Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l'oxygène

L’objectif global de cette expérience est de capturer des protéines de liaison à la coiffe dans des conditions de faible teneur en oxygène. Cette méthode utilise un analogue de sept calottes méthyl-guanosine lié à l’agarose pour étudier les facteurs de liaison à la coiffe et leurs partenaires en interaction. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés dans le domaine de la synthèse des protéines, telles que l’identification de nouveaux facteurs régulés par l’oxygène impliqués dans la traduction dépendante de la coiffe.

Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont maintenues dans un poste de travail d’hypoxie jusqu’au point de lyse. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du cancer, car les cellules cancéreuses d’une tumeur sont exposées à de très faibles niveaux d’oxygène et le contrôle translationnel joue un rôle clé dans la progression de la tumeur. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons lu une publication récente des collègues de Corona indiquant que l’oxygénation des tissus est en fait plus proche de ce que nous appelons l’hypoxie plutôt que de la normaxie dans laquelle les cellules sont régulièrement cultivées.

Commencez cette procédure de culture cellulaire comme décrit dans le protocole de texte. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, nourrissez des boîtes de culture de 150 millimètres contenant 15 millilitres de milieu complet pour obtenir une densité cellulaire de 2500 à 5000 cellules par centimètre carré. Utilisez deux boîtes de 150 millimètres pour chaque test de liaison du bouchon.

Placez les boîtes de culture ensemencées dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et dans une atmosphère de dioxyde de carbone de cinq pour cent. Une fois que les cellules ont incubé au moins 24 heures, placez-les dans un poste de travail d’hypoxie pendant la durée souhaitée. Ensuite, réglez le poste de travail sur la physioxie appropriée.

Préchauffez une solution saline tamponnée au phosphate X, ou PBS, et de la trypsine dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Aliquote 980 microlitres de tampon de lyse dans un tube à centrifuger de 1,5 microlitre pour chaque essai de liaison de capuchon effectué. 10 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase 100X et 10 microlitres d’hydrochlorure de fluorure de 4-benzènesulfonyle pour les 980 microlitres de tampon de lyse sur glace.

Jetez le support de chaque parabole de 150 millimètres dans un conteneur à déchets à l’intérieur du poste de travail d’hypoxie. Ensuite, lavez les cellules avec trois à quatre millilitres d’un X PBS chaud et jetez le liquide. Ajoutez un millilitre de trypsine EDTA tiède à 05 % dans chaque plat et laissez reposer les plats pendant deux minutes ou jusqu’à ce que les cellules n’adhèrent plus à la plaque.

À l’aide d’une pipette, transférez les cellules d’une plaque dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Répétez l’opération au besoin afin que chaque plaque de cellules soit transférée dans un tube de micro-centrifugeuse séparé de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes de micro-centrifugeuse à 6000 fois g pendant 90 secondes pour granuler les cellules.

Après la centrifugation, aspirer la trypsine à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille. Lavez les cellules avec un X PBS chaud en pipetant doucement 200 microlitres de PBS dans le tube juste au-dessus de la pastille. Aspirez ensuite le PBS sans déranger la pastille.

Ensuite, pipetez 500 microlitres de la solution tampon de lyse préparée d’un millilitre sur la première pastille cellulaire. Remettez entièrement la pastille en suspension en le pipetant de haut en bas. Combinez les cellules remises en suspension avec la deuxième pastille de cellule et remettez la deuxième pastille en suspension en pipetant de haut en bas.

Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les pastilles aient été combinées et remises en suspension pour chaque échantillon. Ensuite, combinez le lysat avec les 500 microlitres restants de tampon de lyse dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 litre. Retirez les échantillons du poste de travail d’hypoxie.

Lysez les cellules en utilisant une agitation douce en faisant pivoter les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 1,5 à deux heures. Après l’incubation, centrifugez les cellules lysées à 1200 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Transférez le lysat dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et jetez la pastille.

Réserver une partie du surnageant à utiliser comme témoin d’entrée de lysat de cellules entières pour l’analyse par transfert Western. Pour préparer le test de liaison du bouchon, utilisez des ciseaux pour retirer l’extrémité de la pipette afin de faciliter le recueil de la boue de billes. Pour chaque transfert d’échantillon, 50 microlitres de boue de contrôle des billes d’agarose vierge et 50 microlitres de boue de billes d’agarose C10 m7GTP pour séparer les tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Ensuite, granulez les billes en centrifugeant la boue à 500 fois g pendant 30 secondes. Retirez le surnageant avec précaution et remettez les billes en suspension dans 500 microlitres de TBS. Après avoir répété ces étapes, granulez les billes à 500 fois g pendant 30 secondes et retirez le surnageant.

Ensuite, transférez le surnageant contenant le lysat dans le tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant les billes d’agarose vierges. Incuber pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius en agitant doucement. Après 10 minutes, granulez les billes d’agarose vierges en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes.

Après la centrifugation, transférez le lysat qui ne se lie pas aux billes dans le tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant les billes liées à l’agarose m7GTP liée au C10. Lavez les billes d’agarose vierges en les remettant en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse, en granulant les billes en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes et en jetant le surnageant. Répétez cette opération quatre fois pour un total de cinq lavages.

Suspendez à nouveau les billes d’agarose vierges dans un tampon d’échantillonnage X SDS-PAGE. Et faites bouillir les perles pendant 90 secondes à 95 degrés Celsius. Conservez l’échantillon à 20 degrés Celsius pour une analyse future par transfert Western afin d’observer les conditions météorologiques : la protéine d’intérêt se lie de manière non spécifique à la bille.

Incuber le lysat avec les billes liées à l’agarose m7GTP liées au C10 avec une légère agitation pendant une heure à quatre degrés Celsius pour capturer les protéines de liaison de la coiffe. Après agitation, granuler les billes liées au C10 de l’agarose m7GTP par centrifugation à 500 fois g pendant 30 secondes. Après avoir jeté le surnageant, lavez les perles liées au C10 de l’agarose m7GTP comme précédemment.

Remettez les billes en suspension dans 600 microlitres de tampon de lyse et ajoutez du GTP à une concentration finale d’un millimolaire. Incuber les billes d’agarose m7GTP liées au C10 plus une GTP millimolaire avec une agitation douce pendant une heure à quatre degrés Celsius. Cela dissociera les protéines qui interagissent de manière non spécifique avec m7GTP.

Granulez les billes liées au C10 de l’agarose m7GTP en les centrifugant à 500 fois g pendant 30 secondes. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 200 microlitres de quatre tampons d’échantillonnage X SDS-PAGE. Après avoir lavé les billes comme précédemment, remettez les billes en suspension dans un tampon d’échantillonnage X SDS-PAGE et faites-les bouillir à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes.

On voit ici des transferts Western représentatifs d’une purification d’affinité typique de m7GTP de deux protéines majeures de liaison à la coiffe en réponse aux fluctuations d’oxygène dans les cellules épithéliales primaires du tubule proximal rénal humain. Les lysats cellulaires ont été exposés à 8 %, 5 %, 3 % ou 1 % d’oxygène pendant 24 heures. Les voies comprennent 10 % du lysat cellulaire entier en entrée, un lavage GTP pour mesurer la spécificité de m7GTP et les protéines liées aux billes de m7GTP après le lavage GTP.

Les données d’au moins trois expériences indépendantes ont été quantifiées par l’image J et exprimées en unités de densité relative par rapport à 10 % d’entrée du lysat de la cellule entière. Les résultats indiquent que les cellules humaines cultivées sous oxygène physiologique utilisent deux protéines de liaison à la coiffe pour recruter des ARNm distincts pour la traduction. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de capturer les protéines de liaison à la coiffe dans des conditions de faible teneur en oxygène.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les cellules dans le poste de travail de l’hypoxie jusqu’au point de lyse, car l’oxygène peut rapidement modifier les propriétés biochimiques de ces facteurs d’initiation de la traduction. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le fractionnement des polysomes, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que les protéines de liaison à la coiffe associées à la traduction active dans des conditions de faible teneur en oxygène.