, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l'image

L’objectif général de ce protocole est de décrire comment utiliser un microscope confocal équipé d’un laser à impulsions femtosecondes pour générer des réseaux microfluidiques biomimétiques tridimensionnels dérivés de vaisseaux vasculaires intégrés dans des hydrogels de diacrylate de polyéthylène glycol en utilisant une dégradation par laser guidée par image. Un avantage significatif de cette technique est la capacité de générer des réseaux microfluidiques biomimétiques tridimensionnels qui récapitulent avec précision la densité, la tortuosité, la gamme de tailles et l’architecture globale du système vasculaire in vivo dans les constructions synthétiques. Cette approche de fabrication microfluidique améliorera notre capacité à générer davantage de constructions in vivo, comme des constructions tissulaires, des modèles de maladies biomimétiques et des dispositifs à ultra haute densité sur puce.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la configuration et la mise en œuvre correctes du logiciel du microscope ne sont pas intuitives, mais sont cruciales pour former les réseaux microfluidiques souhaités. De nombreuses étapes préparatoires sont couvertes dans le protocole texte, notamment la génération des masques virtuels, la configuration du microscope et le téléchargement des masques virtuels dans le logiciel du microscope. Pour photopolymériser l’hydrogel PEGDA, fixez d’abord un anneau d’adhésif double face à une boîte de Pétri de 60 millimètres dont le fond est percé d’un trou de 20 millimètres.

Ensuite, dans une hotte, ajoutez un millilitre de HBS avec TEOA dans un tube à centrifuger ambré de deux millilitres recouvert d’une feuille d’aluminium. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’un sel isosodique d’Y millimolaire dans le tube. Maintenant, pipetez un petit volume de NVP dans un bécher en verre à l’aide d’une pipette en verre.

De ce volume, prélevez 3,5 microlitres de NVP et transférez-le dans le mélange. Ensuite, ajoutez 10 milligrammes de PEGDA de 3,4 kilodaltons dans un deuxième tube recouvert de papier d’aluminium. Ensuite, ajoutez 0,2 millilitre du mélange pour obtenir une solution de prépolymère PEGDA à 5 % en poids par volume.

Maintenant, faites tourbillonner la solution de prépolymère jusqu’à ce que le PEGDA soit complètement dissous. Ensuite, pipetez 60 microlitres sur un moule PDMS sans introduire de bulles. Maintenant, centrez une lamelle en verre acrylé de 40 millimètres numéro 1,5 sur la solution sur les entretoises PDMS.

Placez ensuite l’ensemble sous une source de lumière blanche calibrée pour délivrer 95 milliwatts. Faites durcir le polymère pendant trois minutes. Ensuite, faites couler de l’eau distillée entre le moule et la lamelle pour séparer l’hydrogel du PDMS et rincer l’hydrogel.

Ensuite, séchez soigneusement les bords de la lamelle sans évacuer l’eau de l’hydrogel. Maintenant, collez la lamelle sur la boîte de Pétri préparée. Un peu de pression aide.

Ensuite, immergez l’hydrogel dans de l’eau distillée. Configurez le microscope confocal à balayage laser comme décrit dans le protocole texte et commencez dans la configuration de visualisation de l’hydrogel. Ensuite, installez l’hydrogel et la boîte de Pétri sur l’insert de scène et placez-le sur la scène.

Ensuite, remplissez la boîte de Pétri avec au moins cinq millilitres d’eau distillée et abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau juste au-dessus de l’hydrogel sans entrer en contact avec lui. Maintenant, cliquez en direct pour activer la ligne laser à argon. Ensuite, concentrez-vous sur l’hydrogel jusqu’à ce que le signal Eosin Y soit visible sur la face supérieure de l’hydrogel.

Pour aider à trouver l’hydrogel, essayez d’augmenter temporairement le pourcentage de puissance ou la taille du sténopé. Marquez l’emplacement du haut et du bas de l’hydrogel, ainsi que du fond du puits. Utilisez ensuite le joystick pour vous déplacer transversalement et trouver les bords du puits.

Dans la fenêtre de mise au point, abaissez le plan de mise au point de 150 microns à l’intérieur de l’hydrogel à l’aide de la flèche vers le bas à côté de la case de position Z. La prochaine étape est cruciale. Mettez à zéro les emplacements X et Y dans la fenêtre de la scène, puis supprimez tous les autres emplacements marqués et marquez uniquement l’emplacement mis à zéro.

Maintenant, pour commencer le processus de formation d’un canal d’entrée, prenez d’abord une image, puis, à l’aide du bouton rectangle dans la fenêtre des régions, tracez le contour de la région qui sera l’entrée du réseau vasculaire. Passez ensuite à la configuration de formation de canal. Les détails sont fournis dans le protocole texte.

Une fois là-bas, dans une fenêtre de pile Z, cliquez sur les boutons centraux en haut et au-dessus du décalage pour centrer la pile Z à la position actuelle. Ensuite, en fonction de la taille de l’entrée, définissez le nombre de tranches avec un intervalle de un. Maintenant, vérifiez que la vitesse est réglée sur trois et que le pourcentage de puissance est réglé sur 100.

Procédez ensuite à l’enregistrement de la configuration et cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience. Pour visualiser l’hydrogel pendant la dégradation du canal, augmentez le gain principal dans la fenêtre des canaux si la région dans le champ de vision est noire, ou diminuez le gain principal si la région est blanche. Après la dégradation, assurez-vous que l’entrée a été formée en revenant à la configuration de visualisation de l’hydrogel et en cliquant sur en direct.

Tout d’abord, sous la fenêtre des régions, chargez n’importe quel fichier ovl à partir de la pile Z de masques virtuels et cliquez sur le bouton fléché pour voir les zones d’intérêt dans le champ de vision. Ensuite, cliquez sur en direct pour scanner la configuration de visualisation de l’hydrogel et utilisez le joystick ou la fenêtre de la platine pour positionner l’hydrogel de sorte que l’entrée se connecte au bon emplacement dans le réseau vasculaire. Ensuite, abaissez le plan de mise au point à la première position dans la macro du microscope qui se trouve à 50 microns par rapport à l’emplacement Z centré précédent à l’aide de la taille du pas dans la fenêtre de mise au point et en cliquant sur la flèche vers le bas.

Encore une fois, il est essentiel de remettre à zéro les emplacements X et Y, de supprimer tous les autres emplacements marqués et de ne marquer que cet emplacement comme nouveau point zéro. Veillez à enregistrer cette nouvelle configuration. Maintenant, sous la configuration de la formation du canal, sélectionnez uniquement les séries chronologiques et les fenêtres de blanchiment.

Ensuite, ouvrez la macro et sélectionnez l’onglet d’enregistrement. Sélectionnez la recette précédemment créée et cliquez sur Appliquer. Assurez-vous de ne pas cliquer sur Stocker, sinon la recette sera écrasée.

Après avoir vérifié les paramètres, enregistrez à nouveau la configuration de la formation du canal, puis cliquez sur Mettre à jour dans la macro du microscope. Cliquez sur non pour remplacer la liste des emplacements actuels, puis cliquez sur Démarrer dans la macro du microscope pour commencer la recette. Une fois le processus de dégradation terminé, utilisez la configuration de visualisation de l’hydrogel à une puissance laser plus faible pour permettre la visualisation du dextran marqué FITC, qui a un signal plus brillant que le signal natif Eosin Y de l’hydrogel.

Avant d’introduire le dextran marqué par fluorescence, évacuez un peu d’eau du puits dans l’hydrogel. Ensuite, pipetez 10 microlitres de dextran filtré marqué FITC. La procédure décrite a été utilisée pour convertir un grand volume d’images microvasculaires en une série de masques virtuels pour la formation d’un réseau microfluidique guidé par l’image.

Le réseau microfluidique résultant a été comparé au système vasculaire in vivo dont il était dérivé. La dégradation de l’hydrogel par laser guidée par l’image a permis la fabrication de réseaux microfluidiques biomimétiques 3D qui récapitulent la taille, la tortuosité et l’architecture complexe du système vasculaire in vivo. Des têtes de pression et des pousse-seringues ont tous deux été utilisés pour initier l’écoulement des fluides dans ces réseaux microfluidiques intégrés.

Des billes de dextran de 70 kilodaltons et de polystyrène de 10 microns marquées par fluorescence ont été observées se déplaçant de gauche à droite sous l’effet d’un écoulement induit par une charge de pression. Alternativement, l’écoulement entraîné par une pompe à seringue a été initié par photopolymérisation d’un hydrogel à l’intérieur d’un dispositif microfluidique secondaire. En utilisant le même protocole que celui décrit ici, la dégradation par laser a ensuite été mise en œuvre pour fabriquer un réseau dérivé vasculaire 2D dans un hydrogel hébergé pour un débit entraîné par une pompe à seringue et une profusion de 65 kilodaltons de dextran.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à impulsions femtosecondes pour générer des réseaux microfluidiques biomimétiques en utilisant la dégradation d’hydrogel par laser guidée par image. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les paramètres laser, y compris la puissance, la longueur d’onde et la vitesse de balayage, doivent être ajustés et optimisés en fonction de la formulation de l’hydrogel dégradée.

Merci et bonne chance dans vos expériences.