacité de endothélialiser microcanaux laser dégradé par la poste dégradation fonctionnalisation avec la séquence peptidique de l&#39; intégrine ligaturer, Arginine-glycine-acide aspartique-sérine (RGDS) pour favoriser l&#39; adhérence des cellules endotheliales et la formation de la lumière 7. Avec ce protocole, la génération de réseaux microfluidiques complexes hydrogels PEGDA est rendue possible par l&#39;intermédiaire, la dégradation à base de laser guidée par l&#39;image à l&#39;aide d&#39;un microscope disponible dans le commerce accessible sur de nombreux campus universitaires. Comme le processus de dégradation est guidé par des masques virtuels numériques, ce fabricaTechnique tion se prête à la conception des réseaux de création microfluidique, permettant son utilisation dans une large variété d&#39;applications. Nous prévoyons que la méthode décrite ici sera la plus avantageuse dans la conception de dispositifs nisations et humains-on-a-chip biomimétiques capables de reproduire les processus de transport biologiques importants dans la modélisation drogues transport 2. Cette technique de fabrication peut également être intéressant pour la génération des modèles in vitro de maladies, y compris les métastases du cancer et des modèles de 5,6 barrière hémato-encéphalique 25. Comme la dégradation d&#39;hydrogel à base de laser a déjà été utilisé pour créer des pistes pour la direction de l&#39; excroissance neuronale 21-23, l&#39;extension de cette technique guidée par l&#39; image pourrait se révéler utile dans les stratégies d&#39;ingénierie tissulaire avancées pour positionner les cellules dans des arrangements spatiaux 3D définis par l&#39; utilisateur.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>nommé « logiciel de programmation » dans le protocole ; reportez-vous à la source 9 pour plus de détails sur l’algorithme</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>version 1.51a</td><td>nommé « logiciel de traitement d’images » dans le protocole</td></tr><tr><td>LSM 780 Microscope confocal</td><td>Zeiss</td> nommé « microscope confocal à balayage laser » dans le <td></td><td>protocole ; pour l’hydrogel à base de laser </td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>version 6.0</td><td>nommé « logiciel de microscope » dans le protocole ; pour une utilisation sur Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>nommé « macro microscope » dans le protocole ; pour une utilisation sur Zeiss LSM-780 (en conjonction avec Zen)</td></tr><tr><td>Objectif W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>pour une utilisation sur Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti :S</td><td>Laser Coherent</td><td></td><td>nommé « laser pulsé haute puissance » dans le protocole</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich S5886-1KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Triéthanolamine (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>inflammable ; irritant pour la peau et les yeux ; travailler avec dans une hotte</td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Gobelets de filtration sous vide avec 0,2 &micro ; m Membrane PES</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>synthétisé en interne</td><td></td><td>se référer à la source 33 pour les méthodes de synthèse ; stocker sous argon</td></tr><tr><td>Sel isosodique Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>stocker sous argon ; cancérigène ; travailler avec dans une hotte</td></tr><tr><td>3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>Support</td><td>FLX000620</td><td>pour la manipulation de ruban adhésif double face</td></tr><tr><td>Modèle SC Plotter (coupe-adhésif)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>utilisé pour couper l’adhésif en forme d’anneau pour relier les lamelles de Petri aux boîtes de Pétri</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 60 mm avec trou de 20 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur à haute intensité (source de lumière blanche)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Power Meter</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>détecte la puissance à 524 nm lors de l’utilisation d’une source de lumière blanche</td></tr><tr><td>Slim Profile Wand Detector</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>pour une utilisation avec le wattmètre</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>utilisé pour fabriquer des moules PDMS ; reportez-vous à la source 7 pour les méthodes</td></tr><tr><td>TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round</td><td>synthétisé en interne</td><td></td><td>se référer à la source 7 pour les méthodes</td></tr><tr><td>Dextran, Fluorescéine, 2 000 000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>peut utiliser d’autres dextrans étiquetés ; 2 000 kDa ne se diffusent pas facilement dans un hydrogel PEGDA à 5 % 3,4 kDa</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc, 0,2 & micro ; m Supor Membrane, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI0.4&nbsp ; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>Dispositifs microfluidiques pouvant être utilisés pour loger des hydrogels</td></tr></tbody></table>

, fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Ce protocole décrit en détail la mise en oeuvre guidée par l&#39;image, la dégradation d&#39;hydrogel à base de laser pour la fabrication de réseaux vasculaires microfluidiques dérivé incorporés dans les hydrogels PEGDA. Ici, nous décrivons la création de masques virtuels qui permettent un contrôle laser guidée par l&#39;image; la photopolymérisation d&#39;un hydrogel PEGDA micromolded, propres à la fabrication de réseau microfluidique et le flux de tête commandé par la pression; la configuration et l&#39;utilisation d&#39;un microscope à balayage laser confocal disponible dans le commerce associé à un pulsé Ti femtoseconde: laser S pour induire la dégradation d&#39;hydrogel; et l&#39;imagerie des réseaux microfluidiques fabriqués en utilisant des espèces fluorescentes et la microscopie confocale. Une grande partie du protocole est axé sur la bonne configuration et la mise en œuvre du logiciel de microscope et microscope macro, car ce sont des étapes cruciales dans l&#39;aide d&#39;un microscope commercial à des fins de fabrication microfluidiques qui contiennent un certain nombre de subtilités. La composante guidée par l&#39;image de cette technique permet la mise en œuvre de 3D piles d&#39;images ou de modèles 3D générés par les utilisateurs, ce qui permet pour la conception créative et microfluidique pour la fabrication de systèmes microfluidiques complexes de pratiquement toutes les configurations. Avec un impact attendu dans l&#39;ingénierie tissulaire, les méthodes décrites dans ce protocole pourraient aider à la fabrication de pointe constructions Microbroyeur biomimétiques pour les appareils nisations et humains-on-a-chip. En mimant le complexe l&#39; architecture, la tortuosité, la taille et la densité de la vascularisation in vivo, des processus de transport biologiques essentiels peuvent être reproduits dans ces constructions, ce qui conduit à une modélisation plus précise in vitro des propriétés pharmacocinétiques de la drogue et des maladies.

Pour démontrer la mise en œuvre guidée par l&#39; image, la dégradation d&#39;hydrogel à base de laser pour générer un réseau microfluidique 3D, dérivé vasculaire, nous avons utilisé une pile d&#39;images 3D du cerveau de souris vasculature qui a été acquis par l&#39; intermédiaire de microscopie à balayage de couteau tranchant (KESM) 26, 27 . Une région sélectionnée en 3D de la grande microvasculaire ensemble de données a été convertie en une série de masques virtuels pour la formation d&#39;un réseau microfluidique guidée par l&#39;image, comme décrit ci-dessus. Après la fabrication, le réseau microfluidique résultant a été perfusé avec une solution de FITC, 2000 kDa dextrane et imagée par microscopie confocale. La pile d&#39;images du système vasculaire in vivo qui définit l&#39;architecture de réseau (figure 1A et C) et le réseau microfluidique fabriqué (Figure 1 B et D) ont été utilisés pour générer Z-projections (figures 1A et B) et rendus 3D (figure 1c et ré </strong&gt;). La comparaison des images montre que guidée par l&#39; image, la dégradation d&#39;hydrogel à base de laser permet la fabrication de réseaux microfluidiques biomimétiques 3D qui récapitulent la taille, la tortuosité, et de l&#39; architecture complexe de la vascularisation in vivo. La technique se prête à la fabrication de réseaux contenant une large gamme de diamètres; au sein de la figure 1, les canaux allant de 3,3 à 28,8 um de diamètre ont été générés. Notez que la structure rectangulaire plus grande dans la partie supérieure gauche de la figure 1B et dans le coin gauche de la figure 1D est le canal d&#39;entrée pour introduire le flux dans le réseau. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Figure 1: Vascular-Derived microfluidique réseau. Une série de masques virtuels, provenant d&#39;une pile d&#39;images du système vasculaire du cerveau de souris (A et C), ont été utilisés pour fabricate un réseau microfluidique biomimétique 3D incorporé dans un hydrogel PEGDA (B et D) par l&#39; intermédiaire de la dégradation à base de laser guidée par l&#39; image. Le réseau microfluidique a été perfusée avec du dextrane 2000 kDa marquée par FITC et imagée par microscopie confocale. Z-projections (A et B) et des rendus 3D (C et D) des deux réseaux démontrent la capacité de générer des réseaux microfluidiques qui récapitulent la densité, l&#39; organisation et l&#39; architecture globale de la vascularisation in vivo. La flèche (D) marque l&#39;entrée rectangulaire créé pour introduire le dextran. La barre d&#39;échelle représente 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Nous avons mis en œuvre deux méthodes, des têtes de pression et des pompes à seringues, pour lancer le fluide ffaible dans ces réseaux microfluidiques embarqués. Par exemple, un canal rectangulaire 30 de 30 um a été fabriqué pour connecter deux puits dans un hydrogel PEGDA micromolded (figure 2A), avec l&#39; écoulement du fluide entraîné par l&#39; intermédiaire d&#39; une tête de pression 7. Généré dans le puits à gauche, la tête de pression induite écoulement à travers le canal et dans le puits sur la droite. Dans la figure 2A, un front initial de tétraméthylrhodamine (TRITC) marqué à 70 kDa dextran a été observée en mouvement à travers le canal en utilisant la microscopie time-lapse. Plus tard, dans la figure 2B, un diamètre de 10 um polystyrène fluorescent sphère coulait du puits à gauche, à travers le canal, pour le bien sur la droite. Avec la durée du débit contrôlé par le volume de fluide présent dans le puits micromolded à l&#39;entrée, et le débit contrôlé par le gradient hydrostatique généré entre l&#39;entrée et de sortie ainsi, le flux de tête commandé par la pression dans hydrogels micromolded fournit une méthode simple pour l&#39;écoulement dansla production, sans la nécessité d&#39;un boîtier externe ou une pompe à seringue. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Figure 2: Pression Débit de Head-Driven dans un Micromolded PEGDA Hydrogel. PEGDA a été micromolded pour former un hydrogel contenant deux puits reliés par un micro-canal intégré. Une tête de pression a été générée dans le puits à gauche pour amorcer l&#39; écoulement du TRITC marqué, 70 kDa dextran (A1-A3) et un polystyrène sphère de 10 pm (B1-B3) à travers un canal rectangulaire 30 de 30 um d&#39;un puits à la autre. La barre d&#39;échelle représente 50 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Sinon, pour générer un flux constant de fluide au sein des réseaux microfluidiques, pompe à seringue fbas peut être initiée par photopolymérisation l&#39;hydrogel à l&#39;intérieur d&#39;un dispositif microfluidique secondaire avec des orifices d&#39;entrée et de sortie pour la pompe de seringue interfaçage. Sur la figure 3A, un dispositif microfluidique disponible dans le commerce, pré-fabriqué est représenté avec une bande de 1 mm d&#39;hydrogel photopolymérisé sur toute la largeur du dispositif 7. la dégradation basée au laser a été mis en œuvre pour fabriquer des réseaux et canaux microfluidiques en hydrogels logés en utilisant le même protocole décrit ici pour autoportant hydrogels. Débit de la pompe générée par la seringue peut être vu sur la figure 3B, où un canal cylindrique de diamètre de 20 um a été fabriqué dans un hydrogel logé dans un dispositif microfluidique. Dans ce canal 20 um de diamètre, individuellement 2 um fluorescentes sphères de polystyrène sont facilement résolus sans écoulement de fluide (figure 3B1), alors que lorsqu&#39;une 5 pi / s , le débit est appliquée, les sphères se déplacent dans le champ de vision, comme en témoignent les stries (figure 3B2 &lt;/ Strong&gt;). Cette même approche a été utilisée pour induire l&#39; écoulement à travers un réseau vasculaire dérivée 2D pour surveiller l&#39; écoulement du TRITC marqué, 65 kDa dextran à travers le réseau et la diffusion dans l&#39;hydrogel environnant (figure 3C). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Figure 3: Flow Syringe Pump-Driven dans PEGDA hydrogels polymérisé dans Caissons microfluidiques. Un dispositif disponible dans le commerce, préfabriqué microfluidique (A) avec un 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) microcanal loge un photopolymérisée 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hydrogel, indiqué par le flèche noire. Un canal cylindrique de diamètre de 20 um a été dégradé par l&#39;hydrogel et 2 um sphères de polystyrène ont été pompés à travers le dispositif (B). Les sphères sont clairement résolues sans écoulement de fluide (B1), mais ils apparaissent sous forme de stries à un débit de 5 pl / s(B2). Dans un autre hydrogel logé un réseau 2D vasculaire dérivé a été fabriqué et TRITC marqué au 65 kDa dextran a été pompée à travers le réseau (C). La microscopie time-lapse a été utilisé pour surveiller le dextran fluorescent tel qu&#39;il remplit les canaux et diffuse dans l&#39;hydrogel environnants. Les flèches blanches dans (B) et (C) indiquent le sens d&#39;écoulement du fluide. La barre d&#39;étalonnage (C) indique l&#39;intensité du dextran fluorescent. Les barres d&#39;échelle représentent 20 um (B1) et (B2) et 50 um (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ce protocole décrit la mise en œuvre de la dégradation de l’hydrogel guidée par l’image, basée sur le laser, pour fabriquer des réseaux microfluidiques biomimétiques dérivés de vaisseaux intégrés dans des hydrogels de poly(éthylène glycol) diacrylate (PEGDA). Ces systèmes microfluidiques biomimétiques peuvent être utiles pour les applications d’ingénierie tissulaire, la génération de modèles de maladies in vitro et la fabrication de dispositifs avancés « sur puce ».

, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire comment utiliser un microscope confocal équipé d'un laser à impulsions femtosecondes pour générer des réseaux microfluidiques biomimétiques tridimensionnels dérivés de vaisseaux sanguins, intégrés dans des hydrogels de diacrylate de polyéthylène glycol, grâce à une dégradation assistée par imagerie et basée sur le laser. Un avantage majeur de cette technique réside dans la capacité à produire des réseaux microfluidiques biomimétiques tridimensionnels qui reproduisent fidèlement la densité, la tortuosité, la gamme de tailles et l'architecture globale de la vascularisation in vivo au sein de constructions synthétiques. Cette approche de fabrication microfluidique permettra d'améliorer notre capacité à concevoir des constructions ingénierisées de tissus plus proches de l'in vivo, des modèles biomimétiques de maladies et des dispositifs sur puce à densité ultra-élevée.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la configuration et la mise en œuvre correctes du logiciel du microscope ne sont pas intuitives, mais sont cruciales pour former les réseaux microfluidiques souhaités. Plusieurs des étapes préparatoires sont décrites dans le protocole écrit, notamment la génération des masques virtuels, la configuration du microscope et le chargement des masques virtuels dans le logiciel du microscope. Pour photopolymériser l'hydrogel PEGDA, fixez d'abord un anneau d'adhésif double face sur une boîte de Pétri de 60 millimètres présentant un trou de 20 millimètres découpé au fond.Ensuite, dans une hotte, ajoutez un millilitre de HBS avec du TEOA dans un tube centrifuge brun de deux millilitres recouvert de papier d’aluminium. Puis, ajoutez 10 microlitres de sel disodique d’Eosine Y à une concentration de un millimolaire dans le tube. Prélevez maintenant un petit volume de NVP à l’aide d’une pipette en verre et versez-le dans un bécher en verre.À partir de ce volume, prélevez 3,5 microlitres de NVP et transférez-les dans le mélange. Ensuite, ajoutez 10 milligrammes de PEGDA de 3,4 kilodaltons dans un deuxième tube recouvert de papier aluminium. Puis, ajoutez 0,2 millilitre du mélange afin d'obtenir une solution prépolymère de PEGDA à 5 % poids par volume.Maintenant, vortexer la solution de prépolymère jusqu'à ce que le PEGDA soit complètement dissous. Ensuite, pipeter 60 microlitres sur un moule en PDMS sans introduire de bulles. Placez ensuite au centre une lame de verre acrylée de 40 millimètres, numéro 1,5, au-dessus de la solution, en l'alignant sur les entretoises en PDMS.Ensuite, placer l'assemblage sous une source de lumière blanche calibrée pour délivrer 95 milliwatts. Polymériser le polymère pendant trois minutes. Puis, faire circuler de l'eau distillée entre le moule et la lame de couverture afin de séparer l'hydrogel du PDMS et rincer l'hydrogel.Ensuite, séchez soigneusement les bords du coverslip sans absorber l'eau du gel hydrogel. Maintenant, fixez le coverslip sur la boîte de Pétri préparée. Une légère pression est utile.Ensuite, immergez l'hydrogel dans de l'eau distillée. Configurez le microscope confocal à balayage laser comme décrit dans le protocole textuel et démarrez la configuration de visualisation de l'hydrogel. Puis, insérez l'hydrogel et la boîte de Pétri dans le support de platine et placez-le sur la platine.Ensuite, remplissez la boîte de Pétri avec au moins cinq millilitres d'eau distillée et abaissez l'objectif à immersion dans l'eau juste au-dessus de l'hydrogel sans entrer en contact avec celui-ci. Activez maintenant la fonction « live » pour allumer la ligne laser à argon. Mettez ensuite au point sur l'hydrogel jusqu'à ce que le signal d'Eosine Y soit visible sur la face supérieure de l'hydrogel.Pour aider à localiser l'hydrogel, essayez d'augmenter temporairement le pourcentage de puissance ou la taille du diaphragme. Marquez les emplacements du haut et du bas de l'hydrogel, ainsi que celui du fond du puits. Utilisez ensuite le joystick pour vous déplacer transversalement et repérer les bords du puits.Dans la fenêtre de focalisation, abaissez le plan de mise au point de 150 micromètres à l'intérieur de l'hydrogel à l'aide de la flèche vers le bas située à côté de la case de position Z. L'étape suivante est cruciale. Réglez à zéro la position X et Y dans la fenêtre de la platine, puis supprimez toutes les autres positions marquées et ne marquez que la position remise à zéro.Maintenant, pour commencer le processus de formation d'un canal d'entrée, prenez d'abord une image, puis utilisez le bouton rectangle dans la fenêtre des régions pour délimiter la zone qui constituera l'entrée du réseau vasculaire. Ensuite, passez à la configuration de la formation du canal. Les détails sont fournis dans le protocole textuel.Une fois là, dans la fenêtre de pile Z, cliquez sur les boutons centraux en haut et au-dessus du décalage pour centrer la pile Z à la position actuelle. Ensuite, selon l'importance de l'orifice nécessaire, réglez le nombre de coupes avec un intervalle de un. Vérifiez maintenant que la vitesse est réglée sur trois et que le pourcentage de puissance est fixé à 100.Ensuite, procédez à l'enregistrement de la configuration et cliquez sur le bouton démarrer l'expérience. Pour visualiser l'hydrogel pendant la dégradation du canal, augmentez le gain principal dans la fenêtre des canaux si la région dans le champ de vision est noire, ou diminuez le gain principal si la région est blanche. Après la dégradation, assurez-vous que l'entrée a été formée en revenant à la configuration de visualisation de l'hydrogel et en cliquant sur direct.Tout d'abord, sous la fenêtre des régions, chargez n'importe quel fichier ovl à partir de la pile Z des masques virtuels et cliquez sur le bouton fléché pour afficher les régions d'intérêt (ROIs) dans le champ de vision. Ensuite, cliquez sur « live » pour analyser la configuration de visualisation de l'hydrogel et utilisez le joystick ou la fenêtre de la platine pour positionner l'hydrogel de sorte que l'entrée soit reliée à l'emplacement correct au sein du réseau vasculaire. Puis, abaissez le plan de focalisation jusqu'à la première position dans la macro du microscope, soit 50 micromètres en dessous de l'emplacement Z centralisé précédent, en utilisant la taille de pas dans la fenêtre de mise au point et en cliquant sur la flèche vers le bas.Encore une fois, il est essentiel de réinitialiser les positions X et Y à zéro, de supprimer toutes les autres positions marquées et de ne conserver que cette position comme nouveau point zéro. Veillez à enregistrer cette nouvelle configuration. Maintenant, dans la configuration de formation des canaux, sélectionnez uniquement les fenêtres de série temporelle et de photoblanchiment.Ensuite, ouvrez la macro et sélectionnez l'onglet d'enregistrement. Sélectionnez la recette créée précédemment et cliquez sur appliquer. Veillez à ne pas cliquer sur stocker, sinon la recette sera écrasée.Après avoir vérifié les paramètres, enregistrez à nouveau la configuration de formation des canaux, puis cliquez sur «&nbsp;mettre à jour&nbsp;» dans la macro du microscope. Cliquez sur «&nbsp;non&nbsp;» pour ne pas écraser la liste d'emplacements actuelle, puis cliquez sur «&nbsp;démarrer&nbsp;» dans la macro du microscope pour lancer la recette. Une fois le processus de dégradation terminé, utilisez la configuration de visualisation de l'hydrogel avec une puissance laser plus faible afin de visualiser le dextran marqué par la FITC, dont le signal est plus intense que le signal natif de l'éosine Y présente dans l'hydrogel.Avant d'introduire le dextran marqué par un fluorochrome, aspirez un peu d'eau du puits dans l'hydrogel. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de dextran marqué par la FITC filtrée. La procédure décrite a été utilisée pour convertir un grand volume d'images microvasculaires en une série de masques virtuels destinés à la formation de réseaux microfluidiques assistée par imagerie.Le réseau microfluidique obtenu a été comparé au réseau vasculaire in vivo dont il était dérivé. La dégradation de l'hydrogel assistée par image et basée sur un laser a permis la fabrication de réseaux microfluidiques biomimétiques en 3D qui reproduisent la taille, la tortuosité et l'architecture complexe du réseau vasculaire in vivo. Des différences de pression et des pompes à seringue ont été utilisées pour initier l'écoulement du fluide dans ces réseaux microfluidiques intégrés.Des dextranes marqués au fluorochrome de 70 kilodaltons et des billes de polystyrène de 10 micromètres ont été observés se déplaçant de gauche à droite sous l'effet d'un écoulement induit par une pression hydrostatique. Alternativement, un écoulement piloté par pompe à seringue a été initié en photopolymérisant un hydrogel à l'intérieur d'un second dispositif microfluidique. En utilisant le même protocole décrit ici, une dégradation par laser a ensuite été mise en œuvre pour fabriquer un réseau en 2D dérivé vasculaire dans un hydrogel logé, permettant un écoulement piloté par pompe à seringue et la perfusion de dextrane de 65 kilodaltons.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser un microscope confocal à balayage laser équipé d'un laser à impulsions femtosecondes pour générer des réseaux microfluidiques biomimétiques par dégradation du gel hydrophile guidée par image au laser. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que les paramètres du laser, notamment la puissance, la longueur d'onde et la vitesse de balayage, doivent être ajustés et optimisés en fonction de la formulation du gel hydrophile à dégrader.Merci et bonne chance avec vos expériences.

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, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l'image

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