Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique

Le protocole suivant vise à montrer l’isolement d’un astrocytes primaire à partir du cerveau de rats chiots pour effectuer une privation d’oxygène et de glucose. L’exposition d’astrocytes purifiés à un environnement privé d’oxygène et de glucose est un module qui nous permet de tester la réaction à certaines des conditions trouvées dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques. Les changements méthodiques, après une exposition à une privation d’oxygène et de glucose, peuvent être observés et mesurés à l’aide de marqueurs astrocytaires sélectifs tels que la GFAP.

En résumé, ces cellules isolées exposées à des conditions de type ischémique peuvent être utilisées pour tester de nouvelles voies partielles activées dans des conditions hypoxiques et d’autres médicaments qui protègent contre l’AVC ischémique. Dans cette partie du protocole, les astrocytes seront isolés des cortex des rats. Le but de cette procédure est d’obtenir une culture de cellules astrocytaires primaires pour effectuer des expériences de privation d’oxygène et de glucose.

Les matériaux pour cette procédure sont les suivants : Autoclavez tous les matériaux avant de les utiliser dans cette procédure. Et exposez le capot à au moins 20 minutes de rayons UV avant de commencer le protocole. Pour commencer cette procédure, piquez trois à cinq millilitres de média DME complet dans chaque plaque.

Il sera divisé comme suit, un pour chaque cerveau de souris, deux pour tous les cortex et trois pour tous les cortex sans les méninges. Décapitez un chiot après l’avoir désinfecté avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision en partant de l’arrière de la tête vers le nez.

Retirez le crâne à l’aide d’une pince incurvée et grattez doucement le cervelet en exposant les cortex. Retirez les cerveaux exposés à l’aide d’une pince à épiler et placez le cerveau dans la première boîte de Pétri avec un support. Répétez ces étapes pour tous les autres chiots.

Séparez les hémisphères cérébraux en les divisant doucement le long de la fissure médiane avec l’extrémité pointue de la pince de micro-dissection. Pelez les cortex en enlevant la substance blanche et l’hippocampe à l’aide de la pince à épiler avec un mouvement de pincement, en les laissant derrière. Transférez les cortex de la peau dans la boîte de Pétri étiquetée numéro deux.

Répétez la procédure pour tous les cerveaux en combinant tous les cortex disséqués dans la boîte de Pétri. Secouez doucement le plat pour répartir uniformément le milieu entre tous les cortex. Utilisez le microscope de dissection pour identifier les méninges qui tapissent les cortex pelés.

Les méninges sont une couche transparente très mince qui peut être identifiée en recherchant les petits capillaires rouges entourant le tissu. Inspectez et retirez soigneusement les méninges qui tapissent les cortex et décollez-les doucement des lobes corticaux individuels à l’aide d’une pince à épiler fine des deux côtés de chaque cortex. Placez les cortex propres dans une nouvelle boîte de Pétri étiquetée numéro trois.

Pour la dissociation des tissus à l’aide de la méthode de l’estomac ou du mélangeur, versez les cortex propres et pelés et les milieux de la boîte de Pétri dans un sac mélangeur stérile. Et ajoutez suffisamment de support pour porter le volume total du sac à cinq millilitres. Placez le sac dans le stomacher 80 en laissant environ deux centimètres du sac visibles au-dessus de la porte fermée.

La dissociation cellulaire dans cet instrument se fait après 2,5 minutes à grande vitesse. Alternativement, la dissociation des tissus peut être effectuée en fermant le sac stérile et en martelant doucement le tissu avec un bécher dans le capuchon jusqu’à ce que les particules de tissu soient devenues une fine suspension. Assurez-vous d’utiliser un chiffon entre le sac et le bécher pour éviter les frottements et la casse du sac.

Versez la suspension cellulaire au centre du manchon avec un numéro de maille 60. Versez les cellules filtrées au milieu d’un maillage numéro 100 lui permettant de filtrer par gravité. Versez la suspension cellulaire filtrée dans un tube conique de 15 millilitres.

Fuge centrale, la suspension de la cellule à 200 fois G dans une fuge centrale, de préférence avec une défonceuse à godet pivotant pendant cinq minutes. Retirer le surnageant et le jeter dans un bécher. Ajoutez un nouveau média complet à la palette de cellules.

À l’aide d’une pipette sérologique, remettre en suspension et dissocier la palette de cellules dans un maximum de cinq millilitres de milieu. Ajouter la quantité désirée de suspension cellulaire dans un flacon et compléter avec le milieu. Ajouter la palette remise en suspension dans la fiole avec du médium.

Répartissez uniformément les cellules dans le ballon et placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. N’oubliez pas de changer de support tous les trois jours. La méthodologie suivante vise à priver les cellules d’oxygène et de glucose dans un environnement contrôlé.

Le but de ce modèle est d’étudier la réponse des astrocytes dans une condition d’AVC de type ischémique. Les matériaux utilisés pour cette procédure sont, Purger le milieu sans glucose en insérant une pipette sérologique connectée au système de gaz. Faites bouillonner la solution avec le mélange gazeux pendant 10 minutes à un débit de 10 à 15 litres par minute.

Une fois les 10 minutes écoulées, ajustez le pH du milieu OGD à 7,4. Filtrez le milieu purgé sans glucose à l’aide du système de filtration à tube de 50 millilitres. Il est important de toujours préparer un nouveau milieu OGD pour chaque expérience.

Cela garantira que le milieu est purgé de l’oxygène. Retirez les milieux astrocytaires et lavez-les deux fois avec du PBS cellulaire pour éliminer le glucose des cellules. Ajouter le milieu OGD dans les puits.

Placez le plat multi-puits avec le couvercle ouvert à l’intérieur de la chambre d’hypoxie. Connectez le mélange de gaz à la vanne d’entrée et laissez la vanne de sortie ouverte. Rincer la chambre avec le mélange gazeux à raison de 10 à 15 litres par minute, pendant cinq à sept minutes.

Arrêtez le flux de gaz et fermez d’abord le collier de la soupape de sortie. Ensuite, fermez le collier sur le tube de la vanne d’entrée de gaz. Placez la chambre hypoxique dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant le temps désiré dans d’autres ministères.

Une fois le temps d’incubation terminé, aspirez le milieu OGD et ajoutez soigneusement du DMEM complet aux cellules pour la condition normoxique. Retournez les cellules dans l’incubateur de culture pour zéro, 24 et 48 heures dans des conditions normoxiques. Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes à partir des cortex néonatals du rat.

Après avoir validé la pureté des cultures primaires, des expériences d’autres ministères ont été réalisées. Dans ce modèle de type ischémique, la privation de glucose et d’oxygène a induit un changement plus morphologique qui a été surveillé par l’immunofluorescence à l’aide de marqueurs astrocytaires tels que GFAP ou de marqueurs de prolifération tels que PCNA. L’un des avantages de ce modèle est qu’il nous permet d’étudier une réponse de type cellulaire spécifique.

Bien que la limitation de cette technique soit le manque d’interaction entre les cellules en raison de l’isolement des astrocytes. L’une des façons possibles de surmonter cette limitation est d’exposer les astrocytes à des milieux de conditionnement provenant d’autres types de cellules ou d’une co-culture. En résumé, la méthode de privation d’oxygène et de glucose dans un système cellulaire isolé, nous permet de tester directement les effets de différentes molécules neuronales protectrices ou neurotoxiques.

En outre, c’est un outil valable pour étudier la biologie des astrocytes. Enfin, ce modèle établit une base solide pour étudier les médicaments du développement dans des conditions expérimentales à l’aide de modèles in vivo.