Name: Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de loxygène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse des protéines de liaison à la coiffe 5' dans des cellules humaines exposées à l'hypoxie physiologique. Cette technique utilise un analogue m7GTP lié à l'agarose pour identifier de nouveaux facteurs régulés par l'oxygène impliqués dans la traduction cap-dépendante.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et le ministère de la Recherche et de l’Innovation de l’Ontario.

1. Préparatifs pour la culture cellulaire <ol><li> Achetez des stocks disponibles dans le commerce de cellules humaines. NOTE: Ce protocole utilise le carcinome HCT116 colorectal et des cellules primaires humaines rénaux proximaux tubulaires épithéliales (de HRPTEC). </li><li> Faire 500 ml de milieu pour la culture de cellules HCT116: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / moyenne élevée en glucose supplémenté avec 7,5% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S). </li><li> Faire 500 ml de milieu de culture de HRPTEC: milieu cellulaire épithéliale supplémenté avec 5% de FBS, supplément de croissance de cellules épithéliales de 1%, et 1% P / S. </li><li> Préparer 500 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM de KH 2 PO 4. Ajuster le pH à 7,4 et stériliser par autoclavage pendant 40 min à 121 ° C. </li></ol> 2. Ouverture de la cellule en culture <ol><li> Aspirer soigneusement le moyen d&#39;un plat de confluentes 80-90% sans déranger til cellules. </li><li> Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l&#39;opération pour un second lavage 1x PBS. </li><li> Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min. </li><li> Transférer les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger à 4000 g pendant 90 secondes. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de DMEM complet. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Calculez combien non pyrogènes et de polystyrène 100 mm culture cellulaire plats sont nécessaires pour obtenir une densité d&#39;ensemencement initiale d&#39;environ 2,500-5,000 cellules par cm 2. </li><li> milieu complet Préchauffer culture cellulaire fait dans les étapes 1.2 ou 1.3 dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30-45 min. </li><li> Décontaminer la bouteille moyenne et flacon de cellules avec 70% d&#39;éthanol. De ce point avant toutles opérations doivent être effectuées de manière aseptique. </li><li> Aliquote 6 ml de DMEM complet en autant de boîtes de culture cellulaire de 100 mm requis pour utiliser la totalité du volume de cellules congelées à l&#39;intérieur de la densité d&#39;ensemencement mentionnée à l&#39;étape 2.6. </li><li> Transférer le volume de la suspension cellulaire calculée à l&#39;étape 2.6 à chacune des boîtes de culture de 100 mm. Rock chaque plaque à la main pour répartir uniformément les cellules au-dessus de la surface de la plaque. </li><li> Placer la boîte de 100 mm ensemencé de culture de cellules dans l&#39;incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant les prochaines étapes. </li></ol> 3. Repiquage <ol><li> Afficher chaque boîte de culture de cellules sous un microscope pour déterminer le pourcentage de confluence cellulaire (% de cellules couvrant la zone de la cuvette). cellules à l&#39;incubateur et milieu de pré-chaud complet et 1x PBS Retour. Passez à l&#39;étape suivante si les cellules sont 80-100% confluentes. </li><li> Aspirer soigneusement le milieu usé sans perturber lecellules dans chaque boîte de culture. </li><li> Aliquotes 3-5 ml de PBS 1x par boîte de culture, roche doucement chaque flacon pour recouvrir la surface du plat, et soigneusement Aspirer le PBS 1x. Répétez l&#39;opération pour un second lavage 1x PBS. </li><li> Aliquoter 3 ml de 0,05% de trypsine-EDTA dans chaque boîte de culture et balancer doucement pour bien enrober les cellules avec de la trypsine-EDTA. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 min. </li><li> Au cours de cette incubation, la fraction aliquote de 10 ml de milieu complet en autant de boîtes de culture sont nécessaires pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2. </li><li> Lorsque les cellules ont détaché de la plaque, ajouter rapidement 3 ml d&#39;inhibiteur de trypsine 1x défini et agiter doucement le plat pendant 1 min pour assurer que tous les trypsine-EDTA a été neutralisé. </li><li> Transférer les cellules individuelles dans un 15 ml tube de centrifugation stérile et mettre de côté. Ajouter 3 ml de 1 x PBS à la boîte pour recueillir toutes les cellules restantes, et que le transfert à la même 15 ml tube de centrifugation. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 150 x gpendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de milieu complet. </li><li> Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et épépiner des boîtes de culture de 150 mm contenant 15 ml de milieu complet pour obtenir une densité cellulaire de 2,500-5,000 cellules par cm 2. Utilisez deux 150 mm pour chaque test de plafonnement contraignant. REMARQUE: la diffusion d&#39;oxygène vers les cellules par l&#39; intermédiaire des milieux liquides dépendent du volume 36. Il est recommandé de maintenir le volume des médias compatibles entre les expériences si les cellules adhérentes ou des cellules en suspension sont utilisés. Les médias peuvent être pré-conditionnés (incubé dans le poste de travail pendant 24 heures comme indiqué dans la discussion) afin d&#39;éviter ces variabilités de diffusion. </li><li> Placez les plats ensemencées-culture dans l&#39;incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de CO 2 de 5%. Laisser les cellules incuber au moins 24 heures avant de procéder aux étapes suivantes. </li></ol> 4. Physioxic exposition <ol><li> Afficher les cellules au microscope. Pour best les résultats, veiller à ce que les cellules sont 70-80% confluentes pour une exposition de 24 heures, 50-60% confluentes pour une exposition de 48 heures, et 40-50% confluentes pour une exposition de 72 h. </li><li> Placer les cellules dans une station de travail à l&#39;hypoxie pendant le temps désiré (24, 48 ou 72 heures en fonction de l&#39;expérience). </li><li> Réglez le poste de travail à l&#39;physioxia approprié. NOTE: Par exemple, un réglage de 3% O 2 serait accompagnée de 5% de CO 2 et 92% de N 2. NOTE: Si les fluctuations d&#39;oxygène dans une plage dynamique sont souhaités sur un calendrier précis, le programme du calendrier dans l&#39;instrument ou d&#39;ajuster manuellement les réglages d&#39;oxygène aux intervalles souhaités. </li><li> Régler le taux d&#39;humidité de 60%. L&#39;atmosphère du poste de travail est très sec néanmoins, et les médias sera sensiblement s&#39;évaporer pendant de longues expériences (&gt; 48 h). Gardez une réserve de médias dans un flacon de culture cellulaire à l&#39;intérieur du poste de travail (de sorte que le support est équilibré avec l&#39;atmosphère du poste de travail) pour reconstituer les médias dans le dis de culture cellulaireil est. REMARQUE: Toute solution qui va interagir avec les cellules avant la lyse (tel que du PBS et trypsine-EDTA) doivent être conditionnées pendant 24 h avant d&#39;être utilisé dans le poste de travail hypoxie de sorte que l&#39;oxygène dissous équilibre avec l&#39;oxygène de l&#39; air 36. </li><li> Gardez les cellules dans le poste de travail jusqu&#39;à ce que la lyse. </li></ol> 5. Tampons Préparation pour Assay Cap-contraignant <ol><li> Préparer 1x Tris-solution saline tamponnée (TBS). <ol><li> Dans 800 ml de dH 2 O, dissoudre 8,76 g de NaCl et 6,05 g de Tris base. </li><li> Amener la solution à un pH final de 7,4 avec 1 M de HCl. </li><li> Amener le volume final à 1 L en utilisant dH 2 O. </li></ol></li><li> Préparer un tampon de lyse non dénaturante. Préparer un tampon de lyse le jour du test de plafonnement contraignant. Faire un tampon de lyse supplémentaire pour laver les billes d&#39;agarose vierges et le GTP agarose γ-aminophényl-m 7 billes C10 liées (étapes 7.9 et 7.13). <ol><li> Dans 7 ml de dH 2 O, ajouter 160 pi 5 M NaCll, NaF 160 mM , 1 ul de Tris-HCl pH 7,4, 40 ul de 200, 40 pi de 1 M de MgCl2, et orthovanadate de sodium , 40 ul de 1 mM. </li><li> Ajouter 40 ul de la solution d&#39;Igepal à 7 ml. Coupez la pointe de la pipette pour aider à récupérer Igepal car il est extrêmement visqueux. </li><li> Mélanger par pipetage vers le haut et vers le bas, ou vortex, la solution de 7 ml jusqu&#39;à ce que tous les Igepal a été dissous. </li><li> Relevez le volume final de la solution à 8 ml et garder sur la glace. </li></ol></li><li> Préparer 4x dodécylsulfate de sodium (SDS) -PAGE Sample Buffer. <ol><li> Dans un bécher, mélanger 16 ml de 1 M de Tris-HCl, pH 6,8, 12,64 ml de glycerol, et 8 ml de dithiothréitol (DTT). </li><li> Ajouter 3,2 g de SDS et 0,16 g de bleu de bromophénol. Laisser la poudre à dissoudre entièrement par mélange avec un barreau d&#39;agitation magnétique. </li><li> Aliquoter dans 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Lyse cellulaire <ol><li> Préparer un tampon de lyse non dénaturant et garder sur la glace le jour de the cap-essai de liaison. </li><li> Préchauffer PBS 1x et de la trypsine dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Aliquoter 980 pi de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml pour chaque test de plafonnement de liaison étant effectuées. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;acide 4- (2-aminoéthyl) le chlorhydrate de fluorure de benzènesulfonyle et 10 ul d&#39;inhibiteur de protéase de cocktail 100x 980 ul de tampon de lyse. Gardez sur la glace. </li><li> Jeter les médias de chaque plat de 150 mm dans un conteneur de déchets à l&#39;intérieur du poste de travail de l&#39;hypoxie. </li><li> Laver les cellules avec 3-4 ml d&#39;eau tiède 1x PBS et jeter tout le liquide. </li><li> Ajouter 1 ml de chaud 0,05% de trypsine-EDTA à chaque plat et laisser reposer pendant 2 minutes ou jusqu&#39;à ce que les cellules ne sont plus respectées à la plaque. </li><li> En utilisant une pipette, transférer les cellules d&#39;une plaque à un tube de 1,5 ml. Répéter au besoin pour que chaque plaque de cellules est transféré dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse séparé. </li><li> Centrifuger les tubes de 1,5 ml de microcentrifugation à 6000 xg pendant 90 sec to sédimenter les cellules. </li><li> Aspirer la trypsine en utilisant une pipette sans perturber le culot. Si le culot est perturbé, re-centrifugeuse tube de microcentrifugation de 1,5 ml à 6000 xg pendant 90 sec. </li><li> Laver les cellules avec du PBS chaud 1x par pipetage 200 pi de PBS dans le tube juste au-dessus du culot. Re-centrifugeuse si le culot est perturbé. </li><li> Aspirer le PBS sans perturber le culot. </li><li> Introduire à la pipette 500 ul de la solution de 1 ml a préparé du tampon de lyse sur la première pastille cellulaire. Remettre en suspension le culot entièrement par pipetage vers le haut et vers le bas. </li><li> Combiner les cellules remises en suspension avec le deuxième culot cellulaire et remettre en suspension le culot seconde par pipetage vers le haut et vers le bas. Répétez ce processus jusqu&#39;à ce que tous les granulés ont été combinés et remis en suspension pour chaque échantillon. </li><li> Combinez le lysat avec les 500 ul restants de tampon de lyse dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Retirer les échantillons du poste de travail de l&#39;hypoxie. Remarque: après l&#39;addition du tampon de lyse, d&#39;unoutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans l&#39;air ambiant du poste de travail est réglé à une hypoxie 37 ° C et les étapes suivantes doivent être effectuées à froid (4 ° C ou sur de la glace). </li><li> Lyser les cellules en utilisant une agitation douce en faisant tourner les échantillons à 4 ° C pendant 1,5 à 2 heures. </li><li> Centrifuger les cellules lysées à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Transférer le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et jeter le culot. </li><li> Sous réserve d&#39;une partie (5-10%) du produit surnageant à utiliser comme toute une commande d&#39;entrée de lysat cellulaire pour une future analyse Western Blot. </li></ol> 7. Cap contraignant Assay <ol><li> Pour chaque échantillon, transférer 50 pl de suspension de l&#39;ébauche d&#39; agarose de commande de bourrelet et 50 ul de la suspension de billes γ-aminophényl-m- 7 GTP d&#39; agarose-C10 lié à séparer 1,5 ml microtubes. Utilisez des ciseaux pour enlever la pointe de la pipette pour faciliter la collecte de la suspension de billes. </li><li> Pellet les perles by centrifuger la suspension à 500 g pendant 30 secondes. </li><li> Retirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les billes dans 500 pi de TBS. </li><li> Répétez les étapes 7.2 et 7.3. Pellet les perles à 500 xg pendant 30 sec et retirer le surnageant. </li><li> Transférer le surnageant contenant le lysat de l&#39;étape 6.19 au tube de 1,5 ml contenant les billes blanches d&#39;agarose. REMARQUE: Les billes d&#39;agarose vides agissent comme une étape de pré-compensation pour éliminer les protéines du lysat, qui interagissent de manière non spécifique avec le bourrelet. </li><li> Incuber pendant 10 min à 4 ° C sous agitation douce. </li><li> Sédimenter les billes vides d&#39;agarose par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes. </li><li> Transférer le lysat au tube de 1,5 ml contenant les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées. </li><li> Laver les billes d&#39;agarose vides en remettant en suspension les billes dans 500 pl de tampon de lyse, pastillage les billes par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes, et à rejeter le supernatante. Répétez cette opération quatre fois pour un total de cinq lavages. </li><li> Resuspendre les billes d&#39;agarose vierges dans un tampon d&#39;échantillon 1x SDS-PAGE, et faire bouillir les billes pendant 90 secondes à 95 ° C. Conserver à -20 ° C pour une analyse future Western blot pour observer si la protéine d&#39;intérêt se lie non spécifiquement à la perle. </li><li> Incuber le lysat avec les perles γ-aminophényl-m 7 GTP agarose C10 liés avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C pour capturer protéines cap contraignant. </li><li> Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d&#39; agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes. Jeter le surnageant. </li><li> Laver les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 lié par étape 7.9 répéter. </li><li> Remettre en suspension les billes dans 600 pl de tampon de lyse. </li><li> Ajouter GTP à une concentration finale de 1 mM. </li><li> Incuber les γ-aminophényl-m 7 GTP agarose perles de C10 liées + 1 mM GTP avec agitation douce pendant 1 heure à 4 ° C. Note: Cettese dissocier des protéines qui interagissent de manière non spécifique avec m 7 GTP (ie, également interagir avec GTP non méthylé). </li><li> Sédimenter les γ-amino-phényl-7 m GTP des billes d&#39; agarose-C10 lié par centrifugation à 500 g pendant 30 secondes. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 200 pi de 4x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol, et 10% de glycérol). Conserver l&#39;échantillon de contrôle de GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37. Laver les billes par étape 7.9 répéter. </li><li> Resuspendre les billes dans 1 x tampon échantillon SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM DTT, 2% de SDS, 0,1% de bleu de bromophénol et 10% de glycerol) et faire bouillir à 95 ° C pendant 90 secondes. Rangez la m fraction 7 GTP à -20 ° C pour une future analyse western blot 37. </li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li>
<li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4+initiation+factors%3A+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li>
<li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li>
<li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90(2015).</li>
<li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li>
<li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li>
<li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cap+for+Every+Occasion%3A+Alternative+eIF4F+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li>
<li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li>
<li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li>
<li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li>
<li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+4EHP%2C+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li>
<li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li>
<li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li>
<li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m%287%29GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li>
<li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li>
<li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li>
<li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li>
<li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li>
<li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+translational+control%3A+inhibition+via+5%27-3%27+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li>
<li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li>
<li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li>
<li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li>
<li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li>
<li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation%3A+the+impact+of+ambient+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li>
<li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394(2002).</li>
<li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleadle%2C+J+%22Hypoxia%22">Hypoxia</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).</li>
<li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi%27s+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li>
<li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li>
<li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium%3A+assumptions+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1%3A+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li>
<li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+%28eIF4G%29+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li>
<li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+structure%2C+mechanism%2C+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li>
<li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li>
<li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;analyse des protéines cap de liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques d&#39;oxygène peut permettre l&#39;identification de nouveaux facteurs initiation de la traduction de l&#39;oxygène réglementé. L&#39;affinité de ces facteurs pour le coiffe 5 &#39;d&#39;ARNm ou d&#39; autres protéines cap-associé peut être mesurée par la force de leur association à m 7 GTP lié perles Agarose. Une limitation de cette technique est qu&#39;elle mesure le potentiel de la coiffe liaison ...

Contrôle translationnelle émerge comme une étape tout aussi important de la régulation transcriptionnelle de l&#39;expression génique, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire 1. Un point central de contrôle de la traduction est à l&#39;étape de limitation de vitesse d&#39;initiation où les premières étapes de la synthèse des protéines impliquent la liaison de la facteur d&#39;initiation eucaryote 4E (eIF4E) à la 7-méthylguanosine (m 7 GTP) coiffe 5 &#39;des ARNm 2 . eIF4E fait partie d&#39;un complexe trimère nommé eIF4F qui comprend eIF4A, un ARN hélicase et eIF4G, une protéine d&#39;échafaudage nécessaire pour le recrutement d&#39;autres facteurs de traduction et les 40S ribosome 3. Dans des conditions physiologiques normales, la grande majorité des ARNm sont traduits par un mécanisme de cap-dépendante, mais sous des périodes de stress cellulaire environ 10% des ARNm humains contiennent 5 &#39;UTR qui pourraient permettre la traduction cap-indépendante intiation 1,4. Traduction de Cap-dépendante a été synonyme historiquementous avec eIF4F, cependant, des variations spécifiques au stress de eIF4F sont devenus un sujet tendance 5-8. Diverses contraintes cellulaires provoquent l&#39;activité eIF4E à être réprimée par la cible mammalienne de la rapamycine complexe 1 (mTORC1). Cette kinase devient douteux sous contrainte, ce qui se traduit par l&#39;augmentation de l&#39;activité de l&#39;un de ses objectifs, la protéine 4E-liaison (4E-BP). Non-phosphorylée 4E-BP se lie à eIF4E et bloque sa capacité à interagir avec eIF4G provoquant la répression de la traduction cap-dépendante 9,10. Fait intéressant, un homologue de eIF4E nommé eIF4E2 (ou 4EHP) a une affinité beaucoup plus faible pour les 4E-BP 11, peut - être ce qui lui permet d&#39;échapper au stress médiée par la répression. En effet, tout d&#39; abord caractérisé comme répresseur de la traduction en raison de son manque d&#39;interaction avec eIF4G 12, eIF4E2 initie la traduction de centaines d&#39;ARNm qui contiennent des éléments de réponse à l&#39;hypoxie d&#39;ARN dans les 3 &#39;UTR lors d&#39;un stress hypoxique 6,13. Cette i d&#39;activations obtenus par des interactions avec eIF4G3, l&#39; ARN de liaison aux protéines motif 4 et le facteur inductible par l&#39;hypoxie (HIF) , 2α pour constituer un complexe eIF4F hypoxique ou eIF4F H 6,13. En tant que répresseur dans des conditions normales, eIF4E2 se lie avec GIGYF2 et 14 ZNF598. Ces complexes ont été, en partie, identifiés par m 7 résines GTP d&#39;affinité Agarose liés. Cette méthode classique 15 est standard dans le domaine de la traduction et les dosages meilleur et le plus couramment utilisé la technique pour isoler les complexes de plafonnement contraignant pull down et in vitro de liaison 16-19. Comme le mécanisme de traduction cap-dépendante est en train de devenir flexible et adaptable avec des parties inter-changer 6-8,13, cette méthode est un outil puissant pour identifier rapidement de nouvelles protéines cap de liaison impliqués dans la réponse au stress. Par ailleurs, les variations de eIF4F pourraient avoir de vastes répercussions que plusieurs systèmes modèles eucaryotes semblent utiliser un homologue eIF4E2 pour les réponses de stress tellescomme A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, et C. elegans 23. Les preuves suggèrent que les variations de eIF4F peuvent ne pas être strictement limitées aux conditions de stress, mais être impliqués dans la physiologie normale 24. L&#39;apport d&#39;oxygène aux tissus (au niveau des extrémités des capillaires) ou dans les tissus (mesurée par microélectrodes) varie de 2 à 6% dans le cerveau 25, 3-12% dans les poumons 26, 3,5-6% dans l&#39;intestin 27, 4% le foie 28, 7-12% dans le rein 29, 4% dans le muscle 30, et 6-7% dans la moelle osseuse 31. Les cellules et les mitochondries contiennent moins de 1,3% d&#39; oxygène 32. Ces valeurs sont beaucoup plus proches de l&#39;hypoxie que l&#39;air ambiant où les cellules sont cultivées en routine. Cela donne à penser que ce qui était auparavant considéré comme des processus cellulaires spécifiques à l&#39;hypoxie peuvent être pertinents dans un contexte physiologique. Il est intéressant de eIF4F et eIF4F H </sup&gt; participer activement à l&#39;initiation de la traduction des piscines ou des classes d&#39;ARNm distincts dans plusieurs lignées cellulaires humaines différentes exposées à l&#39; oxygène physiologique ou &quot;physioxia&quot; 24. Le manque d&#39; oxygène entraîne également le développement du fœtus 33 et les cellules ont généralement des taux plus élevés de prolifération, plus la durée de vie, moins de dommages de l&#39; ADN et moins les réactions de stress général dans physioxia 34. Par conséquent, eIF4F H est probablement un facteur clé dans l&#39;expression de certains gènes dans des conditions physiologiques. Ici, nous fournissons un protocole aux cellules de culture dans des conditions d&#39;oxygène physiologiques fixes ou dans une gamme fluctuant dynamique qui est probablement plus représentatif de microenvironnements tissulaires. Un avantage de cette méthode est que les cellules sont lysées à l&#39;intérieur du poste de travail de l&#39;hypoxie. Il est pas souvent clairement comment la transition de la culture de cellules hypoxiques à la lyse cellulaire est effectuée dans d&#39;autres protocoles. Les cellules sont souvent d&#39;abord retirés d&#39;un petit incubateur d&#39;hypoxie êtreavant la lyse, mais cette exposition à l&#39; oxygène pourrait affecter les voies biochimiques comme la réponse cellulaire à l&#39; oxygène est rapide (une ou deux minutes) 35. Certaines protéines cap de liaison exigent des interactions avec une seconde base ou peuvent hydrolyser le m 7 GTP, donc certains interacteurs cap peuvent manquer dans le processus de purification. Agarose liée aux analogues de cap enzymatiquement résistant peut être substitué dans ce protocole. Exploration de l&#39;activité et la composition des eIF4F H et d&#39; autres variations de eIF4F par la méthode décrite ici va faire la lumière sur les gènes machineries d&#39;expression complexes que les cellules utilisent dans des conditions physiologiques ou des réactions de stress.

<table><tbody><tr><td>&gamma ;-aminophényl-m7GTP Agarose C10 billes liées Jena</td><td>Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose liée m7GTP</td></tr><tr><td>Antenne de culture</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm Boîte de culture 150</td></tr><tr><td>mm</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm Boîte de</td></tr><tr><td>culture AEBSF</td><td>Chlorhydrate ACROS Organics</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Perles d’agarose</td><td>Jena Bioscience&nbsp ;</td><td>AC-0015</td><td>Contrôle des billes d’agarose</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Composant du tampon de chargement SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubes à centrifuger</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Utilisé pour centrifuger de petits volumes</td></tr><tr><td>15 ml Tubes à centrifuger coniques</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Utilisé dans la culture de cellules primaires</td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine défini</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Milieu cellulaire épithélial (kit complet)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Comprend des suppléments de sérum et de facteurs de croissance)</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Composant du tampon de chargement SDS-PAGE</td></tr><tr><td>100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 carcinome colorectal</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Lignée cellulaire cancéreuse humaine</td></tr><tr><td>Cellules épithéliales tubulaires proximales rénales humaines</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Milieux standard pour la culture cellulaire humaine</td></tr><tr><td>Solution de pénicilline-streptomycine</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Composant antibiotique du DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Poste de travail pour l’hypoxie</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Composant détergent du tampon de lyse</td></tr><tr><td>Phosphate monopotassique</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (composant inhibiteur de la phosphatase du tampon de lyse)</td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Premium Sérum de veau fœtal</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase (100x)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>58715</td><td>Composant du tampon de lyse</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Composant des tampons</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Trypsine utilisée pour détacher les cellules adhérentes</td></tr></tbody></table>

analyse des protéines cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Le contrôle traductionnel est un point central de la régulation des gènes, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire. La traduction dépendante de la coiffe via le complexe eIF4F est de loin la voie la plus courante pour initier la synthèse des protéines dans les cellules eucaryotes, mais des variations spécifiques au stress de ce complexe émergent maintenant. La purification des protéines de liaison à la coiffe avec une résine d’affinité composée de m7GTP liée à l’agarose (un analogue de la coiffe de l’ARNm 5') est un outil utile pour identifier les facteurs impliqués dans la régulation de l’initiation de la traduction. L’hypoxie (faible teneur en oxygène) est un stress cellulaire rencontré au cours du développement fœtal et de la progression tumorale, et dépend fortement de la régulation de la traduction. De plus, il a été récemment rapporté que les organes adultes humains ont une teneur en oxygène plus faible (physioxie 1-9 % d’oxygène) qui est plus proche de l’hypoxie que l’air ambiant où les cellules sont régulièrement cultivées. Avec la caractérisation en cours d’un complexe hypoxique eIF4F (eIF4FH), on s’intéresse de plus en plus à la compréhension de l’initiation de la traduction dépendante de l’oxygène par le biais de la coiffe de l’ARNm 5'. Nous avons récemment mis au point une méthode de culture de cellules humaines pour analyser les protéines de liaison à la coiffe qui sont régulées par la disponibilité de l’oxygène. Ce protocole met l’accent sur la culture cellulaire et la lyse dans un poste de travail d’hypoxie afin d’éliminer l’exposition à l’oxygène. Les cellules doivent être incubées pendant au moins 24 heures pour que le milieu liquide s’équilibre avec l’atmosphère du poste de travail. Pour éviter cette limitation, des milieux préconditionnés (désoxygénés) peuvent être ajoutés aux cellules si des points temporels plus courts sont nécessaires. Certaines protéines de liaison à la coiffe nécessitent des interactions avec une deuxième base ou peuvent hydrolyser le GTP m7, par conséquent, certains interacteurs de la coiffe peuvent être manqués dans le processus de purification. Des analogues de chapeau liés à l’agarose peuvent être substitués dans ce protocole. Cette méthode permet à l’utilisateur d’identifier de nouveaux facteurs de traduction régulés par l’oxygène impliqués dans la traduction dépendante de la coiffe.

Analyse de capacité Cap-contraignant en réponse à l&#39; oxygène de eIF4E et eIF4E2 dans un m 7 GTP Affinity Colonne Les figures 1 et 2 représentent western blots de type m 7 GTP purification par affinité de deux protéines majeures de plafonnement contraignant en réponse aux fluctuations de l&#39; oxygène dans les deux lignées de cellules humaines: cellules primaires humaine...

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules humaines pour analyser les facteurs d’initiation de la traduction qui se lient à la coiffe 5' de l’ARNm dans des conditions physiologiques d’oxygène. Cette méthode utilise un analogue du chapeau m7GTP lié à l’agarose et convient pour étudier les facteurs de liaison au chapeau et leurs partenaires en interaction.

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

L’objectif global de cette expérience est de capturer des protéines de liaison à la coiffe dans des conditions de faible teneur en oxygène. Cette méthode utilise un analogue de sept calottes méthyl-guanosine lié à l’agarose pour étudier les facteurs de liaison à la coiffe et leurs partenaires en interaction. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés dans le domaine de la synthèse des protéines, telles que l’identification de nouveaux facteurs régulés par l’oxygène impliqués dans la traduction dépendante de la coiffe.Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont maintenues dans un poste de travail d’hypoxie jusqu’au point de lyse. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer, car les cellules cancéreuses d’une tumeur sont exposées à de très faibles niveaux d’oxygène et le contrôle translationnel joue un rôle clé dans la progression de la tumeur. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons lu une publication récente des collègues de Corona indiquant que l’oxygénation des tissus est en fait plus proche de ce que nous appelons l’hypoxie plutôt que de la normaxie dans laquelle les cellules sont régulièrement cultivées.Commencez cette procédure de culture cellulaire comme décrit dans le protocole de texte. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, nourrissez des boîtes de culture de 150 millimètres contenant 15 millilitres de milieu complet pour obtenir une densité cellulaire de 2500 à 5000 cellules par centimètre carré. Utilisez deux boîtes de 150 millimètres pour chaque test de liaison du bouchon.Placez les boîtes de culture ensemencées dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et dans une atmosphère de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Une fois que les cellules ont incubé au moins 24 heures, placez-les dans un poste de travail d’hypoxie pendant la durée souhaitée. Ensuite, réglez le poste de travail sur la physioxie appropriée.Préchauffez une solution saline tamponnée au phosphate X, ou PBS, et de la trypsine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Aliquote 980 microlitres de tampon de lyse dans un tube à centrifuger de 1,5 microlitre pour chaque essai de liaison de capuchon effectué. 10 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase 100X et 10 microlitres d’hydrochlorure de fluorure de 4-benzènesulfonyle pour les 980 microlitres de tampon de lyse sur glace.Jetez le support de chaque parabole de 150 millimètres dans un conteneur à déchets à l’intérieur du poste de travail d’hypoxie. Ensuite, lavez les cellules avec trois à quatre millilitres d’un X PBS chaud et jetez le liquide. Ajoutez un millilitre de trypsine EDTA tiède à 05 % dans chaque plat et laissez reposer les plats pendant deux minutes ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la plaque.À l’aide d’une pipette, transférez les cellules d’une plaque dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Répétez l’opération au besoin afin que chaque plaque de cellules soit transférée dans un tube de micro-centrifugeuse séparé de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes de micro-centrifugeuse à 6000 fois g pendant 90 secondes pour granuler les cellules.Après la centrifugation, aspirer la trypsine à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille. Lavez les cellules avec un X PBS chaud en pipetant doucement 200 microlitres de PBS dans le tube juste au-dessus de la pastille. Aspirez ensuite le PBS sans déranger la pastille.Ensuite, pipetez 500 microlitres de la solution tampon de lyse préparée d’un millilitre sur la première pastille cellulaire. Remettez entièrement la pastille en suspension en le pipetant de haut en bas. Combinez les cellules remises en suspension avec la deuxième pastille de cellule et remettez la deuxième pastille en suspension en pipetant de haut en bas.Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les pastilles aient été combinées et remises en suspension pour chaque échantillon. Ensuite, combinez le lysat avec les 500 microlitres restants de tampon de lyse dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 litre. Retirez les échantillons du poste de travail d’hypoxie.Lysez les cellules en utilisant une agitation douce en faisant pivoter les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 1,5 à deux heures. Après l’incubation, centrifugez les cellules lysées à 1200 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Transférez le lysat dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et jetez la pastille.Réserver une partie du surnageant à utiliser comme témoin d’entrée de lysat de cellules entières pour l’analyse par transfert Western. Pour préparer le test de liaison du bouchon, utilisez des ciseaux pour retirer l’extrémité de la pipette afin de faciliter le recueil de la boue de billes. Pour chaque transfert d’échantillon, 50 microlitres de boue de contrôle des billes d’agarose vierge et 50 microlitres de boue de billes d’agarose C10 m7GTP pour séparer les tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.Ensuite, granulez les billes en centrifugeant la boue à 500 fois g pendant 30 secondes. Retirez le surnageant avec précaution et remettez les billes en suspension dans 500 microlitres de TBS. Après avoir répété ces étapes, granulez les billes à 500 fois g pendant 30 secondes et retirez le surnageant.Ensuite, transférez le surnageant contenant le lysat dans le tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant les billes d’agarose vierges. Incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius en agitant doucement. Après 10 minutes, granulez les billes d’agarose vierges en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes.Après la centrifugation, transférez le lysat qui ne se lie pas aux billes dans le tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant les billes liées à l’agarose m7GTP liée au C10. Lavez les billes d’agarose vierges en les remettant en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse, en granulant les billes en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes et en jetant le surnageant. Répétez cette opération quatre fois pour un total de cinq lavages.Suspendez à nouveau les billes d’agarose vierges dans un tampon d’échantillonnage X SDS-PAGE. Et faites bouillir les perles pendant 90 secondes à 95 degrés Celsius. Conservez l’échantillon à 20 degrés Celsius pour une analyse future par transfert Western afin d’observer les conditions météorologiques : la protéine d’intérêt se lie de manière non spécifique à la bille.Incuber le lysat avec les billes liées à l’agarose m7GTP liées au C10 avec une légère agitation pendant une heure à quatre degrés Celsius pour capturer les protéines de liaison de la coiffe. Après agitation, granuler les billes liées au C10 de l’agarose m7GTP par centrifugation à 500 fois g pendant 30 secondes. Après avoir jeté le surnageant, lavez les perles liées au C10 de l’agarose m7GTP comme précédemment.Remettez les billes en suspension dans 600 microlitres de tampon de lyse et ajoutez du GTP à une concentration finale d’un millimolaire. Incuber les billes d’agarose m7GTP liées au C10 plus une GTP millimolaire avec une agitation douce pendant une heure à quatre degrés Celsius. Cela dissociera les protéines qui interagissent de manière non spécifique avec m7GTP.Granulez les billes liées au C10 de l’agarose m7GTP en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 200 microlitres de quatre tampons d’échantillonnage X SDS-PAGE. Après avoir lavé les billes comme précédemment, remettez les billes en suspension dans un tampon d’échantillonnage X SDS-PAGE et faites-les bouillir à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes.On voit ici des transferts Western représentatifs d’une purification d’affinité typique de m7GTP de deux protéines majeures de liaison à la coiffe en réponse aux fluctuations d’oxygène dans les cellules épithéliales primaires du tubule proximal rénal humain. Les lysats cellulaires ont été exposés à 8 %, 5 %, 3 % ou 1 % d’oxygène pendant 24 heures. Les voies comprennent 10 % du lysat cellulaire entier en entrée, un lavage GTP pour mesurer la spécificité de m7GTP et les protéines liées aux billes de m7GTP après le lavage GTP.Les données d’au moins trois expériences indépendantes ont été quantifiées par l’image J et exprimées en unités de densité relative par rapport à 10 % d’entrée du lysat de la cellule entière. Les résultats indiquent que les cellules humaines cultivées sous oxygène physiologique utilisent deux protéines de liaison à la coiffe pour recruter des ARNm distincts pour la traduction. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de capturer les protéines de liaison à la coiffe dans des conditions de faible teneur en oxygène.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules dans le poste de travail de l’hypoxie jusqu’au point de lyse, car l’oxygène peut rapidement modifier les propriétés biochimiques de ces facteurs d’initiation de la traduction. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le fractionnement des polysomes, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que les protéines de liaison à la coiffe associées à la traduction active dans des conditions de faible teneur en oxygène.

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Préparation des fibres perméabilisées saponine en conjonction avec l'analyse de phosphorylation oxydative respirométriques fournit une évaluation intégrative de la fonction mitochondriale. Respiration mitochondriale dans les états physiologiques et pathologiques peuvent refléter diverses influences réglementaires, y compris les interactions des mitochondries, la morphologie et la biochimie.

Respirométriques évaluation phosphorylation oxydative dans la saponine perméabilisées fibres cardiaques

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